原花青素交联牛心包材料的研究

本研究针对天然交联剂原花青素处理牛心包材料的性能进行研究.采用原花青素交联牛心包组织,制备人工生物心脏瓣膜材料,并对其交联特性、力学特性、抗酶降解性能、亲疏水性能、细胞毒性试验以及溶血试验等进行分析.结果显示:原花青素或戊二醛处理的牛心包组织变性温度、力学特性、表面亲水性能和抗酶降解能力都明显提高;与传统交联剂戊二醛相比组织稳定性、亲水性能和抗酶降解能力未见显著性差异,但是最大断裂强度显著提高(原花青素交联组织最大断裂强度(13.863 0 MPa)明显高于戊二醛交联组织(10.784 2 MPa);溶血试验结果表明原花青素处理固定组织的溶血率(2.61%)远低于戊二醛处理的组织(12.54%);细胞毒性试验结果表明原花青素交联组织在1、3、5 d的细胞增殖率分别为76.19%、88.96%、100.12%,而戊二醛在相同的时间点的细胞增殖率分别为63.15%、57.28%、48.74%.原花青素交联的瓣膜材料组织结构稳定、亲水性好、毒性小且能维持较好的力学性能,作为人工生物瓣膜材料具有很好的研究前景.     

京尼平交联大鼠肾去细胞生物支架提高支架生物学性能的实验研究

目的　通过京尼平交联大鼠肾去细胞生物支架,提高支架的生物学性能。 方法　取250 g左右的健康SD大鼠80只,分为正常组、未交联支架组、戊二醛交联支架组和京尼平交联支架组。游离大鼠肾、肾动脉,连接蠕动泵,经PBS灌注去血后得到的肾作为正常组。其余大鼠肾依次灌入肝素化PBS溶液、1% TritonX-100、1%十二烷基硫酸钠（SDS）、去离子水,完成大鼠肾去细胞生物支架制备。戊二醛交联支架组继续灌入0.625%戊二醛（GA）1500 mL;京尼平交联支架组浸入0.5%的京尼平溶液于37 ℃恒温箱中行化学交联24 h;未经戊二醛或京尼平交联的肾去细胞支架作为未交联支架组。对4组肾分别作HE、Masson、免疫荧光染色及电子显微镜扫描,观察支架组织形态学及超微结构改变;力学拉伸试验检测机械力学性能。 结果　SD大鼠肾支架经京尼平交联后,HE、Masson染色显示胶原纤维排列更加紧密有序,肾小球处的纤维呈聚集状,Collagen I和 Collagen IV荧光染色增强,电镜扫描可见交联后的去细胞支架内蜂窝状孔洞结构更加立体,并可见典型的肾小球龛样结构轮廓更加清晰;交联组肾弹性模量较支架组明显增强。 结论　京尼平交联大鼠肾支架能提高支架的生物学性能有助于为后期细胞植入和器官再生。     

牛心包脱细胞支架的制备研究

组织工程支架材料是构建组织工程器官或组织的重要基础,天然脱细胞基质由于具有其优良特性而成为理想的支架材料。本研究采用胰酶去污剂法、冻融去污剂24 h法、冻融去污剂48 h法、冻融核酸酶法和去污剂核酸酶法等5种方法对牛心包组织进行脱细胞处理。通过HE染色、扫描电镜观察、含水量检测、力学检测、DNA含量检测和细胞毒性试验,判断不同脱细胞方法的脱细胞效果及其对牛心包基质的影响,从而筛选出对牛心包进行脱细胞的最佳方法。结果显示冻融后去污剂24 h法可以完全脱除牛心包的细胞成分,同时细胞外基质和力学特性保持完好,细胞毒性低,且经济实惠,是制备牛心包脱细胞支架的较好方法。     

京尼平交联3D打印胶原/壳聚糖支架的表征北大核心

背景:胶原/壳聚糖支架需交联才能达到相应力学性能,有研究表示调节交联剂浓度可以在一定范围内调控支架的理化性能。目的:探究京尼平浓度对胶原/壳聚糖支架理化性能的影响,制备理化性能可调节的组织工程支架。方法:将胶原和壳聚糖粉末分别溶于弱酸后混合均匀,作为打印墨水,利用生物3D打印机低温打印胶原支架与胶原/壳聚糖支架,经冻干、中和处理后分别以1,3,5 mmol/L的京尼平进行交联。检测各组支架的表观结构稳定性、抗拉能力、溶胀性能、降解性能与生物相容性。结果与结论:①将支架在PBS中浸泡3 d后,对比未交联的冻干支架,交联后胶原支架表面维持规则的孔结构,但是支架出现明显变形;交联后胶原/壳聚糖支架表面结构规则,仅1 mmol/L京尼平交联的胶原/壳聚糖支架存在轻微变形。②随着京尼平浓度的增加,各组支架的力学性能增加,并且对应交联浓度下的胶原/壳聚糖支架力学性能好于胶原支架。③随着京尼平浓度的增加,胶原支架的溶胀率下降,胶原/壳聚糖支架的溶胀率无明显变化。④浸泡于胶原酶溶液中后,不同浓度京尼平交联的胶原支架在1 h内被完全降解,胶原/壳聚糖支架的降解速率随京尼平浓度的增加而降低,均呈现先快速后平缓的趋势。⑤将骨髓间充质干细胞接种于各组交联支架3 d后,1,3 mmol/L京尼平交联的胶原/壳聚糖支架(或胶原支架)上的细胞数量明显多于5 mmol/L京尼平交联的胶原/壳聚糖支架(P<0.05)。⑥结果表明,京尼平可在一定范围调节胶原/壳聚糖支架理化性能,其中3 mmol/L京尼平交联的胶原/壳聚糖支架具有较好的力学性能、抗酶解能力与生物相容性。     

京尼平交联明胶特性随时间变化的研究

研究了京尼平交联明胶材料的交联度、细胞毒性、溶胀度、降解率等特性随交联时间的变化.用1%京尼平交联明胶,按交联时间分为7组:10 min组、30 min组、1 h组、2 h组、12 h组、24 h组、72 h组.结果显示京尼平可有效交联明胶,随着交联时间延长,交联度增加,溶胀度和降解率降低.交联10 min的材料,交联度低(26.7%),溶胀度高(265%),不到一周就完全降解,说明材料很不稳定,易降解;交联30min的材料,交联度(45.7%)、溶胀度(207%)、降解率与10 min材料比都有明显变化,4周未完全降解,8周完全降解,说明京尼平可以在30 min内显著改变明胶性能;30 min后的材料,随交联时间延长,交联度逐渐增加,溶胀度和降解率逐渐降低.交联72 h的材料,交联度73.1%,溶胀度153%,12周仅降解15.6%.MTT法测各组材料细胞增殖率在87.9%～105.4%之间,说明京尼平交联明胶材料细胞毒性均很低.     

交联剂对脱细胞膀胱基质生物力学性能的影响

目的 研究不同交联剂对猪脱细胞膀胱基质的组织结构影响,并比较其生物力学性能,为盆底修复替代材料的选择提供依据.方法 采用表面活性剂+酶消化法去除新鲜猪膀胱的细胞成分,将脱细胞膀胱基质随机分为3组,A组经0.25％戊二醛交联,B组经0.625％京尼平交联,C组未交联.对各组材料进行HE染色,观察纤维的变化情况.使用生物力学性能测试系统检测抗拉强度、断裂伸长率、弹性模量,并进行统计学分析.结果 京尼平交联脱细胞膀胱基质后呈深蓝色,保持了天然组织构架的完整,纤维更加致密.戊二醛交联脱细胞膀胱基质后呈浅黄色,纤维排列紊乱且有断裂.新鲜猪膀胱经上述三种方法处理后,其弹性模量增大、断裂伸长率减小,而其中京尼平交联处理的脱细胞膀胱基质力学性能与新鲜膀胱组织更为相近.结论 京尼平交联的脱细胞膀胱基质组织结构的形态佳,同时较大限度地保留膀胱组织的力学性能,可能是较理想的盆底重建材料.     

京尼平交联Ⅰ型胶原蛋白材料与人脂肪间充质干细胞的生物相容性

背景:京尼平的低毒性具有一定的种属和细胞特异性,人脂肪间充质干细胞与京尼平交联的Ⅰ型胶原蛋白支架材料的生物相容性对于应用两者构建组织工程脂肪至关重要。目的:评估人脂肪间充质干细胞与京尼平交联的Ⅰ型胶原蛋白支架材料的生物相容性。方法:分离培养人脂肪间充质干细胞,传代培养至第3代,接种于京尼平交联的Ⅰ型胶原蛋白支架材料上。MTT法评估人脂肪间充质干细胞在支架材料上的黏附和增殖情况,支架材料对细胞的毒性作用;光镜和电镜分别观察人脂肪间充质干细胞在支架材料上的黏附和生长过程,以及细胞形态学变化。结果与结论:人脂肪间充质干细胞接种于支架材料后,能够迅速在材料上黏附、增殖,其黏附率平均为86.5%;光镜和扫描电镜显示人脂肪间充质干细胞在支架材料上黏附性良好,随着时间的推移,细胞逐渐增多,可以迁移进入支架内部并均匀分布。结果表明京尼平对细胞的毒性低,交联后的支架材料与人脂肪间充质干细胞具有良好的体外生物相容性。     

两种交联剂制备软骨细胞移植支架的比较

目的：试用两种交联剂对小牛真皮基质来源的支架材料进行交联,比较支架的细胞毒性、结构、生物相容性和细胞贴附的差异,为在体动物试验提供实验依据。方法将脱细胞真皮基质分为两组,分别浸入0.05%戊二醛溶液和0.2%水溶性交联剂进行交联,MTT 法检测细胞毒性和溶血率。将交联后的支架分别植入大鼠皮下,评价生物相容性。以排液法粗测孔隙率,并在电镜下观察支架的结构和孔隙大小。培养间充质干细胞并贴附于两种方法处理的材料表面,电镜下观察贴附情况。结果以戊二醛溶液和水溶性交联剂两种方法处理的支架细胞毒性检测均合格,溶血率分别为4.61%与2.97%,均符合国家标准。经戊二醛交联的支架生物相容性差,炎症反应始终存在,水溶性交联剂处理的真皮基质组织相容性较好,仅有轻微的炎症反应。水溶性交联剂制备的支架材料孔隙率为84.3%±5.0%,戊二醛制备的支架材料孔隙率为79.7%±10.8%,差异不具有统计学意义（P >0.05）。戊二醛交联的支架细胞贴附差,而水溶性交联剂制备的支架细胞贴附良好。结论应用水溶性交联剂处理的支架细胞毒性和溶血率检测均合格,具有良好的生物相容性、孔隙率和细胞贴附性,该法可以作为后期制备软骨细胞移植支架的交联方法。     

胶原-明胶支架材料交联改性的制备及细胞毒性实验研究

目的对新型组织工程神经支架材料——胶原-明胶(CG)支架材料用不同的交联方法进行改性,研究改性后材料的细胞毒性。方法用紫外线照射、戊二醛浸泡、京尼平交联三种交联法对CG支架材料进行交联改性,遵照GB/T16886/ISO10993医疗器械生物学评价之体外细胞毒性实验原则,采用国际标准的两种实验方法,选用建系的L929小鼠成纤维细胞对改性后的支架材料进行体外细胞毒性实验。结果三种交联法改性后的CG支架材料对体外培养的细胞形态不构成损害,对其生长和增殖无明显抑制作用,细胞毒性为0～1级。结论用三种交联法改性后的CG支架材料均无明显细胞毒性。     

AngⅡ诱导大鼠BMSCs联合脱细胞牛心包体外构建工程化心肌组织的实验研究

目的：探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为心肌细胞的能力,及诱导后BMSCs体外联合脱细胞牛心包构建工程化组织心肌的可行性。方法分离培养大鼠BMSCs,用含0.1μmol/L AngⅡ的完全培养基诱导培养第3代BMSCs 24 h,然后换用完全培养基连续培养;对照组采用完全培养基连续培养。采用免疫荧光法检测诱导后的BMSCs表达心肌特异蛋白cTnT、β-MHC情况;透射电镜观察诱导后的细胞超微结构。用去污剂-酶消化法对新鲜牛心包行脱细胞处理,然后将诱导后4周的BMSCs接种于脱细胞牛心包生物支架上培养3 d后,对其进行观察检测。结果 AngⅡ诱导后的BMSCs向心肌细胞分化,可表达cTnT和β-MHC,对照组则不表达cTnT和β-MHC。电镜结果显示诱导后的细胞间可见类肌节组织及明显的桥粒连接;新鲜的牛心包经去污剂-酶联合四步法脱细胞处理及京尼平交联后,HE染色观察脱细胞的效率接近100%。扫描电镜观察发现脱细胞处理后的牛心包表面无细胞残留且表面排列杂乱,放大后可见有2μm小孔。观察体外构建的工程化心肌显示诱导后的BMSCs可良好地黏附于脱细胞牛心包生物支架表面并生长增殖,且少量可渗透到支架内部。结论 AngⅡ诱导的大鼠BMSCs可向心肌细胞方向分化,表达心肌特异蛋白cTnT和β-MHC。将其种植于脱细胞牛心包生物支架上,表面黏附良好,且可渗透到支架内部及血管周围,有望用于构建具有血管网络化的组织工程化心肌。