红景天甙对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞ERK活性的影响

目的：探讨红景天甙对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞(hepatic stellste cell,HSC)增殖、细胞外信号调节蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)磷酸化蛋白表达水平的影响。方法：采用MTT比色及Westemblot法分别检测细胞增殖及磷酸化ERK2蛋白。结果：乙醛刺激HSC增殖、处于活化状态的磷酸化ERK2蛋白表达水平增加；红景天甙0．25mg/ml，0．5mg/ml，1．0mg／ml，1．5mg/ml，2．0mg／ml，2．5mg/ml均能抑制乙醛刺激HSC增殖，1．5mg/ml红景天甙可明显抑制乙醛刺激的P-ERK2蛋白水平。结论：红景天甙明显抑制乙醛刺激的HSC内P-ERK2水平可能为其抑制HSC增殖的重要机理之一。     

JNK信号通路对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞增殖的影响

目的 :初步探讨JNK信号通路调控乙醛刺激的大鼠肝星状细胞 (HSC)增殖的分子机制。方法 :采用细胞培养 ,用c Jun氨基末端激酶 (c JunN terminalkinase ,JNK)特异性阻断剂 (SP60 0 12 5 )对乙醛刺激的HSC进行处理 ,以MTT比色法、Westernblot法检测细胞增殖和磷酸化JNK(p JNK)水平的变化 ,观察JNK通路对HSC增殖影响。 结果 :乙醛刺激后HSC增殖明显 ,同时JNK活性增强 ;使用SP60 0 12 5 (2 0、60ng/ml)后 ,明显抑制HSC增殖 (P <0 0 5 ) ,加大SP60 0 12 5浓度到 10 0ng/ml后 ,抑制作用更明显 (P <0 0 1) ;而p JNK水平也呈相应的降低 (P <0 0 5 )。 结论 :JNK活性变化与乙醛刺激的大鼠HSC的增殖具有相关性 ,提示JNK可能是调节HSC增殖的重要信号通路之一。     

ERK信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞Na+/Ca2+泵mRNA表达的研究

目的 :探讨Erk信号传导通路调控乙醛刺激的肝星状细胞 (HSC)Na /Ca2 泵mRNA表达的影响。方法 :用链霉蛋白酶和胶原酶原位灌流 ,Metrizamide密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞 ,采用RT PCR测定PD980 5 9阻断乙醛激活的肝星状细胞Erk活性后Na /Ca2 泵mRNA表达。结果 :乙醛刺激后 ,HSC后明显促进Na /Ca2 泵mRNA表达 (P<0 0 1) ,不同剂量PD980 5 9对肝星状细胞Na /Ca2 泵mRNA表达的影响无统计学意义。结论 :Erk信号传导通路可能对乙醛刺激的肝星状细胞激活状态的启动无明显影响     

Erk信号传导通路对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞增殖的影响

目的:探讨乙醛激活HSC过程中Erk的变化,以及阻断Erk信号传导通路对HSC增殖的影响。方法:用乙醛刺激,不同剂量PD98059预处理后的HSC,采用免疫组织化学方法检测细胞中Erk的变化,并以细胞计数和MTT比色法观察PD98059Erk对HSC增殖的影响。结果:乙醛刺激HSC后Erk胞浆表达向胞核移行,PD98059阻断Erk核内移行,随剂量递增愈发明显,PD98059在20μmol/L时对HSC增殖有抑制作用,P<0.05;50μmol/L、100μmol/L时抑制作用明显,P<0.01。结论:Erk信号传导通路参与乙醛激活HSC的过程,PD98059对乙醛刺激的HSC增殖具有抑制作用,提示Erk信号传导通路是调控乙醛刺激的HSC增殖重要通道。     

红景天甙对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞周期的影响

目的:探讨中药红景天有效单体成分红景天甙抑制乙醛刺激的体外培养大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,risc)增殖的机制。方法:用免疫细胞化学染色法检测HSC内增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PC-NA)的表达,流式细胞仪分析红景天甙作用于乙醛刺激的HSC后细胞周期的变化。结果:红景天甙组HSC内PCNA 表达明显低于乙醛组(0.34±0.07 Va 0.62±0.04),P<0.05;红景天甙可明显抑制乙醛刺激HSC由G1-S期转化,表现为红景天甙组GD/G1期细胞百分率较乙醛组显著增加(59.25±4.55 Vs 36.12±3.01),P<0.05;S期细胞百分率显著降低(30.34±4.35Vs 51.26±2.84),P<0.05。结论:红景天甙抑制HSC增殖可能与其阻滞HSC细胞周期有关。     

血管生成素通过ERK信号通路促进HeLa细胞的增殖

目的通过细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)通路及NF-кB信号途径探讨血管生成素(angiogenin,Ang)对HeLa细胞的促增殖及抗凋亡作用机制。方法用不同浓度的重组人Ang刺激HeLa细胞,MTT法分析Ang对HeLa细胞的促增殖作用,蛋白质印迹实验检测ERK信号通路相关分子的表达情况。U0126抑制ERK信号通路,检测Ang诱导的ERK1/2的磷酸化及c-myc的表达情况,同时检测Ang对细胞增殖的影响。敲低Ang的表达,检测细胞的凋亡情况。双荧光素酶报告基因检测Ang对NF-κB报告基因的激活。蛋白水平检测Ang刺激的HeLa细胞后,NF-κB通路相关分子的表达。结果 Ang能促进HeLa细胞增殖,ERK1/2的磷酸化水平及c-myc的表达随重组人Ang浓度的升高而增加。U0126能抑制Ang诱导的ERK1/2的磷酸化、c-myc的上调及细胞的增殖。Ang的低表达促进HeLa细胞的凋亡,但不影响NF-κB报告基因的激活及NF-κB通路上相关分子的表达。结论 Ang能够促进HeLa细胞增殖,并通过活化ERK通路促进细胞的增殖,但其抑凋亡作用与NF-κB通路无关。     

乳腺癌MDA-MB-231细胞源Exosomes对内皮细胞增殖的影响及MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路的作用

目的研究人乳腺癌MDA-MB-231细胞源Exosomes对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的促增殖作用,并初步探讨MAPK/ERK和PI3K/Akt信号转导通路在此过程中的作用。方法低温超速离心及密度梯度离心法提取乳腺癌MDA-MB-231细胞源Exosomes。采用MTT法分别检测50、100、200、400μg/ml Exosomes对HUVECs促增殖作用的影响,流式细胞仪测定200μg/ml Exosomes对HUVECs细胞周期的影响,Western blotting检测200μg/ml Exosomes诱导下HUVECs细胞内细胞外调节蛋白激酶(ERK)和蛋白激酶B(Akt)蛋白的表达水平。结果乳腺癌MDA-MB-231细胞源Exosomes可促进HUVECs细胞增殖,且呈时间和剂量依赖性。200μg/ml Exosomes作用HUVECs细胞24h后,S期细胞比例(27.8%±3.37%)较对照组(15.34%±0.71%)增加(P<0.05),G1/S期细胞比例(2.22%±0.37%)与对照组(4.67%±0.47%)比较下降(P<0.05)。Western blotting结果显示,200μg/ml Exosomes作用HUVECs细胞24、48、72h后,磷酸化ERK表达(0.3378±0.0415,0.4967±0.0511,0.9205±0.0462)与磷酸化Akt蛋白表达(0.4091±0.0361,0.5484±0.0382,0.7496±0.0481)与对照组(磷酸化ERK 0.1836±0.0324,磷酸化Akt 0.2582±0.0215)相比有所增加(P<0.05)。结论乳腺癌MDA-MB-231细胞源Exosomes能促进HUVECs的增殖,其机制可能与细胞周期改变,以及MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路的持续活化有关。     

MAPK反义寡核苷酸对乙醛活化HSC增殖和JNK信号通路的影响

目的:探讨丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)反义寡核苷酸(ASO)对乙醛活化肝星状细胞(HSC)增殖和MAPK中的c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路的影响。方法:用脂质体转染法将MAPKASO导入乙醛活化HSC中,通过MTT法检测细胞增殖情况、流式细胞仪检测MAPK-JNK表达。结果:MAPK ASO可明显抑制细胞增殖及抑制JNK信号通路的表达,其抑制率分别为40.81%、60.6%。与对照组比较有显著差异(P<0.05)。结论:MAPKASO能够抑制HSC的增殖,阻断JNK信号通路,这可能成为治疗肝纤维化的一个有效途径。     

人参皂苷对肺癌细胞增殖、凋亡影响及作用机制

目的探讨人参皂苷Rg3对非小细胞肺癌细胞系NCI-H292细胞增殖、凋亡的作用及其与相关信号通路的关系。方法用不同浓度(0、20、40、60μmol/L)人参皂苷Rg3处理NCI-H292细胞。CCK8法检测人参皂苷Rg3对NCI-H292细胞增殖的影响;流式细胞术检测人参皂苷Rg3对NCI-H292细胞凋亡的影响;Western blot检测caspase-3和Bcl-2蛋白表达;反转录聚合酶链反应检测Keap1 mRNA和Nrf2 mRNA表达,观察人参皂苷Rg3对Keap1-Nrf2/ARE信号通路的调节作用;通过检测活性氧水平评价细胞内氧化应激水平。结果与对照组(人参皂苷Rg3为0μmol/L)比较,随着人参皂苷Rg3浓度增加,细胞的增殖能力和Nrf2 mRNA表达下降,细胞的凋亡能力、caspase-3和Bcl-2蛋白表达量、Keap1 mRNA表达、活性氧水平上升,且均呈浓度依赖性(P<0.05)。结论人参皂苷Rg3可能通过抑制Keap1-Nrf2/ARE信号通路而抑制非小细胞肺癌细胞增殖,并促进其凋亡。     

乙醛对大鼠HSC增殖以及胶原基因表达影响的实验研究

目的：研究乙醛对新分离的肝星状细胞（hepatic stelalate,cell,HSC）增殖、表达α1（Ⅰ）型胶原mRNA、IkB和NF-kB的影响，以探讨酒清性肝纤维化发病机理。方法：用链霉蛋白酶、胶原酶以及密度梯度分离培养大鼠肝星状细胞。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、原位杂交法、免疫细胞化学法、凝胶电泳迁移率法（EMSA）分别检测肝星状细胞的增殖、胶原合成、IkBα以及NF－kB的表达。结果：（1）成功分离出大鼠肝星状细胞。（2）乙模型刺激新分离培养的肝星状细胞后细胞明显增殖；乙醛刺激传一代肝星关细胞后，α1（Ⅰ）型胶原mRNA表达显著增加；IkBα表达明显下降；乙醛作用肝星状细胞后30min，NF－kB的表达即有增加，到120min时达最高值。结论：乙醛可以使静止的肝星状细胞活化，表现为增殖、α1（Ⅰ）型胶原mRNA合成、IkBα表达下降、NF-kB活性增加。     

有氧运动对2型糖尿病大鼠腓肠肌氧化应激及MAPKs信号通路的影响

目的:研究有氧运动对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗、腓肠肌氧化应激以及MAPKs信号通路的影响。方法:健康雄性Wistar大鼠30只,随机分为正常对照组(C组)、糖尿病对照组(DC组)和有氧运动组(DE组),其中C组以普通饲料喂养,DC组和DE组以高脂饲料喂养。4周后,对DC组和DE组大鼠采用单次注射链脲佐菌素(STZ)的方法建立2型糖尿病大鼠模型,继续高脂饲料喂养4周后,DE组大鼠进行无负重游泳训练6周,训练期间C组大鼠继续以普通饲料喂养,DC组和DE组大鼠继续以高脂饲料喂养。6周后,处死所有大鼠,测试空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR),测试腓肠肌超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性及丙二醛(MDA)水平,RT-PCR法测试腓肠肌p38和JNK mRNA表达,Western-blot法测试腓肠肌ERK1/2和p-ERK1/2表达。结果:和C组相比,DC组大鼠FBG、FINS和HOMA-IR均显著升高,腓肠肌SOD和GPX活性显著降低而MDA水平显著升高,腓肠肌p38、JNK1、JNK2 mRNA相对表达量显著升高,p-ERK1、ERK2和p-ERK2相对表达量显著升高而ERK1相对表达量差异无统计学意义。与DC组相比,DE组大鼠FBG、FINS和HOMA-IR均显著降低,腓肠肌SOD和GPX活性显著升高而MDA水平显著降低,腓肠肌p38和JNK1 mRNA相对表达量显著升高而JNK2 mRNA相对表达量无统计学意义,腓肠肌p-ERK1、ERK2和p-ERK2相对表达量显著升高而ERK1相对表达量无统计学意义。结论:有氧运动可激活糖尿病大鼠腓肠肌MAPKs信号通路系统,增强机体抗氧化酶SOD和GPX活性,改善糖尿病大鼠氧化应激状态,降低其胰岛素抵抗水平。     

sp600125对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞凋亡及Fas蛋白表达的影响

目的：探讨c-Jun氨基末端激酶（c-JunN-terminal kinase，JNK）信号传导通路特异阻断剂sp600125对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）凋亡以及Fas蛋白表达的影响。方法：不同浓度sp600125对乙醛刺激的大鼠HSC-T6进行处理后，用Hoechst 33258染色后，观察凋亡细胞的形态变化，FCM法检测细胞凋亡率，SAN2法检测Fas蛋白表达。结果：不同浓度的sp600125能诱导乙醛刺激的HSC-T6凋亡，表现为细胞核浓缩、碎裂，形成凋亡小体；随着sp600125浓度增加，HSC-T6凋亡率逐渐增高（F=42．57，P〈O．01），HSC-T6细胞内Fas蛋白阳性表达率也逐渐增高（F-72．58，P〈0．01）。结论：不同浓度sp600125能诱导乙醛刺激的HSC-T6凋亡，这可能与上调Fas蛋白表达有关。     

bcl-2、c-myc和caspase-3蛋白在乙醛刺激的大鼠肝星状细胞中的表达

目的：探讨乙醛刺激的大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）中bcl-2、c-myc和caspase-3蛋白表达，进一步了解酒精导致肝纤维化的发病机制。方法：用不同浓度乙醛对大鼠HSC-T6株进行处理，MTT比色法检测细胞增殖，SABC法检测bcl-2、c-myc和caspase-3蛋白表达。结果：乙醛刺激HSC-T6细胞增殖（P〈0．01），bcl-2和c-myc蛋白表达阳性率增加（P均〈0．01），而caspase-3蛋白表达阳性率降低（P〈0．05）。结论：乙醛刺激HSC细胞增殖可能与bcl-2、c-myc蛋白表达增加和caspase-3蛋白表达降低有关。     

模拟失重条件下骨形态发生蛋白-2诱导的成骨细胞蛋白激酶MEK1活性的变化

目的观察模拟失重条件下由骨形态发生蛋白-2（BMP-2）诱导的大鼠骨肉瘤成骨样细胞（ROS17／2．8）中丝裂原激活的蛋白激酶／细胞外信号调节激酶的激酶1（MAPK／ERK kinase1，MEK1）活性的变化。方法在地面1G和回转器模拟失重条件下培养ROS17／2．8细胞，培养时间分别为24h、48h和72h。培养结束前1h加入BMP-2（500ng／ml），1h后提取细胞蛋白，应用Western Blotting法检测细胞中的总细胞外信号调节激酶1／2（总ERK1／2）和磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK1／2）的含量。另设一空白对照组，即1G条件下不加BMP-2的培养组。结果7个实验组细胞的总ERK1／2蛋白表达量无明显差异；空白对照组p-ERK1／2的表达量极低，明显低于其他6组（P〈0．01）；各时间点模拟失重组p-ERK1／2表达量均低于1G对照组（P〈0．01）；随着失重时间延长p-ERK1／2表达量呈逐渐降低的趋势（P〈0．01）。结论模拟失重条件下BMP-2诱导的成骨细胞MAPK信号通路中蛋白激酶MEK1的活性下降。     

无镁损伤培养海马神经元后ERK1/2核转移的动态变化

目的 动态观察培养的大鼠海马神经元经无镁损伤后不同时间细胞外信号调节激酶磷酸化(p-ERK1/2)及其核转移,探讨体外培养海马神经元受致痫性损伤后ERK1/2信号通路的动态变化. 方法 选24 h内新生Wistar大鼠,取双侧海马神经元,用NB培养基加B-27培养9 d,换成无镁细胞外液模拟"癫痫微环境",使得神经元受到致痫性损伤.采用免疫荧光标记,在激光共聚焦显微镜下定位无镁损伤前后p-ERK1/2的表达部位;运用Western blot技术检测无镁损伤不同时间p-ERK1/2表达强度的变化. 结果 无镁损伤前,p-ERK1/2主要在神经元胞浆和轴浆内表达,胞核表达不明显,而在损伤之后,p-ERK1/2在神经元胞浆、轴浆以及胞核内都有表达,强度接近;在损伤后1 h,p-ERK1/2表达就增强,3 h达到高峰(p-ERK1:2.2 838±0.1 186;p-ERK2:4.1 273±0.0 927),与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05). 结论无镁细胞外液损伤可引起培养的神经元p-ERK1/2的大量表达,培养神经元致痫性损伤后ERK1/2信号通路的过度激活可能与其反复癫痫样放电有关.     

模拟失重对骨形态发生蛋白2(BMP-2)诱导的ROS17/2.8细胞中ERK活性的影响

目的观察回转器模拟失重对骨形态发生蛋白2（BMP-2）诱导的大鼠骨肉瘤成骨样细胞（ROS17／2．8）中蛋白激酶ERK活性及c-fos／c-jun mRNA表达的影响。方法在地面1G和回转器模拟失重条件下培养ROS17／2．8细胞，按培养时间再分为24h和48h组，各组又分为有或无BMP-2（500ng／ml）组。提取细胞总蛋白，应用免疫沉淀和Western Blotting法检测磷酸化Elk（P-Elk）含量的变化，以反映蛋白激酶ERK的活性。提取细胞总RNA，采用反转录PCR法检测c-fos和c-jun的mRNA表达量。结果BMP-2诱导组的p-Elk表达量明显高于无BMP-2组，各时间点模拟失重组p—Elk表达量均低于1G重力对照组。模拟失重条件下24h和48h组的c-fos mRNA表达较1G对照显著降低（分别为P〈0．05，P〈0．01）。模拟失重条件下48h组的c-jun mRNA的表达显著低于1G对照水平（P〈0．01）。结论模拟失重降低了ROS17／2．8细胞中BMP-2诱导的ERK的活性，且抑制了c-fos和c-jun的基因表达。     

阿魏酸钠对肝星状细胞中I型前胶原和CTGF mRNA表达的影响

目的　考察阿魏酸钠对氧化应激条件下 ,肝星状细胞中I型胶原及其相关调控因子CTGFmRNA表达的干预作用。方法　以 5 0 μmol·L-1H2 O2 处理的HSC -T6细胞为氧化应激模型组 ,采用RT -PCR方法检测并分析 12 5 μmol·L-1和 5 0 0 μmol·L-1SF对细胞中I型前胶原及其相关调控因子CTGF表达的影响。结果　肝星状细胞在氧化应激条件下I型前胶原mRNA和CT GFmRNA表达水平都明显上调 ,而阿魏酸钠可以下调二者的表达水平。结论　阿魏酸钠从转录水平调控胶原表达可能对肝纤维化有重要防治作用