双片段survivin短发夹RNA腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建负载双片段survivin短发夹RNA(shRNA)的腺病毒载体,为PCa的基因治疗提供实验基础。方法:分别设计2条靶向survivin基因的shRNA,克隆至穿梭质粒载体中,特异性酶切后亚克隆至腺病毒骨架,构建负载2条survivin shRNA的RNA干扰重组腺病毒载体。提取环状重组病毒质粒进行PCR、酶切双重鉴定后,大规模提取纯化正确的克隆。最后将线性化的重组腺病毒基因组转染至HEK293A包装细胞包装成病毒,并扩增到所需滴度。结果:负载双片段survivin shRNA的穿梭质粒载体pShuttle2经MluⅠ酶切鉴定,证实双片段survivinshRNA插入正确;完成目的片段至腺病毒骨架的亚克隆后,PCR及PI-SceⅠ/I-CeuⅠ双酶切鉴定均证实双片段sur-vivin shRNA插入正确。结论:负载双片段survivin shRNA腺病毒载体构建成功。     

Ki67基因短发夹状RNA表达载体对肾癌细胞生长的抑制作用

目的研究针对Ki67基因的短发夹状RNA(shRNA)表达载体pSilencer-Ki67对人肾癌细胞生长的抑制作用。方法将pSilencer-Ki67转染人肾癌786-0细胞,24、48、72、120、144 h后分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测Ki67 mRNA、蛋白表达,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,原位末端标记法检测细胞凋亡。结果pSilencer-Ki67转染后48 h 786-0细胞Ki67mRNA表达(34．1±1．7)%、蛋白表达(42．6±1．7)%降低最明显,与空质粒对照组[(97．7±0．9)%、(97．3±1．6)%]比较差异均有统计学意义(P＜0．01)。pSilencer-Ki67处理后48 h细胞增殖抑制率(76．7±3．2)%最高,72 h凋亡细胞阳性率(74．3±5．9)%最高,与空质粒对照组[(7．0±0．5)%、(8．4±1．1)%]比较差异有统计学意义(P＜0．01)。pSilencer-Ki67的这些作用可持续144 h。结论pSilencer-Ki67能有效、持续抑制人肾癌786-0细胞生长,有望成为肾癌基因治疗的有效工具。     

hTERT基因短发夹状RNA表达载体对肾癌细胞生长的抑制作用

目的观察针对hTERT基因的短发夹状RNA（shRNA）表达载体pSilencer-hTERT对人肾癌细胞及移植瘤生长的抑制作用。方法（1）pSilencer-hTERT转染人肾癌Kerr-3细胞，1、3、5、7d后逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白印迹技术检测hTERTmRNA、蛋白表达，MTT法检测细胞增殖，原位末端标记法检测凋亡。（2）BALB／C-nu裸鼠接种Ketr-3细胞成瘤，瘤内分别注射pSilencer-hTERT（50μg）、空质粒pSilencer1．0-U6（50μg）及等体积（100μg）生理盐水，隔日1次，共7次。治疗结束后第3天处死小鼠，取瘤组织检测肿瘤体积，免疫组织化学染色检测hTERT表达。结果（1）pSilencer-hTERT转染3d后Ketr-3细胞hTERTmRNA表达（43．2±4．4）％、蛋白表达（42．6±5．6）％最低，细胞增殖抑制率（37．3±6．6）％、凋亡细胞阳性率（30．5±4．7）％最高，分别与空质粒对照组[（98．8±4．7）％、（98．0±3．7）％、（3．3±0．9）％、（10．4±2．4）％]比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。（2）pSilencer-hTERT处理组小鼠肿瘤体积（62．4±36．5）mm^3减小，hTERT表达率（65．7±4．7）％降低，分别与空质粒对照组（83．2±38．7）、（90．7±4．2）％比较，差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论pSilencer-hTERT能有效、持续抑制人肾癌Ketr-3细胞及裸鼠肾癌移植瘤生长。     

短发夹状RNA抑制缺氧诱导因子1α在前列腺癌细胞中的表达

目的:构建产生缺氧诱导因子1α(HIF-1α)特异性短发夹状RNA(shRNA)的载体并检测其抑制作用,探讨该技术在前列腺癌治疗中的应用前景。方法:设计、合成针对HIF-1α的特异性shRNA模板序列,将其插入含有U6启动子的psilencerTM2.1-U6载体中,得到shRNA表达载体psilencer-HIF,在脂质体介导下转染前列腺癌细胞株PC-3M,应用绿色荧光蛋白质粒pEGFP共转染评价转染效率,RT-PCR及Western印迹检测其对HIF-1α表达的影响。结果:重组质粒psilencer-HIF经测序分析证实与设计的完全一致,共转染24 h后质粒转染效率为(89.26±4.72)%,其产生的shRNA在PC-3M细胞中能诱导RNA干扰(RNAi),转染后48 h HIF-1αmRNA和蛋白水平分别下降82.09%和81.61%(P<0.01);而阴性对照组HIF-1α表达水平无明显改变(P>0.05)。结论:成功构建了HIF-1α基因shRNA表达质粒,其可有效抑制前列腺癌细胞中的HIF-1α的表达,为前列腺癌的基因治疗提供了新思路。     

短发夹状RNA对胃癌细胞株血管内皮生长因子mRNA表达的影响

RNA干扰已成为当前肿瘤基因治疗的新策略，我们设计了针对血管内皮生长因子（VEGF）短发夹RNA（shRNA），观察其对人胃癌细胞血管VEGF表达的影响。     

短发夹状RNA对PC-3M细胞端粒酶逆转录酶基因表达和端粒酶活性的影响

目的:研究短发夹状RNA(shRNA)对PC 3M细胞中端粒酶逆转录酶(hTRT)基因表达及端粒酶活 性的影响。方法:构建针对hTRT基因的shRNA表达质粒psilencer TRT,在质脂体介导下转染人前列腺癌PC 3M细胞,应用RT PCR及免疫组织化学检测hTRTmRNA及蛋白表达水平,应用SYBR Green染色法检测端粒 酶活性的变化。结果:重组体psilencer TRT转染细胞24h和48h后显著下调hTRTmRNA及蛋白水平,作用 48h后,其抑制率分别为85.39%和79.17%,较空白对照组差异有统计学意义(P<0.01)。同时,随着时间的延 长,端粒酶活性亦有明显下降(P<0.01)。结论:利用短发夹状RNA干扰技术能有效抑制靶基因的表达,为前 列腺癌的基因治疗提供新思路。     

AKT2短发夹状RNA抑制胰腺癌细胞生长的研究

蛋白激酶B（PKB／AKT）是一种重要的信号蛋白分子，AKT蛋白与细胞生长代谢密切相关。AKT2是AKT蛋白3种主要亚型之一，有研究证实AKT2在胰腺癌中表达增高，且AKT2对胰腺肿瘤的发生发展有重要促进作用，本实验旨在研究AKT2短发夹状RNA表达载体对胰腺癌细胞生长的影响。     

靶向PGRMC1基因sh RNA真核表达载体的构建和鉴定

目的构建并鉴定靶向PGRMC1基因的短发夹RNA (shRNA)真核表达载体。方法根据Genbank数据库提供的mRNA序列,选择设计3个能转录短发夹RNA (shRNA)的DNA序列,体外分别合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经MspI和smoi双酶切线性化的质粒载体中。为了确定利用酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,采用脂质体转染方法将构建好的3个重组载体导入人卵巢癌细胞株SKOV3中,采用免疫组化法和RT-PCR法检测SKOV3细胞系转染前、后PGRMC1基因表达。结果经限制性酶MsqI酶切位点的酶和Smo I双重消化,PGRMC1成功建立到pcDNA3.1(-)的真核表达载体中。通过RT-PCR和Western印迹分析证实重组质粒已经成功传递到SKOV3细胞系。结论靶向PGRMC1基因shRNA真核表达载体的构建成功,为进一步研究PGRMC1基因在SKOV3细胞中的作用奠定了实验基础。     

含人β1转化生长因子短发夹RNA重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的 构建含人β1转化生长因子(TGF-β1)短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的复制缺陷型腺病毒载体.方法 通过聚合酶链式反应(PCR)法将带有TGF-β1 shRNA 序列构建至U6启动子(U6sh TGF-β1)下游,与T载体连接,将质粒转化人大肠杆菌.将U6sh TGF-β1连到穿梭质粒pDC316上,与腺病毒基因组质粒pBHGlox△E1、3Cre共转染293T细胞,得到重组腺病毒载体(rAd TGF-β1).经PCR鉴定正确后,进行扩增、纯化、滴度测定及感染性鉴定.结果 PCR法得到目的 片段U6sh TGF-β1,经测序,序列与设计方案完全一致.rAd TGF-β1具有良好的感染性,腺病毒滴度可达107.3TCID50/ml.双引物PCR法鉴定Ad TGF-β1可扩增出腺病毒E2b区片段及特异性片段U6sh TGFβ1.结论 成功构建了能表达TGF-β1 shRNA 的重组腺病毒载体rAd TGF-β1(A)及对照载体rAdTGF-β1(B),可能为临床应用RNA干涉--新的基因技术防治瘢痕疙瘩提供高效的方法.     

靶向人肝素酶短发卡状RNA表达载体的构建及其沉默作用

目的 构建靶向人肝素酶(HPSE)的短发卡状RNA(shRNA)表达载体,探讨其基因沉默作用.方法 根据人肝素酶mRNA序列设计shRNA,合成两条互补的寡核苷酸链,退火后连接入pGenesil-1载体,转化扩增后进行测序鉴定;重组质粒在阳离子脂质体Lipofectamine 2000的介导下,瞬时转染人胃癌细胞株SGC-7901、人前列腺癌细胞株PC-3、人膀胱癌细胞株EJ,每种细胞分别设空白对照组、空载体pGenesil-Negative转染组、pGenesil-HPSE shRNA转染组3组,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测各种细胞中肝素酶基因表达水平,黏附实验和transwell小室实验检测癌细胞游走、侵袭能力.结果 所构建的shRNA载体插入基因片段与设计序列完全匹配,载体构建成功;重组质粒转染SGC-7901、PC-3、EJ细胞后,肝素酶mRNA表达分别下调78.6%(P<0.01)、82.6%(P<0.01)、81.9%(P<0.01),肝素酶蛋白表达分别下调76.4%(P<0.01)、85.9%(P<0.01)、83.3%(P<0.01),细胞黏附能力分别下降37.7%(P<0.01)、44.6%(P<0.01)、43.8%(P<0.01),细胞侵袭能力分别下降66.8%(P<0.01)、76.6%(P<0.01)、80.5%(P<0.01).结论 成功构建了靶向人肝素酶的shRNA表达载体,沉默肝素酶基因表达后,能抑制多种癌细胞的游走和侵袭能力.     

介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定

目的：构建介导大鼠Ppif基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif,为进一步包装慢病毒载体奠定基础.方法：以大鼠Ppif基因为靶基因,根据RNA干扰（RNAi）序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-Ppif,并对质粒进行PCR及测序鉴定.结果：Ppif的短发夹RNA（shR-NA）片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4对插入序列与设计的靶基因片段完全一致.结论：构建了能够表达4个含Ppif靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导Ppif基因沉默的慢病毒载体奠定了基础.     

应用RNA干扰技术阻断PC-3细胞中survivin基因的表达

目的:用真核转录载体pS ilencerTM3.1-H1 neo构建针对survivin基因的重组真核转录载体,并转染前列腺癌细胞系PC-3,通过RNA干扰(RNA i)阻断PC-3细胞中survivin基因的表达,并研究survivin基因沉默后对PC-3细胞凋亡产生的影响。方法:将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pS ilencerTM3.1-H1 neo线性质粒用T4DNA连接酶连接,重组质粒经酶切及DNA测序鉴定后,用脂质体法转染PC-3细胞,通过RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学染色实验检测survivin的表达变化,并用流式细胞术检测转染后PC-3细胞的凋亡变化,MTT法检测细胞生长速度的变化。结果:酶切及测序证实设计合成的DNA已正确插入载体。RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学染色实验表明,pS ilencer3.1-SVV2和pS ilencer3.1-SVV3重组载体有效地阻断了PC-3细胞中survivin基因的表达,survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.01),转染后PC-3细胞的凋亡增加了10%~15%,细胞生长速度明显变慢。结论:成功构建了针对survivin基因的真核转录载体pS ilencer3.1-SVV1、pS ilencer3.1-SVV2和pS ilencer3.1-SVV3,后两者可有效地阻断前列腺癌细胞系PC-3细胞中survivin基因的表达,并使转染后PC-3细胞的凋亡增加了10%~15%,细胞生长速度明显变慢。     

肿瘤特异性survivin启动子在前列腺癌细胞中的活性鉴定

目的:克隆survivin启动子片段,并检测其在人前列腺癌LNCaP细胞和人正常张氏肝细胞中的转录活性,为该启动子在前列腺癌的靶向性基因治疗中奠定基础。方法:用PCR扩增survivin基因启动子S1pro和S2pro克隆入pPRIME载体,构建重组质粒pPRIME-S1pro和pPRIME-S2pro,脂质体转染LNCaP细胞和张氏肝细胞,检测survivin启动子在细胞中的转录活性。结果:survivin基因启动子在前列腺癌细胞中具有较强活性,其中S2pro启动活性明显高于S1pro,达到CMV启动子活性的39%。结论:survivin启动子在前列腺癌细胞中具有较强启动活性,可望成为新的前列腺癌靶向性基因治疗工具。     

脂质体转染survivin反义寡核苷酸对人胰腺癌细胞凋亡的影响

目的探讨survivin反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASODN)对人胰腺癌细胞PANC-1增殖的影响。方法设计并合成特异性靶向ASODN及正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotides,SODN)。ASODN经FAM标记,以阳离子脂质体为载体转染至体外培养的PANC-1细胞中(ASODN组),另设空白对照组(正常培养的细胞)、脂质体空转染组(脂质体转染的为正常的培养基)及SODN组作为对照组。采用流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测转染率,依次筛选最佳细胞接种数量、ASODN浓度和脂质体的量;荧光显微镜观察转染后的细胞;MTT法测定转染后细胞的抑制率;透射电镜观察转染后细胞的超微结构变化;吖叮橙(AO)与溴化乙啶(EB)染色观察转染后细胞凋亡的形态学改变;DNA凝胶电泳观察转染后细胞凋亡情况;FCM测转染后细胞凋亡率及细胞周期;免疫组织化学技术检测转染后survivin蛋白的表达。结果①ASODN浓度为50、100、150、200、250、400、600及800 nmol/L时,转染率分别为31.9%、37.4%、41.4%、52.6%、24.2%、11.4%、16.1%和15.5%;接种细胞数量为2×104、2×105及2×106个/孔时,转染率分别为12.0%、50.8%和11.2%;转染所用的脂质体量为2、3及4μl时,转染率分别为58.8%、34.0%和23.6%。②转染ASODN后荧光显微镜发现转染后细胞之间空隙加大,形态变圆,贴壁细胞生长较少,部分漂浮于培养液中。③ASODN组24、36及48 h后细胞抑制率明显高于各对照组(P0.05),随着时间延长,细胞抑制率增高(P0.05)。④ASODN组电泳图上凋亡细胞呈明显的"梯状"条带。⑤AO与EB染色观察ASODN组细胞出现凋亡的形态学改变,其核染色质均高度聚集或核染色呈新月形聚集于核膜一边,核仁消失。⑥ASODN组细胞凋亡率为(38.10±3.4)%,明显高于SODN组的(4.16±1.7)%(P0.05)。⑦ASODN组细胞周期阻滞于G2/M期。⑧转染后ASODN组survivin蛋白表达明显低于各对照组(P0.05)。结论 survivin ASODN转染至胰腺癌细胞最佳转染条件为接种细胞数量为2×105个/孔,ASODN的浓度为200 nmol/L,脂质体的量为2μl;survivin ASODN能明显下调survivin蛋白的表达,抑制胰腺癌PANC-1细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。     

RNA干扰抑制PC-3细胞survivin基因表达并诱导细胞凋亡的实验研究

目的:研究RNA干扰抑制人前列腺癌PC-3细胞survivin mRNA和蛋白表达并诱导细胞凋亡的效果。方法:设计、构建针对survivin基因的RNAi表达载体,分别以质粒A、B组,阴性序列组和空白对照E组用脂质体法转染PC-3细胞,应用RT-PCR及Western印迹、流式细胞术检测其对survivin mRNA和蛋白表达并诱导细胞凋亡的效果。结果:各组细胞survivin蛋白的表达强度分别为(18.94±0.63)%、(16.35±0.23)%、(46.41±0.76)%、(46.20±1.47)%。各组细胞中survivin mRNA的表达强度分别为(27.94±1.43)%、(24.51±1.37)%、(49.46±0.71)%、(48.49±1.32)%。各组细胞凋亡率分别为(12.80±1.33)%、(16.48±1.00)%、(3.03±0.62)%、(2.96±0.41)%。统计学表明构建的两种阳性表达载体均有效抑制了survivin mRNA和蛋白表达并诱导细胞凋亡。结论:RNAi可有效抑制PC-3细胞survivin mRNA和蛋白表达,并诱导细胞凋亡。     

生长抑素pcDNA3s/SS质粒的构建与鉴定

动物生长抑制激素 (Somatostatin ,SS)基因克隆至含有乙肝表面抗原的 pcDNA3s质粒载体上 ,生长抑素基因插入到乙肝表面抗原的 5′末端 ,构建生长抑素DNA疫苗 .经PCR反应扩增出含有SS和HBsAg的融合基因片段 ,并经测序证实SS基因已成功重组到 pcDNA3s质粒上     

Survivin启动子驱动LRIG1基因表达的重组腺病毒对人膀胱癌细胞BIU87生长的影响

目的:构建Survivin启动子驱动LRIG1基因表达的重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl,并检测其对人膀胱癌细胞BIU87生长的影响.方法:将经同源重组产生的重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测其滴度.用Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl分别感染人膀胱癌细胞BIU87及人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1,MTT法评估Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl对BIU87细胞生长的抑制作用.结果:当感染复数(MOI)=25时,Ad-Surp-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率为74.56%,在SV-HUC-1细胞中转染率为0,差异有统计学意义(χ2=58.64,P<0.05);Ad-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率为68.27%,在SV-HUC-1细胞中转染率为72.52%,差异无统计学意义(χ2=0.075,P>0.05).Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率相比,差异无统计学意义(χ2=0.016,P>0.05).与PBS相比,Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl均能明显抑制BIU87细胞的生长,转染后第4天这一差异显著(F=15.96,P<0.05),而Ad-Surp-LRIGl组和Ad-LRIGl组细胞生长速度无明显差异.结论:成功构建了含有Survivin启动子驱动LRIG1基因的重组复制腺病毒Ad-Surp-LRIGl并鉴定正确,Ad-Surp-LRIGl能选择性转染人膀胱癌细胞BIU87,在体外能明显抑制膀胱癌细胞BIU87的生长.     

Cathepsin K基因siRNA的筛选及其质粒载体的构建

目的筛选出对人Cathepsin K（CTSK）基因抑制效率最高的1对siRNA,并通过质粒载体表达该siRNA,为进一步抑制去分化人软骨细胞中CTSK的表达奠定基础。方法针对CathepsinK基因设计4个靶位点,并根据靶位点合成4对siRNA．并转染人软骨细胞。通过Real-timePCR检测4对siRNA中抑制效率最高的1对,与线性化的PGCsilencer-H1／Neo／GFP连接、转化、扩增与纯化质粒。结果4对siRNA转染软骨细胞后72h,通过对照FITC-siRNA的绿色荧光观察．siRNA的转染效率达到70％～80％。Real-timePCR检测每对siRNA的CTSK量与对照组比的百分率得到其抑制效率,分别为：第1对的比值大于对照组（无抑制作用）,第2对47．5％,第3对53．1％,第4对67．3％（抑制效率最大）。成功构建出pGCsilencer^TMH1／Neo／GFP／CTSKRNAi载体,经测序证实了克隆的RNAi打靶序列100％正确。结论成功构建了CTSK基因的siRNAs表达质粒,为进一步研究抑制该基因表达对延缓软骨细胞的去分化过程并促进其成软骨能力奠定了基础。     

风疹病毒E1特异肽段的重组质粒载体构建

目的:构建风疹病毒(RV)E1特异肽段的重组质粒载体,以期表达RVE1特异肽段的重组蛋白。方法:抽提RV减毒活疫苗Wistar RA27/3株的基因组RNA后逆转录,用PCR方法扩增E1特异肽段的基因片段;扩增产物经纯化后克隆至pGEX-2T质粒载体,挑取重组质粒阳性克隆进行双酶切鉴定和测序。结果:成功克隆出330bp左右的目的片段,重组质粒经测序后与预期序列一致。结论:RVE1特异肽段的基因片段的成功克隆及重组质粒的构建为进一步表达相应重组蛋白奠定了基础。