人大肠癌线粒体DNA重组质粒的构建

目的了解大肠癌细胞株（SW480，LoVo，HT29）线粒体DNA的突变，克隆突变的大肠癌线粒体DNA（mtDNA）基因，构建pcDNA3．1（＋）-mtDNA真核表达重组体，并导入NIH3T3细胞，以探讨线粒体基因突变与肿瘤发生的关系。方法提取大肠癌细胞株（SW480，LoVo，HT29）mtDNA，扩增D-LOOP区，产物用DNA自动测序法进行序列分析。利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3．1（＋），并用脂质体法导人NIH3T3细胞。结果检测出大肠癌细胞株SW480、LoVo、HT29细胞mtDNAD—LOOP分别有10、9、8个突变位点。成功克隆1119bp的mtDNAD—LOOP区至表达质粒pcDNA3．1（＋），并导入NIH3T3细胞中。结论线粒体DNAD-LOOP区是一个具有高度多态性和突变性的区域，在大肠癌细胞株中突变率较高。     

人大肠癌线粒体DNA重组质粒的构建

目的 了解大肠癌细胞株(SW480,LoVo,HT29)线粒体DNA的突变,克隆突变的大肠癌线粒体DNA(mtDNA)基因,构建pcDNA3.I(+)-mtDNA真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞,以探讨线粒体基因突变与肿瘤发生的关系。方法 提取大肠癌细胞株(SW480,LoVo,HT29)mtDNA,扩增D-LOOP区,产物用DNA自动测序法进行序列分析。利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3.1(+),并用脂质体法导人NIH3T3细胞。结果 检测出大肠癌细胞株SW480、LoVo、HT29细胞mtDNAD-LOOP分别有10、9、8个突变位点。成功克隆1119bp的mtDNAD-LOOP区至表达质粒pcDNA3.1(+),并导入NIH3T3细胞中。结论 线粒体DNAD-LOOP区是一个具有高度多态性和突变性的区域,在大肠癌细胞株中突变率较高。     

大肠癌线粒体DNA诱导NIH3T3细胞D-环突变

目的 观察突变的大肠癌细胞线粒体DNA(mtDNA)转染 NIH3T3 细胞后转染细胞mtDNA D-环突变特性.方法 通过脂质体法(Lipofection 2000TM) 将大肠癌细胞突变的 mtDNA 真核表达载体转染 NIH3T3细胞,利用 G418 抗性筛选克隆细胞;用PCR法检测转染细胞线粒体突变情况.结果 ...     

突变的大肠癌线粒体DNA转染NIH3T3及LST细胞的研究

日的了解大肠癌细胞株（SW480，LOVO，HT29）线粒体DNA的突变，克隆突变的大肠癌线粒体DNA（mtDNA）基因，构建pcDNA3．1（＋）-mtDNA真核表达重组体，并导人NIH3T3及LST细胞。以探讨线粒体基因突变与肿瘤发生的关系。方法提取大肠癌细胞株（SW480，LOVO,HT29）mtDNA，扩增D-LOOP区，产物用DNA自动测序法进行序列分析。利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3．1（＋）。并用脂质体法导人NIH3T3及LST细胞。用MitoCapture Mitochondrial Apoptosis Detection Kit试剂盒染色后用流式细胞仪及荧光显微镜检测转染细胞的凋亡情况。扩增并测序分析转染细胞的D-LOOP区突变特点。结果检测出大肠癌细胞株SW480、LOVO和HT29细胞mtDNAD-LOOP分别有10、9和8个突变位点。转染前后，各组间细胞凋亡无明显变化。转染细胞的核基因组可扩增出目的基因及Neo基因。4株NIH3T3转染细胞mtDNA D-环区分别检测到9、11、8和4个突变点，并相应有3、4、3和2个多态性变化。结论转染突变的大肠癌细胞mtDNA后转染细胞的mtDNA均可发生多处的突变位点；通过转染后突变的外源性的mtDNA可以整合到核基因组内；突变的mtDNA转染LST细胞及NIH3T3细胞后。不影响转染细胞的凋亡改变；mtDNA的突变可能通过影响体细胞mtDNA的突变和通过外源性mtDNA在核内的整合从而影响癌基因或抑癌基因的表达异常，从而参与肿瘤的发生发展。     

大肠癌线粒体DNA诱导NIH3T3细胞D-环突变的研究

目的 观察突变的大肠癌细胞线粒体DNA（mtDNA）转染 NIH3T3 细胞后转染细胞mtDNA D-环突变特性。方法 通过脂质体法( Lipofection2000TM) 将大肠癌细胞突变的 mtDNA 真核表达载体转染 NIH3T3细胞,利用 G418 抗性筛选克隆细胞;用PCR法检测转染细胞线粒体突变情况。结果 突变mtDNA 导致转染细胞 mtDNA 的突变和多态性变化。 结论　突变的大肠癌 mtDNA可致NIH3T3细胞mtDNA位点变化,但具体的机制和过程有待于进一步研究。     

银染PCR-SSCP方法检测大肠癌组织线粒体DNA的突变

目的: 研究大肠癌组织线粒体DNA的突变情况. 方法: 用银染PCR-SSCP技术结合测序的方法检测40例大肠癌组织及其癌旁正常组织的线粒体DNA D-环区的点突变情况. 结果: 40例大肠癌组织中检测到7例点突变改变,突变率为18%(7/40),在检测的9个突变位点,3个突变位点存在于Dukes D期的1例大肠癌中,其他6个突变位点分别存在于Dukes C期的6例大肠癌组织中,其中498位C→ T, 16298位C→T两个突变位点在检测到点突变的7例大肠癌组织中均检测到. 结论:大肠癌组织线粒体DNA D-环区存在一定程度的点突变,突变的发生可能与大肠癌的易感性和恶性程度有一定相关性, 但是否是大肠癌的发病机制尚有待进一步研究.     

卵巢肿瘤中线粒体DNA D-环区的突变

目的研究线粒体DNAD-环区在卵巢肿瘤中的突变情况。方法选择25例卵巢肿瘤组织及其邻近的正常组织,用PCR方法将线粒体DNAD-环区同时扩增测序。结果在25例卵巢肿瘤中有8例存在线粒体DNAD-环区突变,突变率为32%,突变位点26个。在26个突变位点中,19个突变位点存在于2例交界性肿瘤中,6个属于微卫星不稳定。25例肿瘤中有11个基因库未记载的新的多态性变化。结论线粒体DNAD-环区是一个具有高度多态性和突变性的区域,在卵巢肿瘤中突变率较高。     

中国保安族线粒体DNA D-环区遗传多态性的研究

目的：以遗传群体为对象，观察线粒体DNA的群体遗传特点，为研究西北少数民族的起源提供科学依据，并为法医学鉴定提供线粒体DNA序列多态性的基础数据。方法：应用PCR扩增产物直接测序法，对98例保安族无关个体线粒体DNA D-环区HVSⅠ进行测序分析。结果：在mtDNA高变区Ⅰ(HVSⅠ)16091～16418之间与Anderson序列比较共发现有66处碱基突变，62个单倍型，碱基突变的主要形式为碱基替代，其中转换87％，颠换11％，碱基插入1％，碱基缺失0．5％．保安族线粒体DNA HVS Ⅰ区基因差异度为0．9862，偶合概率为0.0237。结论：保安族与其他群体比较有其独特的线粒体DNA序列遗传特点，与亚洲其他人种及高加索人种有明显差异。保安族线粒体DNA序列多态性不仅有别于西方人种，也与其他东亚人种不同，线粒体DNA控制区HVS Ⅰ序列多态性可用于法医学个体识别及亲权鉴定。     

线粒体DNA HVR区Ⅰ序列突变与肺鳞癌关系的研究

目的分析肺鳞癌患者外周血白细胞及其癌组织线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)非编码区(又称D-环)高变区Ⅰ(hypervariable regionⅠ,HVRⅠ)序列的突变情况并探讨其意义.方法应用改良一步法制备13例肺鳞癌患者外周血白细胞及肺鳞癌组织mtDNA,PCR产物直接测序,对比分析HVRⅠ区序列突变情况.结果13例肺鳞癌患者癌组织mtDNA HVRⅠ区中,有8例出现了突变,占61.54%;在25个不同位点上共发现30个突变,其中点突变占56.67%(17/30),插入和缺失突变占43.33%(13/30),并发现1例肺鳞癌病人存在10bp片段的缺失.结论肺鳞癌患者癌组织细胞mtDNA HVRⅠ区突变发生率高,其中点突变占有重要地位,插入和缺失突变也不可忽视.     

大肠癌细胞线粒体DNA与NIH3T3细胞核基因组整合的荧光原位杂交分析

目的:观察大肠癌细胞突变的线粒体DNA(mtDNA)转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3后,mtDNA与转染细胞核内基因组的整合情况.方法:将携带大肠癌细胞突变mtDNA的重组质粒pcDNA3.1( )-Sw480 mtDNA、pcDNA3.1( )-NHWBC mtDNA及空质粒pcDNA3.1( )通过脂质体法转染NIH3T3细胞.同时用PCR法制备3条相应的绿色荧光蛋白标记的mtDNA探针.分离转染的NIH3T3细胞核内染色体,用荧光原位杂交(FISH)法检测mtDNA探针与核内基因组的整合情况.结果与结论:瞬时转染的NIH3T3细胞核基因组上存在mtDNA的同源序列.外源肿瘤细胞mtDNA与NIH3T3细胞核内基因组发生整合.     

小鼠真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1的构建及表达

目的:通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-FGFR1,并检测其在CHO细胞中的表达。方法:通过PCR扩增FGFR1的全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入pcDNA3.1(+)真核表达质粒,经限制内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体包裹转染CHO细胞,Western blot检测FGFR1目的蛋白的表达。结果:经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染CHO细胞后可表达FGFR1目的蛋白。结论:成功构建的pcDNA3.1(+)-FGFR1重组质粒能在体外表达FGFR1目的蛋白。     

人真核表达质粒载体pcDNA3.1-hOPG的构建及体外表达

目的 构建表达人骨保护素基因（hOPG）的真核表达质粒pcDNA3．1-hOPG,并检测其在体外的表达,为治疗破骨细胞功能异常引起的骨吸收提供实验基础。方法 从MGC：29565上获得hOPG基因片段并用PCR方法扩增,将其连接于真核表达质粒pcDNA3．1（-）,测定序列后,用脂质体包裹转染C2C12细胞,采用免疫组化和骨吸收抑制实验检测OPG的表达及功能。结果 经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染C2C12细胞后可表达功能性OPG蛋白。结论成功构建的pcDNA3．1-hOPG重组质粒能在体外表达OPG蛋白。     

TCR Vβ8/pcDNA3.1重组质粒的构建

目的：构建重组质粒TCRVβ8／pcDNA3．1。方法：从人淋巴瘤Jurkat细胞中提取mRNA，经RT－PCR法获取TCRVβ基因；将表达质粒pcDNA3．1和TCRβ基因行BamHI和HindⅢ双酶切、低熔点胶纯化、连接酶切产物、转化DH5a感受态细菌、筛选菌落和测序鉴定。结果：电泳获得523bp的TCRVβ8预期条带，测序证实为正确的TCRVβ目的基因序列。结论：测是构建TCRVβ8／pcDNA3．1重组质粒的重要步骤。     

pcDNA3.1-mAFP真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建真核表达载体pcDNA3．1-mAFP，观察其在293肿瘤细胞中的表达情况。方法从Hepal-6小鼠肝癌细胞中提取总RNA，设计特异性引物，通过RT-PCR法扩增小鼠甲胎蛋白（mAFP）基因编码区全长序列，测序确认后，插入到pcDNA3．1真核表达载体中，双酶切鉴定。用Lipofectamine脂质体将构建的重组载体转染293肿瘤细胞，检测AFP蛋白在293细胞中的表达情况。结果成功克隆了mAFP基因编码区全长序列，构建出重组真核表达载体pcDNA3．1-mAFP，脂质体转染后可检测到mAFP基因在293细胞中的表达。结论该研究成功构建了重组pcDNA3．1-mAFP真核表达载体，为进一步开展原发性肝癌的靶向性基因治疗奠定了基础。     

真核表达质粒pcDNA3.1a-FGFR1构建及意义

目的:构建真核表达质粒pcDNA3.1a-FGFR1.方法:通过PCR扩增FGFR1目的片段,双酶切纯化PCR产物及pcDNA3.1a,将扩增的FGFR1基因片段插入pcDNA3.1a线性质粒,即构建成pcDNA3.1a-FGFR1真核表达质粒,将质粒转化感受态DH5α菌株,筛选阳性克隆行双酶切鉴定及测序鉴定.结果:酶...     

结核分枝杆菌新抗原Mtb8.4基因的克隆及真核表达载体的构建

目的 克隆结核杆菌新抗原Mtb8.4基因，并构建真核表达载体pcDNA3.1( )—mtb8.4。方法 提取人结核杆菌H37Rv株的基因组作为模板，进行PCR扩增，获得mtb8．4目的基因后，与pcDNA3．1( )载体进行连接重组。结果 pcDNA3．1( )—mdt8.4真核表达栽体构建完成后，用限制性内切酶消化、PCR及DNA序列分析等多种方法进行鉴定，证实其构建成功。结论 pcDNA3.1( )—mtb8．4真核表达质粒的成功构建，为进一步研究该真核表达质粒的免疫保护效果及制备结核病pcDNA3．1( )—mtb8.4DNA疫苗奠定了基础。     

人pcDNA3.1(+)-Cav-1真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建pcDNA3.1 (+)-Cav-1真核表达载体,建立稳定转染pcCav-1的6-10B细胞系(6-10B-Cav-1).方法 提取5-8F细胞总RNA,利用RT-PCR获取caveolin-1(Cav-1)开放读码框(Open reading frame,ORF)序列构建Cav- 1/TA亚克隆载体,再将双酶切后的目的片段连入pcDNA3.1(+)真核表达载体并转染6-10B细胞.结果 RT-PCR扩增Cav-1基因ORF序列在783 bp附近见目的条带;质粒酶切鉴定及菌落PCR鉴定分别在783 bp及346 bp附近见目的条带;转染6-10B细胞后,转染组与对照组相比,Cav-1在mRNA水平表达差异具有统计学意义(P =0.027),在蛋白质水平前者比后者高出2倍以上.结论 人Cav-1重组真核表达载体pcDNA3.1( +)-Cav-1构建成功并获得稳定表达Cav -1的6-10B细胞,为进一步检测C av -1在鼻咽癌转移过程的作用奠定基础.