人大肠癌线粒体DNA重组质粒的构建

目的 了解大肠癌细胞株(SW480,LoVo,HT29)线粒体DNA的突变,克隆突变的大肠癌线粒体DNA(mtDNA)基因,构建pcDNA3.I(+)-mtDNA真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞,以探讨线粒体基因突变与肿瘤发生的关系。方法 提取大肠癌细胞株(SW480,LoVo,HT29)mtDNA,扩增D-LOOP区,产物用DNA自动测序法进行序列分析。利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3.1(+),并用脂质体法导人NIH3T3细胞。结果 检测出大肠癌细胞株SW480、LoVo、HT29细胞mtDNAD-LOOP分别有10、9、8个突变位点。成功克隆1119bp的mtDNAD-LOOP区至表达质粒pcDNA3.1(+),并导入NIH3T3细胞中。结论 线粒体DNAD-LOOP区是一个具有高度多态性和突变性的区域,在大肠癌细胞株中突变率较高。     

人大肠癌线粒体DNA重组质粒的构建

目的了解大肠癌细胞株（SW480，LoVo，HT29）线粒体DNA的突变，克隆突变的大肠癌线粒体DNA（mtDNA）基因，构建pcDNA3．1（＋）-mtDNA真核表达重组体，并导入NIH3T3细胞，以探讨线粒体基因突变与肿瘤发生的关系。方法提取大肠癌细胞株（SW480，LoVo，HT29）mtDNA，扩增D-LOOP区，产物用DNA自动测序法进行序列分析。利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3．1（＋），并用脂质体法导人NIH3T3细胞。结果检测出大肠癌细胞株SW480、LoVo、HT29细胞mtDNAD—LOOP分别有10、9、8个突变位点。成功克隆1119bp的mtDNAD—LOOP区至表达质粒pcDNA3．1（＋），并导入NIH3T3细胞中。结论线粒体DNAD-LOOP区是一个具有高度多态性和突变性的区域，在大肠癌细胞株中突变率较高。     

突变的大肠癌线粒体DNA转染NIH3T3及LST细胞的研究

日的了解大肠癌细胞株（SW480，LOVO，HT29）线粒体DNA的突变，克隆突变的大肠癌线粒体DNA（mtDNA）基因，构建pcDNA3．1（＋）-mtDNA真核表达重组体，并导人NIH3T3及LST细胞。以探讨线粒体基因突变与肿瘤发生的关系。方法提取大肠癌细胞株（SW480，LOVO,HT29）mtDNA，扩增D-LOOP区，产物用DNA自动测序法进行序列分析。利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3．1（＋）。并用脂质体法导人NIH3T3及LST细胞。用MitoCapture Mitochondrial Apoptosis Detection Kit试剂盒染色后用流式细胞仪及荧光显微镜检测转染细胞的凋亡情况。扩增并测序分析转染细胞的D-LOOP区突变特点。结果检测出大肠癌细胞株SW480、LOVO和HT29细胞mtDNAD-LOOP分别有10、9和8个突变位点。转染前后，各组间细胞凋亡无明显变化。转染细胞的核基因组可扩增出目的基因及Neo基因。4株NIH3T3转染细胞mtDNA D-环区分别检测到9、11、8和4个突变点，并相应有3、4、3和2个多态性变化。结论转染突变的大肠癌细胞mtDNA后转染细胞的mtDNA均可发生多处的突变位点；通过转染后突变的外源性的mtDNA可以整合到核基因组内；突变的mtDNA转染LST细胞及NIH3T3细胞后。不影响转染细胞的凋亡改变；mtDNA的突变可能通过影响体细胞mtDNA的突变和通过外源性mtDNA在核内的整合从而影响癌基因或抑癌基因的表达异常，从而参与肿瘤的发生发展。     

大肠癌细胞线粒体DNA与NIH3T3细胞核基因组整合的荧光原位杂交分析

目的:观察大肠癌细胞突变的线粒体DNA(mtDNA)转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3后,mtDNA与转染细胞核内基因组的整合情况.方法:将携带大肠癌细胞突变mtDNA的重组质粒pcDNA3.1( )-Sw480 mtDNA、pcDNA3.1( )-NHWBC mtDNA及空质粒pcDNA3.1( )通过脂质体法转染NIH3T3细胞.同时用PCR法制备3条相应的绿色荧光蛋白标记的mtDNA探针.分离转染的NIH3T3细胞核内染色体,用荧光原位杂交(FISH)法检测mtDNA探针与核内基因组的整合情况.结果与结论:瞬时转染的NIH3T3细胞核基因组上存在mtDNA的同源序列.外源肿瘤细胞mtDNA与NIH3T3细胞核内基因组发生整合.     

iASPP真核表达载体构建及其功能鉴定

目的构建P53凋亡刺激蛋白(ASPP)家族的抑制成员iASPP的真核表达载体,并将其通过脂质体转染到结肠癌细胞株SW480及Lovo中,观察转染前后iASPP表达变化及其对细胞凋亡的影响。方法将解放军第十六医院检验科经测序鉴定的pMD19-T-iASPP质粒亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP,测序鉴定后用脂质体将重组质粒转染至结肠癌细胞株SW480及Lovo中,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测iASPP的表达以及用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化情况。结果重组表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP,经酶切测序与GenBank上记录的人iASPP cDNA序列(gi 60457962)完全一致。经pcDNA3.1(+)-iASPP质粒转染的结肠癌细胞株SW480及Lovo的iASPP mRNA表达增高,细胞凋亡率下降。结论成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1(+)-iASPP,并成功在结肠癌细胞株SW480及Lovo中获得了表达,细胞株的凋亡率下降,提示抑制iASPP高表达有可能成为恢复P53抑癌功能的新策略。     

重组体pcDNA3.1(+)-tyr的构建及在小鼠NIH3T3细胞中的表达

[目的]克隆酪氨酸酶基因(tyr),构建pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞表达。[方法]用RT-PCR法从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆tyr全长cDNA片段,利用DNA重组技术将其定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)的T7启动子下游,并用脂质体法导入NIH3T3细胞,RT-PCR,酪氨酸酶活性测定及多巴染色法检测tyr的表达。[结果]成功克隆1.74kb的全长tyr cDNA片段,经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致,tyr准确克隆入pcDNA3.1(+)的多克隆位点,RT-PCR及酪氨酸酶活性测定等方法检测到转染了重组体的NIH3T3细胞中有tyr的表达。[结论]本实验成功构建了pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并成功导入NIH3T3细胞中表达。     

重组体pcDNA3．1（＋）－tyr的构建及在小鼠NIH3T3细胞中的表达

【目的】克隆酪氨酸酶基因(tyr)，构建pcDNA3．1( )-tyr真核表达重组体，并导人NIH3T3细胞表达。【方法】用RT-PCR法从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆tyr全长cDNA片段，利用DNA重组技术将其定向插入真核表达质粒pcDNA3．1( )的T7启动子下游，并用脂质体法导入NIH3T3细胞，RT-PCR，酪氨酸酶活性测定及多巴染色法检测tyr的表达。【结果】成功克隆1．74kb的全长tyr cDNA片段，经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致，tyr准确克隆人pcDNA3．1( )的多克隆位点，RT-PCR及酪氨酸酶活性测定等方法检测到转染了重组体的NIH3T3细胞中有tyr的表达。【结论】本实验成功构建了pcDNA3．1( )-tyr真核表达重组体，并成功导入NTH3T细胞中表达.     

重组人釉原蛋白真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的构建含人釉原蛋白(hAm)基因的重组真核表达质粒并转染哺乳动物细胞NIH3T3,建立稳定表达重组hAm的细胞株,为临床应用奠定基础。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ将hAm基因插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A,构建含hAm基因的重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm,双酶切和测序鉴定。通过LipofectamineTM2000介导重组质粒转染NIH3T3细胞,利用G418筛选出阳性克隆,建立稳定表达人釉原蛋白的细胞株,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting验证蛋白表达。结果重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。重组质粒转染NIH3T3细胞后建立的稳定转染细胞株经SDS-PAGE电泳及Western blotting检测显示有相对分子质量为28 000的hAm表达,与预测一致。结论成功构建含hAm基因的重组真核表达系统,并获得稳定表达重组hAm的细胞株NIH3T3-hAm细胞株。     

紧密连接蛋白claudin-1基因的克隆和大肠癌细胞表达载体的构建

目的 研究claudin-1在大肠癌中的作用,构建包含claudin-1基因编码区域的重组质粒.方法 从人类大肠癌细胞株SW620用Trizol提取总RNA,经逆转录聚合酶链式反应获得DNA,限制性内切酶进行酶切、T4连接酶进行连接:将PCR产物插入绿色荧光蛋白pEGFP-C1载体,然后转染进人人类大肠癌细胞株SW480.结果 重组质粒经限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列分析,显示序列正确,在SW480中主要为膜表达.结论 成功构建了claudin-1/pEGFP-C1重组质粒,并能在人类大肠癌细胞中表达.     

霍乱肠毒素基因DNA疫苗的构建和体外表达

目的构建霍乱弧菌ctxAB融合基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法用限制性核酸内切酶从原核表达重组质粒pET32a-ctxAB上切下ctxAB基因,导入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-ctxAB。用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxAB转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxAB的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定。结果真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxAB成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术检测到其在细胞膜和细胞浆中获得瞬时表达,对稳定转染细胞用Western blot分析,发现在约40.5kDa处有阳性杂交信号。结论成功构建霍乱弧菌ctxAB基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中获得表达。     

LEF-1截短型基因真核荧光表达载体的构建及其在SW480细胞系中的功能研究

目的 构建LEF-1截短型基因的真核表达荧光质粒,在真核细胞中表达,并检测其对人结肠癌细胞系SW480增殖和凋亡的影响.方法 利用PCR方法从人淋巴结cDNA文库中克隆LEF-1截短型的编码基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1中,同时插入红色荧光示踪片段mRFP.用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-LEF-1-mRFP瞬时转染Hela细胞,通过Western blot和流式细胞仪检测LEF-1截短型的表达,同法瞬时转染SW480细胞,观察细胞形态变化,MTT检测对细胞生长的影响,CSFE染色检测细胞的增殖情况,Annexin V方法检测细胞凋亡情况,PI染色检测细胞周期.结果 克隆LEF-1截短型的编码基因,经测序比对证实与GenBank中给出的序列一致,以含有LEF-1截短型的编码基因的真核表达荧光载体瞬时转染Hela细胞.LEF-1截短型基因的表达产物通过Westemblot和流式细胞仪方法得到证实,转染SW480细胞.光镜下观察发现部分细胞中出现颗粒,失去正常形态,细胞数目明显减少;MTT检测显示细胞活性下降,流式检测显示细胞增殖受到抑制,凋亡水平增加,细胞在G_(0/1)期发生阻滞.结论 成功构建LEF-1截短型的编码基因的真核荧光表达载体,证实其在真核细胞HeM中可以表达.同时可以抑制SW480细胞的活性和增殖,促进其凋亡,细胞被阻滞在G_(0/1)期,

Abstract：

Objective To construct a eukaryotic fluorescent expression vector of truncated lymphoid enhancer-binding factor 1 (LEF-1) gene and investigate its effect on the proliferation and apoptosis of human colonic carcinoma cell line SW480. Methods Truncated LEF-1 gene was obtained by PCR and DNA recombination from human lymphoid node cDNA library. The PCR product of LEF-1 gene was inserted into the plasmid pMD-18T and sequenced. The truncated LEF-1 gene was inserted into the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 and fused with mRFP for tracing. Using Lipofectamine~(TM) 2000, the plasmid pcDNA3.1 -LEF-1 -mRFP was transfected into Hela cells and detected by Western blotting and fluorescence activated cell sorting (FACS). The changes in the growth, proliferation and apoptosis of the SW480 cells were observed after transfection with the plasmids. Results The truncated LEF-1 gene was successfully cloned. After transfection with the plasmid pcDNA3.1-LEF-1-mRFP, the Hela cells expressed the product of LEF-1 as detected by Western blotting and FACS. The growth and proliferation of SW480 cells was inhibited and the cell apoptosis increased after transfection with the plasmid pcDNA3.1-LEF-1-mRFP, which also caused cell cycle arrest in G_(0/1) phase. Conclusion The eukaryotic expression fluorescent vector pcDNA3.1-LEF-1-mRFP has been constructed and expressed in eukaryotic cell line successfully. The truncated LEF-1 protein expressed in the transfected SW480 cells results in inhibition of the cell growth and proliferation with increased cell apoptosis and cell cycle arrest in G_(0/1) phase.     

人同种异体移植炎症因子-1的基因克隆及其在小鼠成纤维细胞中的表达

目的构建人同种异体移植炎症因子-1(allograft inflammatory factor-1,AIF-1)基因的真核表达载体并在小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)中表达,为进一步研究AIF-1蛋白的功能奠定基础。方法利用基因重组技术,构建带有AIF-1基因的2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1。利用脂质体法将2种重组质粒分别转染NIH3T3细胞,用荧光倒置显微镜及Western blot方法观察及鉴定AIF-1在细胞中的稳定表达及瞬时表达。结果酶切分析及DNA序列测定证实,AIF-1基因片段被分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)与pEGFP-C1。荧光显微镜观察到NIH3T3细胞中有绿色荧光分布。Western blot结果表明,转染重组质粒的NIH3T3细胞中,AIF-1表达量明显增高。结论成功构建了2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1,经转染NIH3T3细胞株获得了AIF-1蛋白的瞬时表达及稳定表达。     

嗜肺军团菌mip基因真核表达重组质粒构建与表达

目的构建嗜肺军团菌m ip基因的真核表达重组质粒pcDNA 3.1-m ip,并研究其在细胞中的表达。方法PCR扩增嗜肺军团菌m ip基因,导入载体pcDNA 3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA 3.1-m ip。用脂质体法将重组质粒pcDNA 3.1-m ip转染N IH 3T 3细胞,采用免疫荧光法和W estern-b lot分别鉴定pcDNA 3.1-m ip的瞬时表达产物和稳定表达产物。结果在细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA 3.1-m ip成功转入N IH 3T 3细胞,并在细胞膜和细胞内获得短暂表达;用嗜肺军团菌兔血清抗体检测pcDNA 3.1-m ip稳定转染的N IH 3T 3细胞,在相对分子质量24×103处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA 3.1-m ip在细胞内表达出M ip蛋白。空质粒pcDNA 3.1( )转染的N IH 3T 3细胞未检测到绿色荧光和杂交信号。结论成功构建m ip基因真核表达重组质粒,并在N IH 3T 3细胞中表达出相对分子质量为24×103的M ip蛋白。     

pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究

目的 构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500 μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1 -His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3Ｔ3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-His- DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1M26I的NIH3T3细胞.DJ-1M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡.