甘草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因多态性对其编码酶催化效率的影响

目的:利用GC-MS方法分析甘草不同3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因型表达蛋白的催化效率,为揭示甘草HMGR多态性在优质甘草药材形成中的作用奠定基础.方法:以从甘草中克隆的4种HMGR基因突变型构建表达载体,转化Escherichia coli BL21,进行诱导表达、检测、纯化及体外酶促反应,采用TLC及GC-MS对反应产物进行定性及定量分析.结果:L/V型突变(-HSL,-HSV)催化活性近似,GA插入型突变(GALLV,GALSV)催化活性近似,但插入型突变的催化活性显著高于前者,是前者的2倍左右.结论:甘草功能基因HMGR基因多态性可能是甘草优质药材形成的分子基础.     

一个新的丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶3基因的克隆及其表达分析

目的:对丹参3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3methylglutary CoA reductase,HMGR3)基因的cDNA克隆并进行序列分析。方法:利用丹参转录组文库克隆一种新的丹参次生代谢途径上的功能基因;利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找开放阅读框,Clustal W比对丹参中已有的3条HMGR的氨基酸序列,构建系统进化树,QRT-PCR检测丹参HMGR3基因在根、茎、叶中的mRNA水平,并检测Ag+诱导子诱导后丹参毛状根中该基因的转录水平。结果:克隆得到一个新的丹参HMGR3基因,该基因ORF全长1 692 bp,编码563个氨基酸,具有HMGR基因家族的特征序列,与SmHMGR1和SmH-MGR2分别具有75.04%,80.64%的同源性,QRT-PCR分析表明该基因在丹参根茎叶中均有表达,在叶中表达量最高,Ag+诱导24 h时mRNA水平达到最高值。结论:首次克隆得到了1条新的丹参HMGR家族基因SmHMGR3,这一结果为进一步研究丹参次生代谢途径提供了新的思路和靶点。     

阿托伐他汀对压力负荷增加引起大鼠心肌肥厚的影响

 目的　观察他汀类药物阿托伐他汀对心肌肥厚大鼠心肌及心肌炎性细胞因子的影响 ,探讨该类药物影响心肌肥厚可能涉及的作用机制。方法　用RT-PCR法和免疫组化法检测心肌细胞因子白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β) ,心调理素-1(car diotropin-1,CT-1)的表达,并观察心脏的病理学改变。结果　正常大鼠心肌无炎性细胞因子表达 ,压力负荷增加引起大鼠左心室心肌肥厚时 ,心肌炎性细胞因子IL-1β,CT-1的mRNA和蛋白质表达增加 ,阿托伐他汀可以降低左心室肥厚大鼠心肌IL-1β,CT-1的mRNA和蛋白质的表达 ,并使心脏重/体重值 ,左心室壁平均厚度 ,心肌细胞平均直径均明显降低。结论　阿托伐他汀可能通过发挥抗炎作用抑制压力负荷增加引起的心肌肥厚。     

白术精提物对代谢性高脂血症大鼠的药效及机制研究

高脂血症是导致冠心病、动脉粥样硬化的主要因素,高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)是衡量血脂水平的主要指标,但目前尚没有明显升高HDL-C的药物.实验室既往研究发现白术精提物能显著升高高血脂大鼠的HDL-C水平.该研究用高糖高脂复合酒饮方法建立代谢性高脂血症大鼠,研究白术精提物对大鼠血脂的影响及降脂机制.结果表明不同剂量的白术精提物能降低高脂大鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、胆固醇酰基转移酶(ACAT),升高卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)和HDL-C,其中100 mg·kg^-1剂量组可升高HDL-C约50%;肝组织中羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶),TC,TG显著降低.提示白术精提物能有效调节高脂大鼠血脂紊乱,尤其对升高HDL-C有显著疗效,其作用机制可能与抑制肝脏中HMG-CoA还原酶来减少胆固醇合成,调节体内LCAT,ACAT水平来增加脂质代谢转运有关.     

茅苍术HMGR基因保守区片段的克隆与分析

目的对茅苍术3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR)进行基因克隆及序列分析。方法采用cDNA末端快速扩增技术,以茅苍术嫩叶总RNA的cDNA为模板扩增茅苍术HMGR基因的保守区片断。结果序列分析表明,所克隆的cDNA保守区序列长度为458bp,而且同时得到了两个核苷酸序列的同源性为84.28%的片段,相应的氨基酸序列的同源性为92.11%。分别命名为HMGRcr1,HMGR-cr2。推断这可能是该基因家族中的两个成员。而且同源序列比对发现,推断的HMGRcr1氨基酸序列和HMGRcr2氨基酸序列与其他植物都有较高的同源性。结论首次分离并报道了茅苍术HMGRcDNA克隆,为进一步研究萜类生物合成机制及其在提高植物药用价值方面提供理论依据。     

山楂中抑制HMG-CoA还原酶的活性成分及其协同效应的研究

目的:研究山楂降血脂活性成分及作用机制。方法:以HMG-CoA还原酶活性为靶标,采用大孔树脂和硅胶等进行分离纯化,筛选HMG-CoA还原酶抑制剂。结果:获得4个对HMG-CoA还原酶活性具有较强抑制作用的化合物,为槲皮素、金丝桃苷、芦丁和绿原酸,4个化合物抑制率之和为50.01%,复配后的抑制活性为79.48%。结论:槲皮素和金丝桃苷为山楂中抑制HMG-CoA还原酶活性的主要活性成分,且单体之间存在协同作用。     

白桦BpHMGR基因的结构及表达模式分析

目的研究白桦Betula platyphylla 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-Co A reductase,Bp HMGR)全长基因结构特征及编码蛋白性质,揭示其节律表达模式以及对外源NO信号分子的响应机制。方法通过RACE技术克隆白桦Bp HMGR基因,应用生物信息学软件对Bp HMGR及其编码蛋白进行详细分析,利用实时荧光定量PCR定量分析Bp HMGR基因在昼夜节律变化中的表达模式。根据Bp HMGR氨基酸序列构建系统进化树,分析昼夜节律以及外源NO对白桦叶片中Bp HMGR转录水平的影响。结果 Bp HMGR基因全长1 764 bp,包含完整开放阅读框,已上传至NCBI,并获得登录号KJ452334,其编码蛋白由587 aa组成。白桦Bp HMGR基因与大豆(XP_003519474.1)、葡萄(XP_002275827.1)、苜蓿(XP_003617066.1)亲缘关系较近。结论 Bp HMGR随昼夜周期变化呈现出节律表达特性,在夜晚21:00时达到峰值。初步揭示了外源NO能诱导白桦细胞内三萜代谢途径的关键酶Bp HMGR基因上调表达,进而促进三萜产物齐墩果酸的合成。     

阳春砂3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的克隆及分析

目的 克隆阳春砂萜类生物合成途径上游关键酶--3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR)(EC:1.1.1.34)的编码基因;分析基因的功能及其在阳春砂不同组织中的表达.方法 用基于RT-PCR的方法从阳春砂叶片中获得编码HMGR的cDNA全长序列,克隆基因编码区;用生物信息学的方法对其编码蛋白进行相似性检索和功能分析;用半定量RT-PCR法比较基因在阳春砂不同组织中的表达差异.结果 获得了全长2 023 bp的编码阳春砂HMGR的cDNA序列,命名为AvHMGR(GenBank登记号:FJ455511).AvHMGR编码的蛋白与其他植物来源的HMGR有很高相似性,含有NADPH结合基序和底物HMG-CoA结合基序,N-端有两个跨膜结构域.保守功能结构域的分析结果表明AvHMGR属于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶家族.AvHMGR在包括茎、根、果皮和种子团的广泛组织中表达,且在这些组织中的表达量均高于在叶片中的表达.结论 从阳春砂中克隆了AvHMGR基因,为进一步鉴定基因功能、探明阳春砂萜类生物合成的基因调控机制打下基础.     

鱼腥草HMGR基因cDNA克隆、差异表达及蛋白质结构分析

目的克隆鱼腥草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因并分析其差异表达。方法采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法获得HMGR基因cDNA序列并对HMGR蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析,并预测该蛋白功能;利用RT-PCR方法检测HMGR基因在鱼腥草的地下茎、地上茎、叶、花中的表达情况。结果克隆获得的HMGR基因cDNA全长为1 626 bp,编码541个氨基酸。生物信息学预测HMGR蛋白含2个跨膜区,不含信号肽。HMGR基因主要在鱼腥草的花中表达,其他器官中表达相对较低,地下茎中表达量最低。结论首次从鱼腥草中克隆了HMGR基因,为进一步阐明该基因在鱼腥草萜类化合物代谢途径中的作用奠定基础。     

3种不同植物来源的tHMGR对于酿酒酵母MVA代谢流通量的比较研究北大核心CSCD

该研究对来自甘草Glycyrrhiza uralensis、黄花蒿Artemisia annua和拟南芥Arabidopsis thaliana的HMGR基因编码蛋白分别进行生物信息学分析,发现GuHMGR和AaHMGR蛋白各包含2个跨膜区,AtHMGR蛋白具有3个跨膜区。且GuHMGR、AaHMGR和AtHMGR3个蛋白均具有HMGR催化作用的活性中心结构域。将甘草、黄花蒿和拟南芥的3个截短HMGR基因(tHMGRs)连接到pYES3载体上,成功构建pYES3-tGuHMGR、pYES3-tAaHMGR、pYES3-tAtHMGR质粒。将对照pYES3质粒和重组质粒pYES3-tGuHMGR、pYES3-tAaHMGR、pYES3-tAtHMGR分别转化酿酒酵母Cen.pk2-1D,成功构建酿酒酵母菌株Y0、Y1、Y2、Y3。挑取阳性单克隆,菌株发酵后通过GC-MS检测其鲨烯、羊毛甾醇、麦角固醇的含量。采用实时荧光定量PCR检测tGuHMGR、tAaHMGR、tAtHMGR分别在菌株Y1、Y2、Y3中的相对表达情况。结果显示,过表达tAaHMGR的菌株,其鲨烯的产量以及萜类前体物质鲨烯、麦角固醇和羊毛甾醇的总产量都是最高的。实时荧光定量PCR结果发现,tAaHMGR在菌株中的相对表达量比tGuHMGR高,与菌株发酵结果一致。该研究通过比较3种不同植物来源的tHMGR对于酿酒酵母MVA途径代谢通量的影响,挑选出一个较优的tHMGR,可为今后构建酿酒酵母底盘细胞,在提高其鲨烯及萜类前体物质积累的优势基因选择上提供一些参考。     

柴胡皂苷合成途径中三个关键酶基因片段的克隆与序列分析

本文以北柴胡幼嫩根的总RNA为模板，通过RT—PCR方法，克隆出3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coeflzyme A reductase，HMGR）、异戊烯基焦磷酸异构酶（isopentenyl diphosphate isomerase，IPPI）和法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，FPS）基因的cDNA片断，大小分别为470bp、532bp、466bp，分别编码157、177、155个氨基酸多肽。提交到Gen—Bank上，得到登陆号分别为：HMGR（EU400217）、IPPI（EU400218）、FPS（EU400219）。NCBI在线blast结果表明，推断的北柴胡HMGR、IPPI和FPS基因的氨基酸序列分别与杜仲、三岛柴胡和雷公藤的一致性最高，分别为93％、99％、97％。对HMGR基因和FPS基因进行特征性保守域分析，结果显示，推断的HMGR氨基酸序列存在两个NADPH结合基序，FPS存在三个特征性保守序列：DDIMD、GQMID和KL。构建的植物IPPI的分子进化树表明，北柴胡IPPI基因与伞形科植物（胡萝卜和三岛柴胡）亲缘关系最近，与单子叶植物（玉米和水稻）亲缘关系较远。本文首次分离报道了北柴胡柴胡皂苷合成途径中三个关键酶基因（HMGR、IPPI和FPS）cDNA的克隆，新获得的基因片段序列为进一步克隆全序列和了解调控柴胡皂苷的生物合成奠定了基础。     

柴胡皂苷合成途径中三个关键酶基因片段的克隆与序列分析

本文以北柴胡幼嫩根的总RNA为模板,通过RT-PCR方法,克隆出3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase,HMGR)、异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IPPI)和法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)基因的cDNA片断,大小分别为470bp、532bp、466bp,分别编码157、177、155个氨基酸多肽。提交到Gen- Bank上,得到登陆号分别为:HMGR(EU400217)、IPPI(EU400218)、FPS(EU400219)。NCBI在线blast结果表明,推断的北柴胡HMGR、IPPI和FPS基因的氨基酸序列分别与杜仲、三岛柴胡和雷公藤的一致性最高,分别为93%、99%、97%。对HMGR基因和FPS基因进行特征性保守域分析,结果显示,推断的HMGR氨基酸序列存在两个NADPH结合基序,FPS存在三个特征性保守序列:DDIMD、GQMID和KL。构建的植物IPPI的分子进化树表明,北柴胡IPPI基因与...     

滇龙胆3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因克隆、表达及分析

目的:从药用植物滇龙胆中克隆得到3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase,HMGR)基因的c DNA全长,构建原核表达载体使其在大肠埃希菌中表达,对其进行定量表达并进行生物信息学分析。方法:利用PCR扩增克隆得到滇龙胆HMGR基因c DNA全长。构建p EASY-E1-HMGR表达载体,IPTG诱导表达。利用生物信息学方法分析克隆到的c DNA序列并预测结构和功能。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分析滇龙胆根、茎、叶在4个不同发育时期的HMGR表达情况。结果:克隆出两组HMGR基因,其中一组HMGR c DNA全长1 747 bp,开放阅读框长1 697 bp,编码565个氨基酸,定名为GRHMGR-1;另一组HMGR c DNA全长1 731 bp,开放阅读框长1 572 bp,编码523个氨基酸,定名为GRHMGR-2。SDS-PAGE显示重组质粒成功表达目的蛋白。Blastp发现,GRHMGR-1,GRHMGR-2与同属植物黄龙胆、秦艽的亲缘关系最为相近。结构分析显示都含有2个HMG-CoA结合位点,2个NADPH结合位点,预测都定位于内质网上。HMGR在滇龙胆根、茎、叶这4个不同发育期均有表达,表达量最高的是叶。结论:首次从滇龙胆中克隆到可能编码HMGR酶的基因,可为深入探讨滇龙胆龙胆苦苷生物合成奠定基础。     

甘草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因多态性与甘草酸含量的相关性分析

目的:揭示甘草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因的多态性,并阐述HMGR基因多态性与甘草酸含量的相关性.方法:以甘草酸含量差异显著的甘草个体为材料,通过RT-PCR法扩增其HMGR基因编码区;与载体pMD19-T连接后克隆测序;通过多重比对进行HMGR基因多态性分析,及与甘草酸含量之间的关联分析.结果:HMGR基因编码区多态性包括整码突变、碱基置换突变、拷贝数多态性及等位基因杂合;HMGR编码氨基酸序列中存在以下4种类型变异,即-HSL,-HSV,GALLV,GALSV,其中-HSV型为甘草中普遍存在类型,-HSL型为甘草酸低含量甘草的特有类型,GALSV型为甘草酸高含量甘草特有类型.结论:甘草HMGR基因编码区具有丰富的多态性,和甘草酸含量之间具有相关性.     

何首乌二苯乙烯苷降血脂作用机理研究

目的:探讨何首乌二苯乙烯苷(TSG)调节胆固醇代谢作用机制.方法:体外培养Bel-7402细胞株,待细胞长满80%后无血清培养基饥饿细胞24h,分别加入1、10、100μM的二苯乙烯苷及10μM的阿托伐他汀,RT-PCR检测给药24h后细胞内低密度脂蛋白受体(LDLR)、β-羟β-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMCCR)、胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)、酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT)的基因表达.结果:和空白对照组相比,二苯乙烯苷组能明显升高肝细胞表面LDLR的表达(P<0.05,P<0.01),二苯乙烯苷中、高剂量组与阳性药组相比无明显差异(P>0.05);二苯乙烯苷组与阳性药组均增加细胞HMGCOAR表达,各组之间无明显差异;阿托伐他汀组降低ACAT的表达(P<0.05),二苯乙烯苷组则无明显作用;阿托伐他汀组Cyp7A1表达高于二苯乙烯苷组,与对照组相比无显著性差异.结论:二苯乙烯苷可能是通过抑制细胞内胆固醇的合成及升高低密度脂蛋白受体的表达而起到降血脂作用.     

接骨草HMGR基因cDNA克隆、不同器官中的差异表达及生物信息学分析

目的克隆接骨草Sambucus chinensis 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因并分析其差异表达。方法采用RT-PCR方法获得HMGR基因c DNA序列,并对HMGR蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三级结构预测分析,并预测该蛋白功能;利用实时荧光定量PCR方法检测HMGR基因在接骨草的根状茎、地上茎、叶、花中的表达情况。结果克隆获得的HMGR基因c DNA全长为1 626 bp,编码593个氨基酸。生物信息学预测HMGR蛋白含2个跨膜区,不含信号肽。HMGR基因主要在接骨草的花和地上茎中表达较高,其他器官表达相对较低。结论首次从接骨草中克隆了HMGR基因,为进一步阐明该基因在接骨草萜类化合物代谢途径中的重要作用奠定基础。     

球药隔重楼HMGR功能基因保守区序列的克隆与分析

目的研究球药隔重楼次生代谢产物甾体皂苷甲羟戊酸合成途径的一个关键酶即3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)的基因,有助于对活性物质的合成进行调控,从而提高产量。方法比较NCBI上公布的11种植物11条HMGR基因mRNA的同源保守区域,设计简并引物,利用RT-PCR技术,以球药隔重楼新鲜茎总RNA反转录的cDNA为模板成功扩增出404 bp的保守区基因片段。结果序列分析表明,球药隔重楼HMGR基因片段与其他7种植物的一致性达到76%～81%,球药隔重楼HMGR氨基酸片段与其他植物有较高的同源性,经Genbank查询为一新的cDNA。结论通过蛋白质特征区、保守区以及进化树分析,初步确定该基因为HMGR基因,这是首次从药用植物球药隔重楼中克隆得到甲羟戊酸途径关键酶HMGR的基因片段,也是百合科植物首次获得的HMGR基因。     

建泽泻HMGR基因保守区片段克隆与组织分布研究

目的:对建泽泻三萜类成分生物合成关键酶HMGR基因保守区片段进行克隆与组织分布研究。方法:以建泽泻总RNA为模板,通过RT-PCR方法,克隆HMGR基因的保守区片段,并用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)检测HMGR基因在不同器官中的表达情况。结果:所克隆的建泽泻HMGR基因保守区序列长度为458 bp(Gen-Bank注册号为HQ913638),与药用植物黄花蒿、柴胡、杜仲、丹参的同源性分别达到86.8%、88.2%、88.2%、85.5%,QRT-PCR结果显示HMGR基因在建泽泻各器官中均有表达,其中叶片表达量较高,块茎、根、叶柄表达量相对较低。结论:首次分离并报道了建泽泻HMGR基因保守区片段克隆及其组织分布,为泽泻三萜类成分生物合成途径的阐明和生物工程应用提供科学依据。     

陆英HMGS基因cDNA克隆、不同器官中的差异表达及生物信息学分析

目的克隆陆英Sambucus chinensis 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(HMGS)基因并分析其差异表达。方法采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法获得HMGS基因c DNA序列并对HMGS蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析,并预测了该蛋白功能;利用RT-PCR方法检测了HMGS基因在陆英的根状茎、地上茎、叶、花中的表达情况。结果克隆获得的HMGS基因c DNA全长为1 401 bp,编码466个氨基酸。生物信息学预测HMGS蛋白无跨膜区,不含信号肽。HMGS基因主要在陆英的花和根状茎中表达较高,在叶中表达相对较低。结论首次从陆英中克隆了HMGS基因,为进一步阐明该基因在陆英萜类化合物代谢途径中的重要作用奠定基础。     

蜜桑白皮的体内降脂作用研究＊

目的 考察蜜桑白皮的体内降脂减肥作用。方法 建立小鼠高脂肥胖模型，随机分为正常对照组、肥胖模型组、蜜桑白皮灌胃组、阳性对照组，记录小鼠体重，测定肾周脂肪指数和附睾脂肪指数，及血清中总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平。此外，通过Autodock模拟蜜桑白皮中主要成分与脂质代谢关键酶——羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）及羧酸酯酶I（hCES1A）的相互作用，预测其调节血脂作用机制。结果 蜜桑白皮组可显著减缓小鼠体重增加，并有效降低LDL-C水平，其效果优于阳性奥利司他药物组。经Autodock分子对接发现，主要成分桑色素及桑根酮C可分别通过氢键与HMGR的催化活性中心Asp-767、及hCES1A关键氨基酸Cys-389产生较强的相互作用。结论 蜜桑白皮具有良好的减肥降脂作用。