microRNA-1和热休克蛋白90在心肌缺氧复氧中的关系

目的初步探讨心肌细胞缺氧复氧(H/R)时miR-1和热休克蛋白90(HSP90)的关系。方法建立乳大鼠心肌细胞H/R模型,Western-Blot检测HSP90蛋白表达。生物学信息分析miR-1和HSP90亚型的结合情况。重组miR-1慢病毒感染乳大鼠心肌细胞,Western-Blot检测HSP90aa1和HSP90b1蛋白表达,实时荧光定量PCR检测HSP90aa1和HSP90b1的mRNA表达。重组miR-1慢病毒感染乳大鼠心肌细胞后H/R处理,Western-Blot检测HSP90、HSP90aa1、HSP90b1蛋白的表达。结果心肌细胞H/R后,HSP90蛋白表达水平下降。TargetScan分析显示HSP90蛋白的两个亚型HSP90aa1和HSP90b1的3’-UTR与miR-1结合。与对照组相比,HSP90aa1和HSP90b1蛋白在感染LV-rno-miR-1组表达水平降低,而在感染LV-rno-miR-1 sponge组中表达水平增加。感染LV-rno-miR-1组和LV-rno-miR-1 sponge组较对照组的HSP90aa1和HSP90b1的mRNA表达无明显变化。相对于感染LV-rno-miR-1组和缺氧复氧组,感染LV-rno-miR-1病毒后缺氧4小时复氧12小时,HSP90、HSP90aa1、HSP90b1蛋白表达水平进一步降低。结论心肌缺氧复氧时,HSP90蛋白及其亚型aa1和b1表达下降。miR-1可能在心肌缺氧复氧中直接或间接调控HSP90。     

MicroRNA-181a调控缺氧/复氧诱导下心肌细胞的凋亡

目的:探讨microRNA-181a(miR-181a)对缺氧/复氧诱导下大鼠心肌细胞株H9c2凋亡的作用。方法:通过生物信息学软件筛选出可调控Bcl-2表达的miRNAs。建立H9c2细胞缺氧/复氧模型,通过Western blot检测Bcl-2蛋白表达变化,荧光定量PCR检测miR-181a表达变化。进一步构建Bcl-2的荧光素酶报告载体,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶的表达变化。采用体外合成的大鼠miR-181a的模拟物(mimic)和抑制剂(inhibitor),用脂质体转染培养的H9c2细胞48h后,缺氧/复氧处理细胞,实验分为4组:正常对照组(CTL)、缺氧/复氧组(H/R)、缺氧复氧加miR-181a的模拟物组(mimic)、缺氧复氧加miR-181a的抑制剂组(inhibitor)。TUNEL法检测各组细胞凋亡;Western blot分析各组凋亡关键蛋白cleaved caspase-3的表达量的变化。结果:生物学软件预测miR-181a可调控Bcl-2蛋白的表达,在缺氧/复氧模型中Bcl-2蛋白的表达明显下调,而miR-181a的表达上升近4倍。成功构建双荧光酶素报告载体以及突变体,实验组的报告荧光比对照组明显下降,而突变体的荧光强度下降不明显。与H/R组相比,inhibitor组cleaved caspase-3蛋白、凋亡率下降,mimic组却拮抗了上述变化。结论:miR-181a能够增加氧化应激条件下H9c2心肌细胞损伤,促进H9c2心肌细胞凋亡,miR-181a通过调控Bcl-2蛋白的表达,在H/R介导的凋亡途径中扮演了关键性的作用。     

TFPI对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其机制初探

[目的]探究组织因子途径抑制物(TFPI)对大鼠心肌缺血再灌注(I/R)及心肌细胞缺氧复氧(H/R)损伤的影响,并从心肌细胞凋亡的变化探索其机制。[方法]在体内实验中,通过SD大鼠心脏原位结扎法可逆阻断前降支建立大鼠心肌I/R模型。将大鼠随机分为对照组、I/R组和I/R+rTFPI(重组TFPI)组,再灌注后3天采用HE染色观察大鼠心肌组织形态学变化,TTC染色法评估心肌梗死区范围,扫描透射电镜观察心肌超微结构损伤情况,Western blot法检测各组大鼠心肌组织中Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3蛋白的表达。在体外实验中,采用胰酶消化法及差速贴壁法培养SD乳鼠原代心肌细胞,用MIC101系统模拟心肌细胞I/R损伤,缺氧2 h、复氧12 h后建立体外心肌细胞H/R模型。将心肌细胞分为对照组、H/R组和H/R+rTFPI(10μg/L)组,用CCK-8法检测心肌细胞活力,TUNEL法检测心肌细胞凋亡率,Western blot法检测心肌细胞中Bax、Bcl-2及cleaved Caspase-3蛋白的表达水平。[结果]体内实验中,成功建立大鼠在体心肌I/R模型。HE...     

调控自噬对H9c2心肌细胞缺氧／复氧损伤的影响

目的探讨调控自噬水平对H9c2心肌细胞缺氧／复氧（H／R）损伤的影响及意义。方法将H9c2心肌细胞缺氧2h／复氧4h,建立H／R损伤模型。以3-甲基腺嘌呤（3-MA）为自噬特异抑制剂和雷帕霉素为自噬增强剂,试验随机分为四组：正常对照组（C组）、H／R组、H／R＋100mol／L3-MA组（M＋H／R组）、H／R＋100nmol／L雷帕霉素（R＋H／R组）,应用MTT法检测细胞活力,透射电镜检测心肌细胞自噬小体,流式细胞技术检测细胞凋亡比例,Westernblot法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1,凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及下游活性片段Caspase-9、Caspase-3蛋白表达。结果H／R组明显诱导H9c2心肌细胞自噬发生、细胞活力下降、凋亡增加（P〈O．01）．Westernblot检测发现,Bax、Caspase-9、Caspase-3活性片段蛋白表达明显增加,Bcl-2表达明显抑制,Bax／Bcl-2比值、活化蛋白Caspase-3、Caspase-9表达增加（P〈O．01）;M＋H／R组H／R损伤作用明显减弱,线粒体凋亡通路及下游蛋白表达抑制（P〈O．01）;而R＋H／R组线粒体凋亡通路进一步激活,促进细胞凋亡发生（P〈O．01）。结论自噬在H9c2心肌细胞H／R损伤中起到致命性作用,抑制自噬可保护心肌细胞H,R氧化应激损伤,其机制与抑制线粒体凋亡通路有关。     

miR-376b-3p通过靶向FGF21加重缺氧复氧心肌细胞的损伤

目的 探讨miR-376b-3p对缺氧复氧(H/R)心肌细胞增殖、凋亡的影响及机制。方法 培养心肌细胞H9c2,缺氧复氧法体外模拟H/R细胞损伤,建立心肌细胞损伤模型。用流式细胞术、免疫印迹(Western blot)、酶联免疫吸附(ELISA)检测正常对照组、H/R组、anti-miR-NC组、anti-miR-376b-3p组、anti-miR-376b-3p+si-NC组、anti-miR-376b-3p+si-成纤维细胞生长因子21(FGF21)组细胞凋亡率、凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达和肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素17(IL-17)情况。双荧光素酶报告基因实验检测细胞的荧光活性。结果 成功建立缺氧复氧损伤的细胞模型;模型组细胞中miR-376b-3p表达显著升高,FGF21表达显著降低,并且抑制miR-376b-3p可以减轻损伤细胞的凋亡和TNF-α、IL-6、IL-17的含量,以及上调Bcl-2,下调Bax。此外,miR-376b-3p还可靶向FGF21 mRNA。抑制FGF21后,抑制miR-376b-3p对缺氧复氧损伤的H9c2细胞的保护作用被减弱。结论 miR-376b-3p可促进缺氧复氧心肌细胞的凋亡和炎性反应,其机制与靶向FGF21 mRNA相关。     

miR-200c-3p靶向XIAP调控缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡

目的探讨miR-200c-3p对缺氧复氧心肌细胞凋亡的影响及作用机制。方法构建缺氧复氧(H/R)H9c2细胞。运用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测细胞中miR-200c-3p、X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)信使核糖核酸(mRNA)的表达。将H9c2细胞分为H/R+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、H/R+anti-miR-200c-3p组(转染anti-miR-200c-3p)、H/R+pcDNA组(转染pcDNA)、H/R+pcDNA-XIAP组(转染pcDNA-XIAP)、H/R+anti-miR-200c-3p+si-NC组(共转染anti-miR-200c-3p和si-NC)、H/R+anti-miR-200c-3p+si-XIAP组(共转染anti-miR-200c-3p和si-XIAP),用脂质体法转染至H9c2细胞,再进行缺氧复氧处理。免疫印迹(Western blot)、噻唑蓝(MTT)、流式细胞术检测细胞中XIAP、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved Caspase-3)、B细胞淋巴瘤/白血病2 X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病2(Bcl-2)的表达、细胞增殖、细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞中miR-200c-3p与XIAP的结合力。结果成功构建缺氧复氧H9c2细胞;与正常培养的H9c2细胞比较,H/R组H9c2细胞中miR-200c-3p表达明显上调,XIAP表达明显下调;抑制miR-200c-3p、过表达XIAP均可抑制H/R H9c2细胞的凋亡,下调cleaved Caspase-3、Bax,上调Bcl-2;miR-200c-3p可显著抑制XIAP 3′UTR野生型报告基因活性,并负向调控XIAP的表达;敲减XIAP可逆转抑制miR-200c-3p对H/R H9c2细胞的凋亡抑制作用。结论 miR-200c-3p可诱导缺氧复氧心肌细胞的凋亡,其机制与靶向XIAP有关,可为心血管疾病的治疗提供新靶点。     

缺氧后处理与氧自由基清除剂预处理对心肌细胞膜和线粒体Bcl-2和Bax表达的影响

目的观察缺氧后处理与氧自由基清除剂超氧化物歧化酶(SOD)联合过氧化氢酶(CAT)预处理,对心肌细胞膜和线粒体Bcl-2、Bax蛋白表达的影响,探讨两者调控心肌细胞凋亡的机制。方法建立乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,分对照组、缺氧/复氧组、缺氧后处理组及缺氧/复氧+SOD+CAT组。应用荧光探针测定心肌细胞线粒体活性氧水平,Hoechst染色及流式细胞仪检测心肌细胞凋亡,Wesiern blot法检测心肌细胞膜和线粒体Bcl-2、Bax蛋白表达。结果与对照组比较,缺氧/复氧组、缺氧后处理组、缺氧/复氧+SOD+CAT组细胞线粒体活性氧及细胞凋亡率明显升高(P<0.01);与缺氧/复氧组比较,缺氧后处理组、缺氧/复氧+SOD+CAT组细胞线粒体活性氧及细胞凋亡率明显降低(P<0.01);缺氧后处理组及缺氧/复氧+SOD+CAT组细胞膜和线粒体Bcl-2蛋白明显上调,Bax蛋白明显下调。结论缺氧后处理及氧自由基清除剂预处理抑制线粒体活性氧爆发,减轻缺氧/复氧再灌注心肌细胞凋亡,其抗凋亡可能机制与细胞膜和线粒体Bcl-2蛋白表达上调及Bax蛋白表达下调有关。     

MiR-499靶向HMGB1保护缺氧复氧心肌细胞损伤的分子机制探讨

目的研究miR-499对缺氧复氧心肌细胞H9c2损伤的影响,并探讨其作用机制。方法运用免疫印迹法(Western blot)检测缺氧复氧心肌细胞中高迁移率族蛋白1(HMGB1)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、免抗人单克隆抗体(Bax)、caspase-3的蛋白表达;将H/R+miR-con组(转染miRcon)、H/R+miR-499组(转染miR-499 mimics)、miR-con组(转染miR-con)、miR-499组(转染miR-499mimics)、anti-miR-con组(转染anti-miR-con)、anti-miR-499组(转染anti-miR-499)、H/R+si-con组(转染si-con)、H/R+si-HMGB1组(转染si-HMGB1)、H/R+miR-499+Ctrl组(miR-499 mimics和pcDNA3.1共转染)、H/R+miR-499+HMGB1组(miR-499 mimics和pcDNA3.1-HMGB1共转染),均以脂质体法转染至H9c2细胞;实时荧光定量聚合酶链锁反应(q RT-PCR)检测各组细胞中miR-499的表达;流式细胞术检测各组细胞的凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测各组细胞的荧光活性。结果与NC组相比,H/R组细胞中HMGB1蛋白表达显著升高,miR-499表达显著降低(P0.05);过表达miR-499或敲减HMGB1均可显著下调H/R H9c2细胞凋亡率,显著下调Bax、caspase-3的蛋白表达,上调Bcl-2的蛋白表达(P均0.05);过表达HMGB1可逆转miR-499对H/R H9c2细胞凋亡的抑制作用。结论 MiR-499可抑制缺氧复氧心肌细胞H9c2凋亡,保护心肌细胞,其机制与靶向HMGB1有关,将可为心脏病的治疗提供新靶点。     

脑通汤对缺氧/复氧大鼠海马神经元Bcl-2、Bax和Caspase-3表达的影响

目的探讨脑通汤对缺氧/复氧(H/R)大鼠海马神经元Bcl-2、Bax和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3表达的影响及防治海马神经元凋亡的作用机制。方法取培养9 d的海马神经元,随机分为正常细胞组、H/R模型组、正常血清组、脑通汤大、中、小剂量含药血清组。除正常细胞组以外,各组均缺氧24 h再复氧2 h造模。采用免疫组化检测海马神经元Bcl-2、Bax蛋白表达;实时荧光定量PCR法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3基因的表达。结果免疫组化显示:与正常细胞比较,模型组Bcl-2蛋白表达下降、Bax蛋白表达明显升高、Bcl-2/Bax比值下调(P0.05)。与模型组比较,脑通汤大、中、小剂量含药血清组Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值明显增高,Bax蛋白表达明显下降,呈剂量依赖性(P0.05);但正常血清组上述指标无显著变化(P0.05)。实时荧光定量PCR显示:Bcl-2、Bax mRNA趋势同蛋白表达一致,Caspase-3 mRNA趋势同Bax mRNA表达一致。结论脑通汤可通过上调Bcl-2蛋白及基因表达和Bcl-2/Bax比值,抑制Bax及Caspase-3的过度表达,从而抑制H/R海马神经元凋亡。     

miR-24-3 p靶向PDCD5减轻缺氧/复氧诱导心肌细胞损伤的作用机制

目的 研究miR-24-3p对缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞损伤的影响及潜在的分子机制.方法 qRT-PCR检测miR-24-3p和程序化细胞死亡因子(PDCD)5 RNA表达,Western印迹测定PDCD5蛋白、凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Cleaved-caspase-3的表达,测定心肌细胞H9c2 H/...     

莱菔硫烷对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:探讨莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法:H9C2心肌细胞随机分为3组:正常对照组、缺氧/复氧组(H/R组)和SFN预处理组(10μmol/L SFN预处理细胞12 h后,进行缺氧/复氧处理)。采用倒置显微镜观察各组细胞形态及凋亡程度,CCK8法检测各组H9C2心肌细胞存活率,Western blot法检测血红素氧化酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)、Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。结果:与正常对照组相比,H/R组和SFN预处理组心肌细胞存活率均降低(P均0.01),HO-1、NQO1、Bcl-2和Bax蛋白表达水平及Bcl-2/Bax均升高(P均0.01)。与H/R组相比,SFN预处理组的细胞生长状态较好,细胞存活率明显提高[(76.00±0.52)%对(55.73±0.43)%,P0.01],HO-1(3.24±0.01对1.86±0.01,P0.01)、NQO1(1.67±0.01对0.95±0.01,P0.01)和Bcl-2(0.70±0.00对0.48±0.01,P0.01)蛋白表达水平及Bcl-2/Bax(1.22±0.01对0.56±0.00,P0.01)均明显升高,Bax蛋白表达水平明显降低(0.57±0.00对0.85±0.01,P0.01)。结论:SFN对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤有保护作用,可能与促进HO-1、NQO1、Bcl-2蛋白表达,抑制Bax蛋白表达有关。     

circPRKCI靶向miR-217对缺氧/复氧诱导心肌细胞损伤的影响

目的探讨circPRKCI对缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞氧化应激、凋亡的影响及其对miR-217的调控作用。方法采用H/R诱导大鼠心肌细胞H9c2建立细胞损伤模型,pcDNA、pcDNA-circPRKCI、anti-miR-NC、anti-miR-217、pcDNA-circPRKCI与miR-NC、pcDNA-circPRKCI与miR-217 mimics分别转染至心肌细胞后进行H/R处理;采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)实验检测circPRKCI、miR-217表达量;采用试剂盒检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量;采用流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告实验检测circPRKCI与miR-217的靶向关系;免疫印迹法检测Bcl-2、Bax蛋白表达量。结果H/R诱导的H9c2细胞中circPRKCI表达水平降低(P<0.05),miR-217、MDA、凋亡率及Bax蛋白水平升高(P<0.05),SOD、GSH-Px活性及Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)。H/R诱导的H9c2细胞中转染pcDNA-circPRKCI或转染anti-miR-217后可降低MDA含量、凋亡率及Bax蛋白水平(P<0.05),提高SOD、GSH-Px活性及Bcl-2蛋白水平(P<0.05)。双荧光素酶实验显示circPRKCI可靶向结合miR-217;miR-217过表达可逆转circPRKCI过表达对H/R诱导的H9c2细胞氧化应激及凋亡的作用。结论circPRKCI过表达通过下调miR-217表达抑制氧化应激及其诱导的细胞凋亡,从而减轻心肌细胞氧化损伤。     

缺氧后处理对缺氧复氧心肌线粒体活性氧及细胞凋亡的影响

目的 观察缺氧后处理对缺氧复氧心肌线粒体活性氧及细胞膜和线粒体Bcl-2和Bax蛋白表达的影响,探讨其调控心肌细胞凋亡的机制.方法 构建大鼠乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤模型,将细胞分为对照组、缺氧/复氧纽(缺氧3h后复氧6h)、缺氧后处理组(缺氧3h后行复氧5min、缺氧5 min,反复3次,再复氧6 h).应用荧光酶标仪测定线粒体活性氧量,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡,Western blot检测细胞膜和线粒体Bcl-2和Bax蛋白的表达.结果 缺氧/复氧组和缺氧后处理组心肌细胞线粒体活性氧量较对照组显著升高(P＜0.01).缺氧后处理组心肌细胞线粒体平均荧光强度为30.74±1.88a.u./μg,显著低于缺氧/复氧组(63.17±2.75a.u./μg,P＜0.01),仍高于对照组(14.41±2.15a.u./μg).缺氧/复氧组和缺氧后处理组心肌细胞凋亡率较对照组显著升高(45.86％±3.29％和26.99％±3.35％比5.72％±1.63％,P＜0.01),缺氧后处理组低于缺氧/复氧组(P＜0.01).细胞膜和线粒体Bcl-2蛋白在缺氧后处理组显著上调,在缺氧/复氧组显著下调;Bax蛋白在缺氧后处理组显著下调,在缺氧/复氧组显著上调.结论 缺氧后处理抑制线粒体活性氧爆发,减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡,其抗凋亡机制可能与线粒体和细胞膜Bcl-2蛋白表达上调及Bax蛋白表达下调有关.     

MNK2通过激活cAMP/PKA-CREB通路促进小鼠心肌缺血再灌注损伤后修复功能及机制

目的 探讨丝裂原活化蛋白激酶相互作用激酶2(MNK2)是否能够抑制缺氧复氧诱导的小鼠心肌细胞凋亡并促进心脏修复,以及其相关机制。方法 构建心肌细胞缺氧复氧(H/R)体外模型,实验分为：H/R+空载体组、H/R+MNK2过表达组和H/R+siRNA-MNK2组。构建成年小鼠心脏缺血再灌注(I/R)损伤模型,实验分为：I/R+空载体组、I/R+MNK2过表达组。Western blot检测各组MNK2、p-MNK2以及Bax、Bcl-2等凋亡指标蛋白表达;TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡水平;心脏超声检测心脏功能差异。后续对H/R+MNK2过表达组和H/R+空载体组的原代心肌细胞进行RNA测序分析(RNA-seq),通过差异基因富集及京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析MNK2抗凋亡作用的相关机制,并验证筛选出cAMP/PKA-CREB信号通路的调控关系。结果 体外H/R模型及体内I/R模型中p-MNK2表达水平较对照组显著升高。体外实验中,MNK2过表达腺病毒转染显著增加心肌细胞中MNK2和p-MNK2蛋白表达水平,凋亡指标蛋白Bcl-2表达增加,Bax表达减少,心肌细胞凋亡水平下降...     

微小RNA-124-3p通过靶向抑制RIPK1的表达对缺氧/复氧心肌细胞损伤中的保护作用及其机制研究

目的探讨微小RNA-124-3p(miR-124-3p)调控受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)对心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的保护作用。方法大鼠心肌细胞随机分为Con组、H/R组、H/R+miR-124-3p组、H/R+miR-NC组、H/R+si-RIPK1组、H/R+siNC组、H/R+miR-124-3p+pcDNA组、H/R+miR-124-3p+pcDNA-RIPK1组。采用qRT-PCR法检测miR-124-3p与RIPK1 mRNA表达水平,Western blot法检测RIPK1蛋白表达情况,双荧光素酶报告基因检测验证miR-124-3p与RIPK1的靶向关系。流式细胞术检测细胞凋亡能力变化,Western blot法检测Bcl-2、Bax蛋白表达情况。检测乳酸脱氢酶(LDH)活性及丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量。结果 H/R组心肌细胞miR-124-3p表达水平显著低于Con组(P0.05),而RIPK1 mRNA及蛋白水平均显著升高(P0.05);H/R组心肌细胞LDH活性、MDA水平及Bax蛋白水平均显著高于Con组(P0.05),细胞凋亡率显著升高(P0.05),而SOD水平及Bcl-2蛋白水平均显著低于Con组(P0.05);miR-124-3p过表达与抑制RIPK1表达可降低细胞凋亡率、LDH活性、MDA水平及Bax蛋白水平,而提高SOD水平及Bcl-2蛋白水平;双荧光素酶基因检测结果证实RIPK1是miR-124-3p的靶基因;RIPK1过表达逆转了miR-124-3p过表达对H/R心肌细胞损伤的作用。结论MiR-124-3p过表达可通过下调RIPK1表达进而减轻心肌细胞H/R损伤进而对心肌细胞发挥保护作用。     

miR-92a在大鼠缺血再灌注心肌组织中的表达及对心肌细胞凋亡的影响

目的研究miR-92a在大鼠缺血再灌注(I/R)心肌组织中的表达及对心肌细胞凋亡的影响。方法将雄性SD大鼠随机分为I/R组和假手术组,采用夹闭冠状动脉法将I/R组大鼠制备成心肌缺血再灌注模型,采用新生SD乳鼠制备原代心肌细胞并制备缺氧/复氧(H/R)细胞模型,以Lipofectimane2000脂质体干扰心肌细胞中miR-92a的表达,以定量PCR检测miR-92a在心肌组织中的表达,流式细胞仪检测miR-92a对心肌细胞凋亡的影响,Western印迹检测凋亡相关蛋白淋巴瘤/白血病(Bcl)-2和活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3的表达。结果 miR-92a在I/R心肌组织中的表达与假手术组相比显著升高(P0. 05),在H/R组心肌细胞中的表达也显著高于常氧组细胞(P0. 05)。与对照组(未进行转染)相比,miR-92a NC组(转染miR-92a阴性对照)细胞中miR-92a的相对表达差异无统计学意义(P0. 05),而miR-92a inhibitor组(转染miR-92a抑制剂)细胞中miR-92a的相对表达量显著升高(P0. 05)。与对照组相比,I/R组细胞凋亡率显著升高(P0. 05); I/R+miR-92a inhibitor组细胞凋亡率较I/R组显著降低(P0. 05)。与对照组相比,I/R组细胞中Bcl-2蛋白的相对表达量显著降低(P0. 05),酶切Caspase-3蛋白的相对表达量显著升高(P0. 05);与H/R组相比,I/R+miR-92a inhibitor组细胞中Bcl-2蛋白的相对表达量显著升高(P0. 05),酶切Caspase-3蛋白的相对表达量显著降低(P0. 05)。结论 miR-92a在缺血再灌注后心肌组织和细胞中呈现高表达,下调miR-92a表达后能够减弱缺血再灌注引起的细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bcl-2和酶切Caspase-3蛋白的表达有关。     

原花青素对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关基因蛋白表达的影响

目的:观察原花青素对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡相关基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B型白细胞/2型淋巴细胞样蛋白(Bcl-2)和凋亡相关基因Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达的影响,探讨原花青素在大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡中发挥的作用及可能的调控机制。方法:40只雄性SD大鼠随机等分为4组,即正常组,模型组,原花青素低剂量组[原花青素50 mg/(kg·d)],原花青素高剂量组[原花青素100 mg/(kg·d)],灌胃给药,每天1次,连续2周。末次给药后结扎冠状动脉左前降支(LAD)30 min再灌注120 min,建立大鼠心肌缺血再灌注模型。测定肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性、心肌梗死面积;用Western blot检测各组细胞凋亡相关基因Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达;原位末端转移酶标记(TUNEL)法检测心肌细胞凋亡。结果:与正常组比较,模型组大鼠CK-MB活性显著增强、心肌梗死面积增大,心肌细胞凋亡指数升高,Caspase-3、Bax蛋白表达增强,Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax降低(P0.05);与模型组比较,原花青素高、低剂量组大鼠CK-MB活性显著减弱、心肌梗死面积减小,细胞凋亡指数显著降低,Caspase-3、Bax蛋白表达显著减弱,Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax增加(P0.05)。结论:原花青素可拮抗缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡,其机制可能与Caspase-3、Bax蛋白表达降低,Bcl-2表达升高,Bcl-2/Bax比例增加有关。     

lncRNA NEAT1调控miR-206对缺氧复氧大鼠心肌细胞氧化应激损伤和凋亡的影响

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)NEAT1调控miR-206对缺氧复氧诱导的心肌细胞氧化应激损伤和凋亡的影响和机制。方法 体外培养H9c2心肌细胞,构建心肌细胞缺氧复氧模型。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测缺氧复氧诱导后lncRNA NEAT1和miR-206的表达水平。将lncRNA NEAT1小干扰RNA(si-lncRNA NEAT1)、miR-206模拟物(miR-206 mimics)分别转染H9c2细胞,缺氧复氧诱导后,检测细胞中丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)含量以及细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved Caspase-3)和cleaved Caspase-9蛋白表达。利用荧光素酶报告基因实验以及RT-qPCR验证lncRNA NEAT1和miR-206的靶向结合关系。结果 缺氧复氧诱导后H9c2细胞中lncRNA NEAT1的表达显著升高,miR-206的表达显著降低(P＜0.05)。转染si-lncRNA NEAT1或miR-206 mimics处理缺氧复氧H9c2细胞,细胞存活率显著升高,MDA、ROS含量以及LDH活性显著降低,cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9蛋白的表达显著降低,细胞凋亡率显著降低(P＜0.05)。lncRNA NEAT1靶向miR-206并负调控miR-206表达。抑制miR-206部分逆转沉默lncRNA NEAT1对缺氧复氧诱导的心肌细胞氧化损伤和凋亡的影响(P＜0.05)。结论 沉默lncRNA NEAT1通过上调miR-206可减轻缺氧复氧诱导的心肌细胞氧化应激损伤和细胞凋亡,进而发挥心肌保护作用。     

过表达Bax抑制剂1通过抑制线粒体通透性转换孔开放及细胞凋亡减轻心肌缺血再灌注损伤

目的探讨过表达Bax抑制剂1(BI-1)基因对缺血再灌注损伤的影响及其相关机制。方法 30只SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组(I/R组)、对照的腺病毒载体组(Ad-EGFP组)、过表达BI-1的腺病毒载体组(Ad-BI-1组)、环孢素A(CsA组)。建立大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)模型后,TTC染色观察各组大鼠心肌梗死面积,TUNEL染色观察心肌细胞凋亡情况,电镜下观察心肌细胞超微结构变化,qRT-PCR检测各组大鼠心肌组织中BI-1 mRNA表达。分离培养乳鼠心肌细胞并按细胞处理方式的不同将其分为对照组、缺氧复氧组(H/R组)、对照的腺病毒载体组(Ad-EGFP组)、过表达BI-1的腺病毒载体组(Ad-BI-1组)、环孢素A(CsA组),免疫荧光法检测BI-1的亚细胞定位,Western blot检测各组细胞中BI-1蛋白表达,Calcein-AM法检测各组心肌细胞线粒体通透性转换孔(MPTP)开放水平;应用Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、细胞色素C(CytC)及Caspase-3、Caspase-9的表达。结果缺血再灌注后,与假手术组相比,I/R组、Ad-EGFP组、Ad-BI-1组、CsA组大鼠心肌梗死面积显著增加,心肌细胞凋亡数明显增多,心肌线粒体结构受损显著加重(P0.05);而与I/R组或Ad-EGFP组相比,Ad-BI-1组、CsA组大鼠的上述指标明显改善(P0.05)。qRT-PCR结果显示,与假手术组相比,I/R组、Ad-EGFP组、CsA组中BI-1 mRNA表达均显著降低,而Ad-BI-1组BI-1 mRNA表达明显增加(P0.05)。成功分离乳鼠心肌细胞,免疫细胞结果显示BI-1主要定位于心肌细胞内质网;与对照组相比,H/R组、Ad-EGFP组、Ad-BI-1组及CsA组的Calcein-AM荧光强度显著降低(P0.05),而Ad-BI-1组及CsA组较H/R组细胞明显增加(P0.05);Western blot结果显示,H/R组、Ad-EGFP组、CsA组中BI-1蛋白表达较对照组显著降低(P0.05),而Ad-BI-1组BI-1蛋白表达明显增加(P0.05)。此外,在大鼠心肌组织中,与假手术组相比,I/R组、Ad-EGFP组、Ad-BI-1组与CsA组大鼠的Bcl-2/Bax比值均显著降低(P0.05),凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9表达均显著增加(P0.05),而Ad-BI-1组及CsA组大鼠的Bcl-2/Bax比值明显高于I/R组(P0.05),Caspase-3和Caspase-9蛋白表达亦较I/R组明显降低(P0.05)。CytC表达结果显示,在心肌组织总蛋白中,与假手术组相比,I/R组、Ad-EGFP组、Ad-BI-1组及CsA组大鼠中CytC表达均显著升高(P0.05),且后四组之间差异无统计学意义(P0.05);但在心肌细胞线粒体中,I/R组、Ad-EGFP组、Ad-BI-1组及CsA组大鼠的CytC表达均显著降低(P0.05),且Ad-BI-1组及CsA组大鼠较I/R组明显增加(P0.05)。结论过表达BI-1基因能够缩小MIRI大鼠的心肌梗死面积,减轻心肌细胞的凋亡并改善线粒体结构及功能损伤,其作用机制可能是过表达BI-1通过改变Bcl-2/Bax比值,抑制MPTP的开放,减少细胞CytC的释放,降低凋亡蛋白Caspase-3及Caspase-9的活化而发挥上述作用。     

刺囊酸对缺氧复氧诱导心肌细胞凋亡相关基因表达的影响

目的 研究刺囊酸预处理对原代培养的SD乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤诱导的心肌细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax及聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP 89 kDa)表达的影响.方法 实验随机分为6组:对照组,缺氧复氧损伤组,缺氧预处理组及低、中、高剂量刺囊酸组(0.5 μmol/L、5μmol/L和50 μmol/L),分别予以缺氧3h后再复氧2h,检测细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)活性,Western Blot杂交法检测心肌细胞Bcl-2、Bax及PARP(89 kDa)蛋白表达变化.结果 与对照组比较,缺氧复氧损伤组心肌细胞Bcl-2蛋白表达显著低于对照组(P＜0.01),Bax蛋白及PARP(89 kDa)表达显著高于对照组(P＜0.01),细胞存活率明显低于对照组(P＜0.05).与缺氧复氧损伤组比较,不同剂量的刺囊酸预处理能显著提高细胞存活率,降低LDH活性,呈剂量依赖性;中剂量刺囊酸显著增加Bcl-2蛋白表达(P＜0.05),抑制Bax及PARP(89 kDa)蛋白表达(P＜0.05).结论 刺囊酸预处理可通过上调Bcl-2蛋白表达,抑制PARP(89 kDa)及Bax蛋白表达,抑制细胞凋亡,对抗心肌细胞缺氧复氧损伤.