兔骨髓基质干细胞体外定向分化为软骨细胞

目的体外诱导兔骨髓基质干细胞（BMSC）向软骨细胞定向分化，并对分化后的细胞进行鉴定。方法选用16周新西兰大白兔，于胫骨或股骨抽取骨髓，经梯度离心、培养、扩增，取第3代BMSC按一定比例种植于6孔板中，并加入含有转化生长因子β1、地塞米松和维生素C的培养液、于不同时间点取材固定，甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴别、结果诱导的软骨样细胞甲苯氨蓝异染性；II型胶原免疫组化阳性。结论在本实验条件下，获取的兔BMSC生长稳定、增殖快，并成功地诱导其向软骨细胞表型转化。     

新型快速成形的三维多孔支架材料构建组织工程软骨

目的:探讨以骨髓基质细胞(BMSC)为种子细胞,以快速成形的生物相容性材料为支架构建组织工程软骨的可行性.方法:成年兔BMSC在成软骨培养液中诱导培养,使之具有软骨细胞表型后,接种于快速成形的生物相容性三维支架材料聚乳酸/聚羟乙酸共聚物(poly-lactic-co-glycolic acid,PLGA),经体外培养扩增2 wk后植入自体肌袋,术后8 wk取材,进行组织学、甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组织化学观察.结果:成年兔BMSC在体外可诱导为软骨细胞,接种于三维支架材料培养后,扫描电境观察见细胞在支架上可大量扩增;接种细胞的支架植入自体肌袋8 wk,可形成软骨样组织,甲苯胺蓝染色及II型胶原免疫组化染色阳性.结论:具有软骨细胞表型的BMSC接种于快速成形的三维支架材料在体内非关节环境可形成软骨样组织.     

兔骨髓基质干细胞的培养及成骨诱导研究

目的观察体外培养条件下兔骨髓基质干细胞的主要生物学特性及向成骨细胞分化的能力。方法取兔股骨,冲洗骨髓腔,进行细胞的贴壁体外培养,培养至第四代加入含成骨诱导剂的DMEM培养基与空白组为对照组;噻唑蓝（MTT）检测两组骨髓基质干细胞的增殖能力,进行成骨细胞的钙结节茜素红染色与I型胶原的免疫组化染色。结果骨髓基质干细胞7-14 d可见少量的集落形成,24 d时观察见细胞基本铺满瓶底。在矿化液条件下培养1周左右,细胞间出现了致密圆形团,同时细胞的增殖能力较常规培养有所降低;茜素红染色结果显示矿化细胞间出现的致密的、圆形不透光团块呈现片状的棕染,着色区域,I型胶原的免疫组化染色强阳性。结论贴壁筛选法培养骨髓基质干细胞,操作简单,细胞易于成活,不失为一种良好的方法;虽然矿化液可使其向成骨细胞转化,但增殖速度变慢。     

诱导兔骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞和软骨细胞的研究

目的 探讨兔骨髓间充质干细胞(MSC)体外分离培养、增殖，以及向成骨细胞和软骨细胞定向诱导分化的条件，为骨、软骨缺损的修复和重建提供种子细胞。方法 抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液，经密度梯度离心法及塑料板贴壁培养法分离纯化出MSC，并增殖。对第2代MSC进行成骨矿化诱导，测定其碱性磷酸酶(ALP)活性及成骨矿化情况。并对第2代MSC进行软骨特定培养液诱导，对诱导细胞进行甲苯胺蓝染色，测定诱导后的软骨细胞表型。结果 MSC为梭型的成纤维细胞样贴壁生长，增殖能力强。在成骨诱导剂作用下，MSC具有成骨能力，诱导后ALP活性明显提高，并且出现矿化结节沉积。在成软骨诱导剂作用下，可见细胞由成纤维样的梭形变为椭圆形及肾形，并分泌基质，甲苯胺蓝染色呈阳性，表现为软骨细胞分化特点。结论 在特定诱导条件下，兔骨髓MSC体外定向诱导分化为成骨细胞和软骨细胞，为骨和软骨组织工程的修复和重建提供实验依据。     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导移植修复关节软骨的实验研究

目的：通过诱导兔骨髓间充质干细胞（MSCs）,观察干细胞向软骨细胞的分化效果。方法：纯化兔骨髓间充质干细胞;用含转化生长因子β1的诱导液培养骨髓间充质干细胞;以MTT测定诱导细胞的增殖活性;免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白的表达;诱导后的细胞移植于白兔膝关节内,X线摄片观察软骨修复形成情况。结果：诱导液可有效诱导MSCs向软骨细胞表型转化,且骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化所需的特异性细胞外基质——Ⅱ型胶原明显升高,移植后效果明显。结论：兔骨髓间充质干细胞定向诱导后移植修复关节软骨是有效的。因此骨髓间充质干细胞有可能成为软骨组织工程较理想的种子细胞来源。     

骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的:寻找良好的软骨组织工程种子细胞.方法:抽取兔骨髓液,分离纯化骨髓液中的间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)并传代扩增.将第3代BMSCs分成实验组和对照组,实验组用10%胎牛血清的LG-DMEM培养液加入转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和地塞米松联合诱导,对照组用10%胎牛血清的LG-DMEM培养液自然分化.在诱导4、7、14 d后,分别用甲苯胺蓝染色检测细胞蛋白多糖的表达,Ⅱ型胶原免疫组化染色检测细胞Ⅱ型胶原的表达并计算阳性率.结果:BMSCs取材方便,体外培养生长稳定,细胞活性好.实验组BMSCs向软骨细胞分化,细胞甲苯胺蓝染色异染,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性率(72.51±9.49)%与对照组(2.15±1.88)%相比,差异有统计学意义(P<0.05).结论:BMSCs是软骨组织工程良好的种子细胞.     

犬骨髓基质千细胞向软骨样细胞诱导分化的条件研究

目的研究犬骨髓基质干细胞在体外培养中定向诱导分化为软骨样细胞的最佳条件。方法从幼年犬骨髓中分离基质干细胞进行培养扩增,观察其生长特性,体外应用碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子β1（TGF．B1）对第3代传代细胞诱导分化,并通过细胞的染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化细胞的类型。结果原代培养的基质干细胞集落融合周期约6～9d左右。第3代传代细胞经碱性成纤维细胞生长因子（b—FGF）和转化生长因子（TGF．131）诱导后,传代细胞在形态上呈软骨样改变;甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性。结论犬骨髓基质干细胞在体外培养在碱性成纤维细胞生长因子（b—FGF）和转化生长因子（TGF—β1）作用下可被诱导分化为软骨样细胞。     

犬骨髓基质干细胞分离培养与向软骨样细胞诱导分化的研究

【目的】探讨犬骨髓基质干细胞的提取、分离和体外扩增的最佳条件,研究其在体外培养中定向诱导分化为软骨样细胞的可能。【方法】从幼年犬骨髓中分离基质干细胞进行培养扩增,观察其生长特性,体外应用碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子β1（TGF-β1）对第3代传代细胞诱导分化,并通过细胞的染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化细胞的类型。【结果】原代培养时形成由基质干细胞组成的细胞集落融合周期约6～9d左右。第3代传代细胞经碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子（TGF-β1）诱导后,传代细胞在形态上呈软骨样改变;甲苯氨蓝异染性、阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性。【结论】犬骨髓基质干细胞在体外培养条件下生长良好和持续扩增,在碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）和转化生长因子（TGF-β1）作用下可被诱导分化为软骨样细胞。     

犬骨髓基质干细胞分离培养与向软骨样细胞 诱导分化的研究

 【目的】 探讨犬骨髓基质干细胞的提取。分离和体外扩增的最佳条件,研究其在体外培养中定向诱导分化为软骨样细胞的可能。【方法】 从幼年犬骨髓中分离基质干细胞进行培养扩增,观察其生长特性,体外应用碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子-B1(TGF-B1)对第3代传代细胞诱导分化,并通过细胞的染色和Ⅱ型胶原免疫组化鉴定诱导分化细胞的类型。【结果】 原代培养时形成由基质干细胞组成的细胞集落融合周期约6 ~ 9 d左右。第3代传代细胞经碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子(TGF-B1)诱导后,传代细胞在形态上呈软骨样改变;甲苯氨蓝异染性。阿新蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性。【结论】 犬骨髓基质干细胞在体外培养条件下生长良好和持续扩增,在碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和转化生长因子(TGF-B1)作用下可被诱导分化为软骨样细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外成软骨诱导研究

目的:研究人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在体外培养过程中的增殖和成软骨分化现象和规律。方法:以密度梯度离心法分离健康成人髂骨MSCs,观察体外培养过程中细胞形态、生长和增殖现象。取第三代细胞给予地塞米松,维生素C和不同剂量转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)行成软骨细胞诱导。3周后行阿利新蓝及甲苯胺蓝染色蛋白多糖,免疫荧光检测II型胶原,阿利新蓝比色法检测葡萄糖氨基聚糖。结果:体外培养条件下MSCs生长旺盛。在TGF-β1作用下MSCs向软骨骨细胞分化,TGF-β110μg/L组软骨细胞标志物表达最强。结论:MSCs有旺盛的增殖能力。MSCs在一定诱导条件下可以向软骨细胞分化,转化生长因子β1(TGF-β1)是诱导MSCs向软骨分化的关键性因素,10μg/L是其最佳诱导剂量。     

转化生长因子β1诱导时间对骨髓基质细胞体外成软骨分化的影响

目的：探讨转化生长因子β1（TGF-β1）诱导时间对骨髓基质细胞（BMSC）体外成软骨分化,及构建组织工程化软骨的影响。方法：将体外培养扩增的第二代猪BMSC按5．0×10^7个／ml的密度接种于聚羟基乙酸（PGA）制成的圆柱形支架材料上,第5天开始应用含TGF-β1（10μg/L）、IGF-I（50μg/L）和地塞米松（40μg/L）的软骨诱导液培养。按TGF-β1诱导时间的不同分为A（诱导2周）、B（诱导4周）、C（诱导6周）、D（诱导8周）和E（诱导10周）5组。体外培养10周后取材行大体观察、组织学和组织化学检测、聚合蛋白多糖（GAG）定量分析和生物力学测定,同时利用Western印迹和免疫组织化学进行Ⅱ型胶原表达的分析。结果：随诱导时间延长,软骨陷窝由周边开始逐渐向内部增多,排列渐趋均匀,蛋白聚糖等软骨特异性基质成分积聚。免疫组化染色及Western印迹结果均显示Ⅱ型胶原含量随诱导时间延长逐渐递增。这种情况至诱导6周后逐渐稳定,诱导6周和诱导10周间差异无统计学意义。诱导6周以上组弹性模量和抗压强度均明显高于A、B两组。结论：利用BMSC作为种子细胞构建组织工程化软骨,诱导持续时间与形成的软骨质量相关,6周的诱导时间基本可以形成具有良好组织结构、化学组成和力学性质的软骨组织。     

兔骨髓基质细胞的体外培养

目的 :比较用全骨髓法和离心法培养兔原代骨髓基质细胞 (BMSC)的差异 ,同时观察BMSC在体外培养时的生长特征及体外诱导为成骨细胞的可能性。方法 :抽取新西兰大白兔骨髓 ,分别用全骨髓法和密度梯度离心法进行原代培养 ,比较第 12d收获细胞的数量。传代后观察 1～ 6代细胞的生长特征 ,绘制生长曲线 ,测定分裂指数和贴壁率 ;同时将部分第 3代细胞进行诱导培养 ,第 16d计算碱性磷酸酶 (ALP)阳性细胞率。结果 :全骨髓法较离心法收获细胞数量少 (P <0 .0 5 ) ,1～ 6代细胞的生长特征相似 ,增殖能力强。第 3代细胞被成功地诱导为成骨细胞 ,第 16dALP阳性细胞率为 80 %。结论 :离心法较全骨髓法培养BMSC可得到较多的细胞 ,两种方法得到的细胞前 6代细胞均有较强的增殖能力 ,并可以诱导为成骨细胞 ,可作为骨组织工程用的种子细胞     

大鼠骨髓间充质干细胞向软骨、脂肪和神经元样细胞分化的研究

目的：探讨体外大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs）多向分化潜能。 方法：从大鼠骨髓中获得间充质干细胞,体外培养传代。通过地塞米松、TGF-β1和维生素C诱导rMSCs向软骨细胞分化,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学检测Ⅱ型胶原进行鉴定。通过地塞米松和胰岛素诱导rMSCs向脂肪细胞分化,采用苏丹Ⅳ染色鉴定。在含IBMX、GDNF和IL-1β的培养基中诱导rMSCs向神经元样细胞分化,免疫细胞化学方法检测神经细胞特异标志NSE和MAP-2a,b。 结果：rMSCs被诱导7 d后,分化成软骨细胞,甲苯胺蓝异染阳性、Ⅱ型胶原阳性。被诱导10 d后,分化成脂肪细胞,苏丹Ⅳ染色阳性。被诱导7 d和15 d后,分化成神经元样细胞,表达NSE和MAP-2a,b,15 d后NSE阳性率是(20.060±0.790)%,MAP-2a,b阳性率是(17.364±5.738)%。 结论：体外rMSCs被诱导分化成软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞,证明其具有多向分化潜能, 是组织工程研究中最有前途的种子细胞之一。     

软骨形态发生蛋白1诱导真皮成纤维细胞表达软骨细胞表型的实验研究

目的应用软骨形态发生蛋白(CDMP)生长因子,体外诱导真皮成纤维细胞向成软骨细胞表型分化,探讨其作为组织工程化软骨种子细胞的可行性.方法取包皮环切术后丢弃真皮组织共3例,成纤维细胞体外培养扩增至第二代,以1×104/cm2密度接种,12 h后加入细胞诱导液(10%胎牛血清F-12培养液,CDMP1终浓度为100 ng/ml)单层培养,未加的成纤维细胞培养用CDMP1为对照.诱导7 d后观察细胞形态变化,Image Plus图像分析软件计算细胞长宽比例.激光共聚焦显微镜分别观察诱导前后细胞内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原表达及分布,Western印迹检测诱导前后细胞Ⅱ型胶原蛋白表达.反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测诱导后成软骨相关的Sox9、聚集蛋白聚糖与Ⅱ、Ⅸ型胶原mRNA表达;同时检测与成骨相关的X型胶原、碱性磷酸酶(AKP)mRNA表达.培养第二代细胞以2×107个细胞/ml细胞密度进行离心管法培养,诱导14 d后行阿辛蓝与Ⅱ型胶原免疫组化染色.结果诱导后可见单层培养的成纤维细胞形态由长梭形向软骨细胞样多角形转变,Image Plus图像分析软件计算细胞诱导后的长宽比例为(1.40±0.15),较诱导前(7.40±1.30)差异有显著意义(P＜0.05);与正常软骨细胞(1.29±0.24)差异无显著意义.免疫荧光激光共聚焦观察发现诱导后细胞内出现Ⅱ型胶原表达,Ⅰ、Ⅲ型胶原表达呈阳性.RT-PCR检测成软骨相关的Sox9,聚集蛋白聚糖,Ⅱ、Ⅸ型胶原mRNA表达阳性;X型胶原、AKP未检测到mRNA阳性表达.Western印迹检测细胞诱导后Ⅱ型胶原蛋白表达阳性.离心管培养诱导7 d后阿辛蓝染色示糖胺聚糖(GAG)均匀分布于基质中,免疫组化染色示基质中Ⅱ型胶原表达阳性.结论第二代成人真皮成纤维细胞在CDMP1生长因子诱导下可向成软骨细胞表型分化,并能分泌软骨细胞特异性基质,有望成为软骨组织工程新的种子细胞来源.     

幼龄及成龄鼠骨髓基质干细胞生物学特性的比较

目的比较幼龄及成龄大鼠骨髓基质干细胞体外培养过程中生物学特性的差异.方法取3周及3月龄SD大鼠股骨骨髓原代培养基质干细胞.第2代细胞添加诱导成骨培养液,分别通过相差显微镜观察细胞生长,MTT法检测细胞增殖,钙钴法、茜素红染色了解体外矿化,测定细胞总蛋白含量,RT-PCR测Ⅰ型胶原mRNA表达,透射电镜了解细胞及胞外基质分泌来比较两者差异.结果幼鼠细胞增殖更快,倍增时间4.8 d;培养第7天出现较多集落;钙钴法、茜素红染色深染细胞数目多,结节典型;细胞总蛋白含量高.成龄鼠细胞增殖相对慢,倍增时间5.4 d;未见细胞集落,钙化呈片状;细胞总蛋白含量较低.两者琼脂糖电泳均可显示Ⅰ型胶原mRNA条带;超微结构内质网丰富,胞外基质为前胶原样结构.结论不同鼠龄的骨髓基质干细胞经体外诱导均可分化为成骨细胞,考虑到细胞增殖及成骨潜能,幼鼠基质干细胞是研究细胞/生物材料相互作用更理想的工具.     

人骨髓源性神经样细胞的形态及超微结构

目的:探讨人骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSC)分化形成的神经样细胞的形态及结构特征。方法:采用密度梯度离心法和贴壁培养的方法分离纯化人BMSC,流式细胞仪检测CD34、CD45、CD44等细胞表面抗原在BMSC上的表达。联合应用碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor,bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、二甲基亚枫(di methyl sulphoxide,DMSO)和丁羟基茴香醚(butylhydroxy anisol,BHA)诱导人BMSC向神经细胞分化。光学显微镜下观察细胞的形态变化;甲苯胺蓝染色法对分化后细胞进行尼氏体染色;透射电子显微镜观察分化后细胞的超微结构特点。结果:分离纯化的人BMSC经流式细胞仪检测显示间充质干细胞相对特异性抗原CD44表达阳性,造血干细胞特异性抗原CD34、CD45表达阴性;加入诱导培养基培养2周后,细胞胞体变圆,折光性增强,有突起形成;甲苯胺蓝染色法显示分化后的细胞尼氏体染色阳性;透射电镜下细胞胞浆中有大量密集的呈扁平囊状的粗面内质网及其间的一些游离核糖体和多聚核糖体所组成的尼氏体的超微结构,并有神经微丝的形成。结论:EGF/bFGF/DMSO/BHA诱导人BMSC分化形成的神经样细胞能够表达成熟神经细胞典型的形态及超微结构特征。     

体外诱导骨髓基质细胞向神经细胞分化的形态学观察

目的:探讨骨髓源性神经干细胞分化为神经细胞的可行性,为中枢神经组织损伤修复寻找种子细胞的理想来源.方法:无菌取成大鼠长骨骨髓,密度梯度离心分离后获得骨髓基质细胞(BMSC),在神经干细胞培养液及细胞因子等条件下诱导其分化为神经元样细胞.结果:增殖培养24～72h见细胞分裂像和克隆单位;继续增殖培养仍可见细胞克隆(干细胞特性);诱导培养第10日有成熟神经细胞形成.说明BMSC在体外培养条件下,经过多种因子的"程序性"作用,可以向神经干细胞、成熟神经元及胶质细胞方向分化.结论:在适宜培养条件及诱导因子联合作用下,BMSC可成功诱导出神经元样细胞.     

兔髓核细胞原代培养及其生物学特性的实验研究

目的建立兔髓核组织体外直接分离培养的方法及其相关生物学特性的测定。方法取2周龄健康日本大耳白兔,无菌条件下分离出椎间盘凝胶状髓核组织,直接加入含有20%FBS的DMEM培养液中培养,倒置显微镜下观察原代髓核细胞的形态;细胞爬片培养后进行甲苯胺蓝和番红O染色观察;通过RT-PCR法,免疫组化法检测Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达;MTT法绘制髓核细胞生长曲线。结果髓核细胞甲苯胺蓝和番红O染色显示阳性;Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和蛋白聚糖免疫组化荧光检测呈阳性;RT-PCR鉴定发现细胞Ⅱ型胶原mRNA和蛋白聚糖mRNA表达阳性;MTT生长曲线与体外细胞培养时生长过程相符。结论成功建立了髓核组织直接分离培养方法,原代髓核细胞生长状态良好,为组织工程髓核的种子细胞研究提供了实验依据。