实验性2型糖尿病小鼠肝脏组蛋白H3表观修饰的变化及其意义

目的: 研究肝脏组蛋白H3表观修饰的变化在2型糖尿病小鼠发病过程中的作用,探讨其临床意义。方法: 30只C57BL/6J小鼠分为正常组、高脂高糖组和糖尿病组,正常组和高脂高糖组小鼠分别给予正常饲料和高脂高糖饲料,糖尿病模型采用高脂高糖饲料联合注射链脲佐菌素(STZ)方法构建。采用HE染色、免疫印迹法、实时定量PCR和ChIP技术分别检测小鼠肝脏病理学变化、肝脏中总组蛋白H3的修饰状况及与糖代谢相关基因丙酮酸激酶(Pklr)、葡萄糖转运蛋白2(Glut2)、葡糖糖激酶(Gck)、过氧化物酶体增生物激活受体γ辅助活化因子 1(Ppargc1a)和胰岛素受体(Insr)的表达水平和基因启动子区组蛋白的修饰变化。结果: 糖尿病组小鼠肝脏病理学(HE染色)和组蛋白修饰模式均发生了明显变化。与正常组比较,高脂高糖组小鼠H3K23的乙酰化下降(P<0.01),H3K9Ac和H3K9Me2修饰水平上调(P<0.01),H3K4Me保持不变(P>0.05),糖代谢相关基因Pklr、Glut2和Gck的表达水平升高(P<0.01);糖尿病组小鼠H3K23Ac和H3K9Ac修饰水平下降(P<0.05或P<0.01),H3K9Me2和H3K4Me的修饰水平升高(P<0.01),糖代谢相关基因Pklr、Glut2、Gck、Ppargc1a和Insr表达水平明显下调(P<0.05或P<0.01)。Pklr、Glut2启动子区H3K23Ac、H3K9Ac、H3K9Me2和H3K4Me修饰水平变化与基因的表达水平变化相吻合。结论: 肝脏组蛋白表观修饰变化可能参与了2型糖尿病的发生发展。     

细胞复制衰老过程中IGF2R基因表达及H3组蛋白修饰的变化

目的 研究细胞复制性衰老过程中胰岛素样生长因子2受体基因（IGF2R）的表达与H3组蛋白修饰谱的变化。 方法 培养人胚肺成纤维细胞（HPF）,以细胞群倍增数(PDL)为23(PDL23)为年轻组细胞,PDL=50(PDL50)为复制衰老细胞,观察细胞复制衰老过程中生物学性状改变;采用实时定量PCR法观察细胞PDL30、PDL40、PDL50 IGF2R基因的表达, 并采用染色质免疫共沉淀-实时定量PCR法（chromatinimmunoprecipitation-real time quantitative PCR methods,CHIP-PCR）检测IGF2R基因转录起始区组蛋白修饰(H3-Ac、H3K9-tri-Me、H3K9-Ac和H3K4-tri-Me) 的状况。 结果 与年轻细胞相比,衰老细胞体积变大,增殖能力减弱,细胞周期停滞,衰老特异性β-半乳糖苷酶着色阳性,IGF2R mRNA表达增加（P<0.05）,IGF2R mRNA表达与细胞PDL呈正相关(r=0.871)。相对年轻细胞而言,老年细胞的IGF2R基因在转录起始点上游0.6 kb处和转录起始点下游1.2 kb处以H3-Ac、H3K9-Ac和H3K4-tri-Me组蛋白修饰为主,而在转录起始点下游1.6~4.0 kb处H3K9-Ac修饰降低,H3K9-tri-Me组蛋白修饰升高,但H3K4-tri-Me组蛋白修饰占主要地位。 结论 IGF2R与细胞衰老程度相关,其基因表达受H3组蛋白修饰调控,表观遗传学参与细胞衰老进程。     

组蛋白高乙酰化介导的Egr-1结合促进gdnf基因高转录

目的探讨大鼠C6 胶质瘤细胞中gdnf 基因启动子II 区组蛋白H3K9 高乙酰化引发该基因高转录的机制。方法采用
ChIP-PCR技术检测了大鼠C6星形胶质瘤细胞和正常星形胶质细胞中gdnf基因启动子II区转录因子Egr-1结合位点处H3K9
的乙酰化水平以及Egr-1与该启动子的结合能力;利用Real-time PCR和ChIP-PCR技术,检测了组蛋白乙酰基转移酶抑制剂姜
黄素（Curcumin）和去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（TSA）处理对C6 胶质瘤细胞中gdnf 基因启动子II 区Egr-1 结合位点处
H3K9的乙酰化水平、Egr-1与之的结合能力以及该基因转录水平的影响。结果较之正常星形胶质细胞,C6胶质瘤细胞中gdnf
基因启动子II 区Egr-1 结合位点处H3K9 的乙酰化水平显著升高,并且Egr-1 与之的结合能力也显著升高（P<0.01）。当
Curcumin显著降低了Egr-1结合位点处H3K9乙酰化水平时,Egr-1与启动子II区的结合量以及gdnf基因mRNA的表达量都显
著下调（P<0.05）;而当TSA显著升高了Egr-1 结合位点处H3K9 乙酰化水平时,Egr-1 与启动子II 区的结合量以及gdnf 基因
mRNA的表达量都显著升高（P<0.05）。结论在大鼠C6胶质瘤细胞中gdnf基因启动子II区H3K9高乙酰化介导的Egr-1结合
量升高可能是其高转录的原因。
     

小鼠癫痫持续状态时组蛋白H3K9二甲基化水平的变化及其调控作用

目的研究癫痫持续状态对组蛋白H3K9二甲基化修饰的作用。方法用Western blot比较研究小鼠癫痫持续状态后大脑皮层和海马的组蛋白H3K9二甲基化水平及相关蛋白表达水平的变化。利用特异性抑制剂BIX01294处理原代培养的小鼠大脑皮层神经元,观察组蛋白H3K9二甲基化水平对谷氨酸脱羧酶GAD67表达水平的影响。用染色体免疫沉淀技术验证组蛋白H3K9甲基化酶G9a与GAD67的启动子区的相互作用。结果癫痫持续状态能够下调组蛋白H3K9甲基转移酶G9a的表达和组蛋白H3K9的二甲基化水平,同时上调GAD67的表达水平。在培养神经元中,用BIX01294抑制组蛋白H3K9二甲基化水平可以上调GAD67的表达水平。染色体免疫沉淀实验发现G9a能和GAD67启动子区域相互作用。结论癫痫持续状态下调组蛋白H3K9二甲基化水平及组蛋白H3K9甲基转移酶G9a的表达水平,并能引起GAD67表达水平上调。     

与肝X受体相关的脂肪酸合酶转录调控区乙酰化组蛋白动态表达

目的利用肝X受体(liver X receptor,LXRs)激动剂T0901317,对脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FAS)基因转录调控区的组蛋白乙酰化状态进行研究,探讨FAS基因转录表达中是否存在组蛋白乙酰化引起的染色质重塑事件。方法用实时荧光定量PCR方法测定FAS mRNA的转录表达时间谱。通过染色质免疫沉淀技术,结合实时荧光定量PCR测定脂肪酸合酶基因转录调控区4个位点上乙酰化组蛋白H3和乙酰化组蛋白H4的表达情况。结果①T0901317作用2 h开始FAS mRNA表达呈时间依赖性增高(1.09倍,P>0.05),16 h达到峰值(4.25倍,P<0.01),48 h时仍明显高于0 h的表达(2.59倍,P<0.01)。②T0901317作用30 min,组蛋白H3乙酰化水平显著高于0 h水平(P<0.05),1 h降至0 h水平以下(仅上游2 000 bp位点差异有统计学意义P<0.05),2 h又接近或高于0 h水平(仅LXRE位点增高有统计学意义P<0.05)。③T0901317作用30 min,组蛋白H4乙酰化水平均较0 h增高(P<0.05),而1 h和2 h,其水平均低于0 h(P<0.05)。结论在LXRs激动剂T0901317的作用下,FAS基因mRNA水平呈时间依赖性增高;而在FAS基因转录早期,FAS基因转录起始点上下游约2 500 bp位置范围均有组蛋白乙酰化引起的染色质重塑改变,但这种改变是随位置、时间和组蛋白的不同,呈动态变化的过程。     

人类卵母细胞及体外受精发育阻滞胚胎中的组蛋白乙酰化水平的检测

目的 探讨人类不同成熟阶段的卵母细胞及体外受精发育阻滞胚胎中的组蛋白乙酰化水平的变化规律.方法 收集接受卵胞浆内单精子注射技术(ICsI)治疗的患者废弃的卵母细胞生发泡(GV)期、第一次减数分裂中期(MⅠ期)和经体外成熟培养发育至第二次减数分裂中期(MⅡ期)的卵母细胞,采用间接免疫荧光染色方法对人类不同成熟阶段的卵母细胞及体外受精阻滞胚胎中的组蛋白的(H4K12和H3K9)乙酰化水平进行检测.结果 人类GV期卵母细胞中组蛋白H4K12和H3K9均强表达.74.1%的MⅠ期卵母细胞中H4K12和H3K9的乙酰化水平显著降低.79.2%的MⅡ期卵母细胞中组蛋白H4K12乙酰化呈微弱表达或不表达,而来源于高龄妇女的MⅡ期卵母细胞仍维持较高的H4K12乙酰化水平.在MⅡ期卵母细胞中几乎检测不到H3K9的乙酰化表达.83.3%的发育阻滞胚胎中组蛋白H4K12和H3K9的乙酰化水平较高.结论 人类卵母细胞的成熟经历了一个组蛋白乙酰化到去乙酰化的动态修饰过程,体外受精后又重新建立新的组蛋白乙酰化修饰.     

MLLT3/AF9基因研究进展

MLLT3/AF9基因属于组蛋白甲基转移酶家族成员,从含有t(9,11)(p22;q23)易位的人白血病中得到。其通过识别组蛋白H3K9(组氨酸3赖氨酸9)乙酰化修饰,募集组蛋白甲基转移酶DOT1L催化H3K79甲基化的共沉积和基因活化,从而参与调节细胞的增殖、分化和凋亡。MLLT3/AF9基因能够引起全基因组转录表达的异常,从而参与多种肿瘤的发生、发展及预后,并且在机体的成长和发育中发挥着至关重要的作用。本文对MLLT3/AF9基因在细胞中表达及其与细胞生物学行为关系的研究进展作一综述。     

丁酸钠上调白血病K562细胞CYP1A1和1B1基因的表达

目的 研究丁酸钠(NaB)在诱导白血病K562细胞分化过程中,对细胞色素CYP1A1/1B1基因转录的作用及作用机制.因为与肿瘤发生发展密切相关,细胞色素P450s(CYPs)已经成为最有潜力的抗肿瘤药物的靶标.对于白血病细胞中这些基因表达机制的研究将有助于揭示它们在造血过程以及血液肿瘤发生中的作用.方法 丁酸钠诱导K562细胞分化,RT-PCR检测CYP1A1/1B1转录水平的变化,染色质免疫沉淀(ChIP)分析乙酰化组蛋白H3和组蛋白乙酰转移酶p300与CYP1A1/1B1启动子的结合情况.结果 丁酸钠在诱导白血病K562细胞分化过程中,促进了组蛋白乙酰转移酶p300与启动子区域的结合、升高了CYP1A1/1B1基因启动子组蛋白H3乙酰化修饰水平、上调了CYP1A1/1B1基因的转录.结论 组蛋白乙酰化修饰和组蛋白乙酰转移酶p300参与了丁酸钠诱导的白血病K562细胞CYP1A1/1B1基因的转录.     

TGF-β2对心肌细胞H9C2转录因子表达的影响及其组蛋白H3乙酰化调控机制

目的 探讨转化生长因子-β2(transforming growth factor beta2,TGF-β2)对心肌细胞H9C2转录因子Mef2c和GATA4的影响及其与组蛋白H3乙酰化的关系.方法 比较TGF-β2对细胞生长的影响.利用Real-time PCR检测心肌细胞的心脏相关转录因子Mef2c和GATA4mRNA的相对表达量,筛选合适的TGF-β2干预浓度.采用Western blot检测心肌细胞乙酰化组蛋白H3(acetylated histone H3,acH3)的表达差异.染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP) Real-time PCR检测Mef2c和GATA4启动子区与acH3结合DNA的相对表达水平.比色分析法检测TGF-β2对心肌细胞的总体组蛋白乙酰化酶(HATs)活性的影响.结果 ①TGF-β2干预组相对于对照组心肌细胞的增殖能力增强(P＜0.05).②心肌细胞的心脏相关转录因子Mef2c和GATA4mRNA的相对表达量随着TGF-β2浓度的升高呈现先升高后降低的趋势,在5 μg/L的浓度时均达到最高,Mef2c mRNA相对表达量是对照组的1.8倍,GATA4mRNA是对照组的2.3倍(P＜0.05).③TGF-β2干预72 h后acH3蛋白表达量是对照组的4倍(P＜0.05),HATs活性是对照组的1.34倍(P＜0.05).④TGF-β2干预组Mef2c和GATA4启动子区组蛋白H3的乙酰化水平分别是对照组的2.56和2.16倍(P＜0.05).结论 5μg/L TGF-β2可以促进心肌细胞H9C2的分裂与增殖,并上调心脏相关转录因子Mef2c和GATA4的表达,组蛋白H3乙酰化水平的升高可能是Mef2c和GATA4表达上调的机制之一.     

MafA基因重组腺病毒的构建及其对小鼠肝癌细胞的影响

目的利用AdEasy-1系统构建胰岛素转录因子之一的MafA基因重组腺病毒（Ad-MafA）,并观察其对小鼠肝癌细胞的影响。方法将质粒cDNA3/MafA扩增、酶切获得MafADNA片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack-CMV的巨细胞病毒（CMV）启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-MafA,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-MafA,经293细胞包装后得到含MafA全长DNA片段的重组腺病毒AdMafA;将Ad-MafA体外感染小鼠肝癌细胞（Hepa1-6）,以RT-PCR和Westernblot检测MafA在hepa1-6细胞的表达。结果连接、重组后通过酶切法筛选出pAd-MafA,经293细胞包装,5d后观察到绿色荧光蛋白（GFP）明显表达,通过反复感染HEK细胞扩增得到高滴度的重组腺病毒,Ad-MafA体外感染肝癌细胞1d后,MafA基因表达和蛋白表达明显增加。结论利用新型腺病毒载体AdEasy-1系统可在短期内制备同时表达GFP和MafA的重组腺病毒（Ad-MafA）,Ad-MafA体外感染小鼠肝癌细胞可显著提高MafA的表达,这将为基因治疗糖尿病提供新的手段。     

Dot1及其同源物的研究进展

 Dot1(disruptor of telomeric silencing 1)最初在芽殖酵母中通过遗传筛选基因被发现, 缺失则会引起端粒沉默。Dot1和其脊椎动物同源物DOT1L(Dot1-like)都具有催化组蛋白H3第79位赖氨酸(H3K79)甲基化的组蛋白甲基转移酶活性。在人类各种组织中, DOT1L基因启动子区域的CpG岛均呈现极低的DNA甲基化水平, 说明DOT1L基因在人体中广泛中等程度表达。DOT1L基因在EBV转化的细胞及睾丸中表达水平升高。Dot1/DOT1L介导的H3K79甲基化参与多种生物学过程, 并在小鼠基因损伤实验中发现DOT1L在心功能、红细胞生成、白血病及多种肿瘤的疾病发展中起重要的作用, 因而DOT1L已成为针对表观遗传修饰因子的重要药物靶点。本文对Dot1/DOT1L在生理和病理方面的研究进展作一综述。     

乏氧对人口腔鳞状细胞癌细胞中叉头蛋白P3表达的影响及其机制

目的：观察乏氧对人口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞中叉头蛋白P3（FOXP3）表达的影响,阐明乏氧调控FOXP3表达的表观遗传学机制。方法：选取人OSCC细胞株FaDu和OECM-1细胞,常氧和乏氧条件下培养18h。采用实时定量PCR方法检测细胞中FOXP3 mRNA的相对表达水平,Western blotting 法检测FaDu和OECM-1细胞中FoxP3蛋白表达水平,染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）法检测FOXP3基因启动子上组蛋白修饰H3K4乙酰化（H3K4ac）、H3K4三甲基化（H3K4me3）和H3K27三甲基化（H3K27me3）水平。采用组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）基因沉默的FaDu细胞,以实时定量PCR和ChIP-qPCR法检测FaDu细胞中HDA3 mRNA相对表达水平和FOXP3mTNA表达抑制率。结果：与常氧条件比较,乏氧条件下FaDu和OECM-1细胞中FOXP3 mRNA相对表达水平均明显降低,分别下降65.6%（P<0.01）和75.7%（P<0.01）;Western blotting检测,乏氧条件下FaDu和OECM-1细胞中FOXP3蛋白表达水平明显低于常氧条件下;染色质免疫沉淀实验,与常氧条件比较,乏氧条件下FaDu细胞中FOXP3基因启动子上的H3K4ac和H3K4me3水平明显降低（P<0.01）,而H3K27me3水平无明显差异。与无HDAC3基因沉默的FaDu细胞比较,HDAC3基因沉默的FaDu细胞中缺氧诱导的FOXP3启动子上H3K4ac和H3K4me3表达抑制率明显降低（P<0.05）,缺氧诱导的FOXP3mRNA相对表达抑制率降低（P<0.05）。结论：乏氧可通过HDAC3介导的FOXP3基因启动子上H3K4ac水平下调而抑制OSCC细胞中FOXP3的表达。     

siRNA干扰MafA对小鼠胰岛β细胞的生长以及胰岛素相关基因的表达分析

目的探讨肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A（MafA）对小鼠胰岛β细胞Min6的增殖以及胰岛素相关基因mRNA及蛋白表达的影响。方法实验分为MafA siRNA转染的MafA干扰A组、MafA干扰B组、MafA干扰C组及未转染的对照D组、对照E组、对照F组。MafA干扰A组和对照D组培养的葡萄糖浓度为5.6 mmol/L,MafA干扰B组和对照E组为10 mmol/L,MafA干扰C组和对照F组为25 mmol/L。采用实时荧光定量PCR及Western blotting检测mRNA及蛋白表达,MTT法检测胰岛细胞增殖,ELISA测定胰岛素浓度。结果在MaFA mRNA及蛋白的表达水平,MafA干扰B组和对照E组、MafA干扰C组、对照F组相比差异均有统计学意义（P < 0.05）。MafA干扰C组Min6细胞增殖水平低于对照F组（P < 0.05）。MafA干扰C组Insulin-1、Insulin-2 mRNA相对表达水平均低于对照F组（P < 0.05）。MafA干扰C组胰岛素浓度低于对照F组（P < 0.05）。结论MafA基因与小鼠胰岛β细胞增殖和胰岛素分泌相关,其作用可能与血糖浓度有关。     

胰岛β细胞转录因子MafA的研究进展

肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物A(MafA)是特异表达于β细胞的一种转录因子,参与调节胰岛素合成、分泌和糖代谢等相关基因的表达。MafA特异结合于胰岛素基因C1元件,与结合于A1、E1元件的转录因子胰腺和十二指肠同源盒因子1、β细胞E盒反式作用因子共同调节胰岛素基因的转录。MafA在葡萄糖调节胰岛素基因表达过程中具重要作用,血糖变化可通过改变MafA的表达、稳定性及其与C1元件的结合活性调节胰岛素基因的转录。MafA的变异或缺失与糖尿病发生密切相关。     

组蛋白去乙酰化下调对肾细胞癌BNIP3基因表达的影响

目的探讨肾细胞癌中线粒体促凋亡蛋白BNIP3表达下调机制。方法运用CCK-8法及流式细胞技术检测组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A（TSA）对肾癌细胞株786-O、ACHN、A498增殖、凋亡的影响;运用实时荧光定量PCR（Q-PCR）和蛋白质免疫印记（Western blot）技术检测TSA对肾癌细胞BNIP3表达的影响;运用染色质免疫沉淀（ChIP）技术检测TSA对肾癌细胞BNIP3基因启动子区组蛋白H3乙酰化状态的影响。结果经TSA处理后,3种肾癌细胞增殖均受到显著抑制（PBNIP3 mRNA（PBNIP3基因启动子区组蛋白H3呈去乙酰化状态,TSA恢复了其乙酰化状态;A498的BNIP3基因启动子区组蛋白H3呈乙酰化状态。结论BNIP3基因启动子区组蛋白去乙酰化是其在肾癌中表达下调的主要机制,并可能参与了肾癌的发生发展。