B36-04通过含胶粘红酵母环氧化物水解酶的重组巴斯德毕赤酵母生产S-氧化苯乙烯Lee EY等Enzyme MicrobTechnol

构建了一株携带来源于胶粘红酵母的编码环氧化物水解酶(EH)基因的重组巴斯德毕赤酵母，可以对一些苯乙烯氧化物的外消旋混合物对映体选择性水解以生产Ｓ－氧化苯乙烯。EH基因是通过对胶粘红酵母的ＣDNA文库的PCR扩增获得的，并整合到巴斯德毕赤酵母的染色体DNA上，在AOX启动子的调控下表达EH。     

影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达的因素

巴斯德毕赤酶母表达系统是广泛使用的真核表达系统,但有些蛋白在该系统中表达量低,甚至不表达。本文从外源基因的内部结构、宿主菌、信号肽、转化子的拷贝数和发酵条件五个方面综述影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达的因素。     

人胰岛素生长因子-1基因在毕赤酵母中的表达

研究人胰岛素生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中的表达.用聚合酶链反应法(PCR)和基因重组技术构建重组人胰岛素生长因子毕赤酵母表达载体并在毕赤酵母中进行表达.SDS-PAGE分析和质谱测定产物分子量7.6kD和理论值相同.人胰岛素生长因子在毕赤酵母的分泌表达为今后的研究打下基础.     

巴斯德毕赤酵母启动子研究进展

目前,巴斯德毕赤酵母表达系统是非常成功的外源蛋白表达系统之一,其启动子的开发和利用也备受关注.醇氧化酶1启动子(alcohol oxidase 1 promoter,PAOX1)在巴斯德毕赤酵母中应用最为广泛.鉴于外源蛋白表达的需要,不断有启动子被发现和利用,如三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter,PGAP)、甲醛脱氢酶1启动子(formaldehyde dehydrogenase 1 promoter,PFLD1)等.此文列举了多种巴斯德毕赤酵母启动子,并对启动子的来源、特点以及外源蛋白的表达等方面进行综述,以期为启动子的选择提供参考.     

巴斯德毕赤酵母表达系统

巴斯德毕赤酵母表达系统在DNA重组技术中得到越来越广泛的应用。该酵母具有独特的生物学特性，作为真核表达系统，具有严格调控外源蛋白的表达，加工修饰表达产物，表达量高，营养要求低等优点；在该表达系统中，主要有3种表达宿主菌，其载体包括整合型载体和自我复制型游离载体，其转化和表达比大肠埃希氏菌系统复杂；巴斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外，从而获得较高表达量和利于表达产物的分离纯化。     

巴斯德毕赤酵母真核蛋白表达系统的研究进展

自 1 98 1年 hitzeman等 [1 ] 首次在酿酒酵母中表达了人重组干扰素基因后 ,相继又有多种外源基因表达成功。但是常规的酿酒酵母表达系统由于发酵密度不高 ,蛋白分泌能力较差 ,糖基化修饰过度可能会引起副反应等 ,近年来已被新的酵母宿主细胞所取代 ,如巴斯德毕赤酵母、乳酸克鲁维亚酵母、粟酒裂殖糖酵母、烷烃利用型耶鲁酵母、西方许旺氏酵母和多形汉逊酵母等 ,合称非常规酵母表达系统。它们往往具有营养要求简单、生长旺盛、生物量大、温度适应范围广 (2 5℃～ 4 6℃ )、蛋白质分泌能力强等特点 ,正好补充了酿酒酵母的不足。其中的巴斯德…     

Exendin-4真核表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建Exendin-4基因真核表达载体,并在巴斯德毕赤酵母GS115中进行表达,为大量获得Exendin-4奠定基础。方法:采用重叠聚合酶链反应法扩增出Exendin-4的完整序列,将其亚克隆到表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K-Exendin-4。重组质粒经SacI线性化后用电穿孔法导入到GS115中,经组氨酸缺陷筛选、G418高拷贝筛选及摇瓶表达筛选,甲醇诱导表达后用凝胶电泳法分析Exendin-4的表达。结果:序列测定结果表明成功地构建了毕赤酵母表达载体,电泳结果证明Exendin-4在毕赤酵母中能高效表达。结论:实现了Exendin-4单体在毕赤酵母中的表达,为Exendin-4的规模化生产奠定了基础。     

人骨唾液酸蛋白酵母工程细胞的构建与表达

目的构建表达重组人骨唾液酸蛋白 (rhBSP)的巴斯德毕赤酵母工程细胞 ,实现rhBSP的酵母胞外分泌性高表达。方法通过PCR扩增获得人BSP基因后 ,构建重组表达载体pPICZaA hbsp ,经电转化导入到毕赤酵母GS115菌中 ,获得GS115 pPICZaA hbsp工程菌 ,通过Zeocin高抗性筛选和摇瓶发酵筛选出高表达rhBSP的菌株 ,并进行高密度发酵提高表达量。结果rhBSP分子量接近 6 6 0 0 0 ,产物可达上清液总蛋白的 80 % ,浓度约 0 .2 4 8g L。结论基因工程菌GS115 pPICZaA hbsp能高效地表达rhBSP并分泌到胞外     

多拷贝水蛭素基因在毕赤酵母中的分泌型表达

目的:通过多拷贝克隆技术实现水蛭素(Hirudin)基因在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达.方法:利用基因重组技术,从pPIC9-Hirudin中扩增α-facor-Hirudin插入到载体pA0815中,并构建pA0815-(α-Hirudin)n多拷贝重组质粒,转化毕赤酵母GS115后进行诱导表达,并鉴定表达产物活性.结果:PCR证实成功构建了水蛭素多拷贝毕赤酵母表达载体pA0815-(α-Hirudin)n,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳证实能成功高效分泌重组水蛭素,活性测定表明表达的水蛭素有良好的抗凝血活性.结论:成功构建了分泌型水蛭素多拷贝质粒,筛选出多拷贝稳定整合表达菌株,成功表达出具有抗凝血活性的1 600 ATU/mL重组水蛭素,为大规模表达纯化水蛭素蛋白及其临床应用奠定了基础.     

葡激酶在毕赤酵母中的表达及纯化

目的探索葡激酶基因在毕赤酵母中的表达和纯化方法。方法根据毕赤酵母的偏性合成了葡激酶基因,克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,重组载体线性化后,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。应用DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和Sephacry1 S-200凝胶过滤层析法纯化表达产物,采用溶圈法对纯化产物进行生物学活性测定。结果葡激酶在毕赤酵母中GS115的表达量约站总蛋白的45%;表达产物经DEAE-Sepharose FF、Q-Sepharose FF和SephacrylS-200纯化后纯度达到95%;测得其比活为5.2×10^4AU/mg。结论利用毕赤酵母成功进行了重组葡激酶基因的表达及其表达产物的纯化。     

纳豆激酶基因在毕赤酵母中的表达纯化及抗体制备

目的实现纳豆激酶(NK)在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达,以纯化产物为抗原制备兔抗NK血清。为建立双抗夹心酶联免疫吸附反应法测定生物体内NK含量,进一步研究NK在体内代谢与功能奠定基础。方法将NK基因克隆到毕赤酵母表达载体pHBM905A中,鉴定后的重组质粒用SalⅠ酶切线性化后电转化到毕赤酵母宿主菌GS115中,甲醇诱导表达,经盐析和Millipore超滤膜过滤分离纯化表达产物。纤维蛋白法检测纯化产物的活性,并以纯化产物为抗原免疫新西兰大白兔制备兔抗NK血清。结果SDS-PAGE结果显示NK成功表达,其相对分子质量(Mr)约为27 000,纤维蛋白平板实验显示表达产物具有较好的纤溶活性。酶联免疫法测得多克隆抗体效价约为1∶8 000,Western blot结果显示在Mr27 000附近有1条特异带出现。结论NK在巴斯德毕赤酵母中实现了分泌表达,表达产物具有较好的纤溶活性和免疫原性。     

戊型肝炎病毒（HEV）开读框架2（ORF2）1．3kb基因片段在甲基营养型酵母（Pi

戊型肝炎病毒（HEV）整个基因组有3个开放性阅读框架（ORFs)，ORF2是主要结构基因编码区，将戊型肝炎病毒（HEV）ORF21．3kb基因定向亚克隆到甲基营养型酵母－巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris)分泌性表达质粒pHIL-S1和pPIC9中，转化入大肠杆菌，筛选出阳性重组株，重组质粒pPIC9HEV和pHILS1HEV分别经限制性内切酶Sal I和Bg1 II线化，电转化入巴斯德毕赤酵母GS115。与宿主GS115染色体发生整合，整合方式不同，产生两种表型，分别为HIS＋MUT＋）甲醇诱导快的，HIS＋MUTS（甲醇诱导慢的），通过营养缺陷性选择性培养基筛选出阳性菌株，经PCR技术确认外源基因整合在酵母染色体中，重组菌株先在甘油培养基中充分增殖，然后转移到甲醇培养基中诱导，取上清液，用ELIAA，SDS－PAGE，Western-blot检测到特异性HEVORF2蛋白，得到有效表达HEVORF2蛋白的菌株。     

重组毕赤酵母中Textilinin-1基因拷贝数的荧光定量PCR法检测

 目的 利用荧光定量PCR法检测重组毕赤酵母外源纤溶酶抑制剂Textilinin-1基因的拷贝数。方法 采用双标准曲线法,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）基因为内源参照基因,分别利用含有GAPDH和Textilinin-1基因的质粒,进行荧光定量PCR反应,建立标准曲线。对重组毕赤酵母基因组进行荧光定量PCR反应,通过标准曲线计算出外源Textilinin-1基因在毕赤酵母基因组中的拷贝数。结果 GAPDH和Textilinin-1基因的扩增效率分别95.04%和96.36%,两条标准曲线的决定系数均为0.999,且均具有良好的重复性,共检测10个单菌落,均得到Textilinin-1基因拷贝数为2。结论 建立的方法能够鉴定重组毕赤酵母中Textilinin-1基因的拷贝数。     

双表达盒人骨唾液酸蛋白毕赤酵母工程细胞的构建

目的构建含人骨唾液酸蛋白(hBSP)双表达盒的毕赤酵母工程细胞,为hBSP在毕赤酵母中的高效非融合分泌表达奠定基础。方法用PCR方法扩增hBSP基因,将其亚克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中,并在此基础上构建含有双表达盒的重组pPICZαAN-2×hBSP载体,电转化毕赤酵母GS115,通过Zeocin高抗性筛选转化子并对其表型进行PCR鉴定。结果得到GS115/pPICZαAN-hBSP和GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞。结论GS115/pPICZαAN-2×hBSP毕赤酵母工程细胞中含双表达盒hBSP。     

胞红蛋白酵母表达载体构建与表达纯化

胞红蛋白是脊椎动物珠蛋白超家族的一员,具有重要的生物学功能,已在大肠杆菌中成功表达。酵母表达系统作为常用的真核表达系统,具有外源蛋白表达蛋白量大且活性高等优点。该研究通过PCR扩增技术获得胞红蛋白编码基因并通过DNA重组技术构建并鉴定了胞红蛋白毕赤酵母分泌型表达载体CYGB-pGAPZαA。将重组载体经单酶切线性化后通过电转化法转入毕赤酵母GS115,利用梯度浓度的Zeocin抗生素和PCR技术筛选得到阳性转化子。工程菌经发酵培养后,发酵上清液经镍柱分离得到较高纯度的目的蛋白,并经电泳等方法验证鉴定。     

毕赤酵母高效电转化条件的研究

目的建立毕赤酵母的高效电转化方法,为利用毕赤酵母重组表达海洋药物功能基因提供方法基础。方法采用电穿孔的方法把外源DNA转化进毕赤酵母基因组中。通过对毕赤酵母生长状态,电击条件等影响因素进行探索。结果当采用对数生长中期的菌体制备感受态细胞、电压为1.5kV、质粒浓度为0.15g.L-1和0.2cm电转化杯时,转化效率达到最大值,为每微克质粒DNA 36个转化子。经抽样PCR鉴定所得到的转化子均为阳性克隆。结论通过对电转化各种条件的优化,获得了高效电转化技术方法。     

毕赤酵母重组子PCR模板制备方法的比较

目的比较5种用于PCR实验的毕赤酵母(Pichia pastoris)重组子基因组DNA的制备方法,以寻求一种稳定、可靠、简便的DNA模板制备方法,用于毕赤酵母重组子的分析。方法分别用酵母基因组提取试剂盒法、蜗牛酶法、煮沸法、煮-冻-煮法、微波法制备重组毕赤酵母基因组DNA模板,在相同条件下进行PCR扩增并比较其差异。结果以5种方法制备的重组酵母DNA作为模板进行PCR,其结果均可达到鉴定酵母重组子的效果,其中酵母基因组提取试剂盒法和微波法可以鉴定酵母重组子的基因表型。结论微波法所需时间短、费用低、操作简便而且结果稳定,并能够鉴定酵母重组子的基因表型,是采用毕赤酵母表达系统进行PCR鉴定时制备模板DNA的首选方法。     

重组rPA基因在毕赤酵母细胞中的胞内表达研究

目的构建含rPA全长基因的重组酵母胞内表达质粒pPIC9K rPA ,并在毕赤酵母中进行表达。方法用限制性内切酶BamHI和NotI将含有rPA全长基因的质粒pJZ1 6双酶切后 ,克隆至酵母表达载体pPIC9K中 ,构建酵母重组表达质粒。rPA基因经DNA序列测定准确无误。通过电穿孔法转染毕赤酵母菌GS1 1 5 ,PCR鉴定阳性酵母转化子 ,将rPA基因整合入酵母基因组DNA ,在毕赤酵母中实现了胞内非融合表达。表达产物进行SDS PAGE、Western blots以及溶纤维蛋白活性检测。结果表达产物以胞内包涵体的形式存在 ,未糖基化。SDS PAGE结果显示表达蛋白质的相对分子量约为 39kD。Western blots检测表明表达蛋白质能与单克隆抗体发生特异性反应。包涵体经 8mol L脲溶液溶解后 ,有明显的溶纤维蛋白活性。结论在毕赤酵母中成功地实现了rPA重组蛋白的胞内表达     

毕赤酵母工程菌高密度发酵肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的研究

目的研究重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL)巴斯德毕赤酵母工程菌发酵工艺。方法首先用摇瓶对工程菌的甲醇诱导周期、甲醇浓度、pH进行研究 ,在此基础上 ,采用 5L发酵罐补料培养进行中试研究。结果人可溶性TRAIL巴斯德毕赤酵母菌在pH 6 .0、甲醇诱导浓度 1%的条件下诱导 96h ,目标蛋白质浓度最高 ,可达 72 .8mg/L。 5L发酵罐培养放大 ,可以达到 184mg/L。结论此发酵工艺可以较好地提高人可溶性TRAIL工程菌的分泌表达。     

重组人源白介素-1β发酵条件的优化及其产品的纯化

目的初步建立重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母的培养体系;进一步优化大规模培养重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母的条件;探讨大规模纯化重组人源IL-1β巴斯德毕赤酵母表达产物的条件;鉴定酵母表达产物及纯化样品。方法在菌体湿重达190g.L-1左右时开始甲醇诱导表达;选用了SP Sepharose XL阳离子交换层析和反相疏水柱层析进行纯化。结果在pH4.5的含0.5%蛋白胨的FM21培养基中发酵时,放罐时间在30h较为适宜;经过纯化蛋白纯度即可达95%以上。结论最终经过鉴定,表达和纯化的样品就是我们想要得到的IL-1β。