应用寡核苷酸探针膜杂交方法快速检测耐异烟肼结核分支杆菌基因型

目的应用寡核苷酸探针膜反向斑点杂交技术快速检测结核分支杆菌对异烟肼(isoniazid,INH)耐药性.方法设计与合成用于检测结核分支杆菌耐INH基因katG、inhA的寡核苷酸探针,点于硝酸纤维素膜上,与结核分支杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应(PCR)产物进行反向斑点杂交,并与PCR-单链构象多态性(Polymerase chain reaction-Single stranded conformation polymorphism,PCR-SSCP)和PCR-直接测序(PCR-direct sequencing,PCR-DS)结果比较.结果 20株INH敏感株中,仅9株出现野生型探针K1阳性杂交,余11株中,10株K1b'杂交阳性,PCR-DS显示katG基因315位密码子AGC→ACC,1株K1c'杂交阳性,PCR-DS显示katG基因315位密码子AGC→AAC;15株出现野生型探针inh1阳性杂交,另5株Inha1探针杂交阳性,PCR-DS显示inhA基因-15位C→T突变.36株耐药株中,17株K1探针杂交阳性,18株K1b'杂交阳性,1株与所试探针不杂交,PCR-DS显示katG基因279位密码子GGC→GAC;11株与突变型Inha1探针阳性杂交,25株与野生型探针inh1杂交阳性.katG基因膜杂交突变检出率为 50 %,inhA基因膜杂交突变检出率为 30.56 %.结论寡核苷酸探针膜杂交技术可能成为检测部分结核分支杆菌耐异烟肼基因型简便、快速的方法.     

结核分支杆菌异烟肼耐药的分子机制及其快速鉴定

目的：探讨快速检测结核分支杆菌异烟肼耐药的分子药敏方法。方法：用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)检测了20株异烟肼(INH)敏感的结核杆菌临床分离株，20株INH耐药株的katG基因，随后用SSCP方法鉴定扩增产物有无突变，以结核分支杆菌H37RV作对照。结果：所有INH敏感株均观察到katG基因扩增产物，20株INH耐药株中19株观察到katG基因扩增产物。以H37RV标准株为对照，20株敏感株SSCP带谱与对照相同；19株INH耐药株中8株与对照相同，11株有不同程度的差异，INH耐药katG基因突变或缺失的阳性率为60％。结论：多数结核分支杆菌耐INH是由于其katG基因突变所致，用PCR-SSCP筛选突变株可达到快速检测结核分支杆菌INH耐药的目的。     

应用基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐异烟肼基因型

目的研制一种新型DNA芯片,用于快速检测结核分枝杆菌耐异烟肼katG基因突变。方法根据结核分枝杆菌katG基因序列设计探针并制作DNA芯片,用四甲基罗丹明标记的引物扩增结核分枝杆菌katG基因突变热点的片断,与DNA芯片杂交,同时以聚合酶链反应-单链构象多态性(pdymerase chain reaction-single stranded conformation polymorphism,PCR-SSCP)和DNA测序法为对照。结果153株结核分枝杆菌临床分离株中30株异烟肼敏感株的PCR-SSCP和DNA芯片杂交结果与结核分枝杆菌标准株完全相同,123株异烟肼耐药株中有85株检测到katG基因突变,占69.1%(85/123)。其中83株为315位密码子AGC→ACC突变,2株为315位密码子AGC→AAC突变,该突变与PCR-SSCP和DNA芯片杂交结果一致;余38株未检测到突变,经测序证实其中1株PCR-SSCP有不同突变的为279位密码子GGC→GAC突变,因芯片上未点该位点的探针,所以杂交结果为阴性。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐异烟肼分离株的katG基因突变,可用于临床耐药性的检测,指导临床用药。     

PCR反向膜杂交技术检测临床标本中结核分支杆菌的临床意义

目的探讨聚合酶链反应(PCR)反向膜杂交技术检测临床标本中结核分支杆菌(TB)DNA的价值.方法用PCR反向膜杂交技术检测522例结核及60例非结核患者临床标本中的TB-DNA,同时用培养、抗酸染色涂片及常规PCR法作对照.结果PCR反向膜杂交法阳性率为80.6%(556/690),培养为18.1%(125/690),镜检为13.9%(96/690),常规PCR为59.6%(411/690),PCR反向膜杂交法与常规法比较(P＜0.001),差异具显著意义.PCR反向膜杂交法阳性检出率高于常规PCR,差异具显著意义(P＜0.001);该技术假阳性为零.结论PCR反向膜杂交技术检测临床标本中TB-DNA具有快速、高度特异性和敏感性,可为结核病的临床早期诊断提供一种新的病原学诊断手段.     

反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌3种耐药相关基因

目的:观察膜反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌(MTB)对异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)耐药性的效果.方法:用ropB、katG、inhA、rpsL基因的寡核苷酸探针与结核分枝杆菌PCR产物进行反向斑点杂交,并将结果与绝对浓度法药敏试验结果进行比较.结果:INH、RFP和SM的耐药基因检测灵敏度分...     

膜反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌耐乙胺丁醇基因型

目的应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌对乙胺丁醇（EMB）耐药性。方法设计与合成用于检测结核分枝杆菌耐EMB基因embB的寡核苷酸探针，点于硝酸纤维素膜上，与结核分枝杆菌临床分离株生物素标记的聚合酶链反应（PCR）产物进行反向斑点杂交，并与PCR-直接测序（PCR—DS）结果比较。结果27株结核分枝杆菌临床分离株中，14株敏感株膜反向斑点杂交结果与标准株完全相同；13株耐乙胺丁醇临床分离株检测到embB基因突变。均为306位密码子ATG→GTG、ATG→CTG、ATG→ATA、ATG→ATT和ATG→ATC突变．该突变与直接测序结果完全一致。结论膜反向斑点杂交技术可能成为检测部分结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因型简便、快速的方法。     

耐多药结核分支杆菌突变基因检测

目的：研究耐多药结核分支杆菌耐药分子机制,建立快速检测耐药基因型的分子药敏试验方法,方法：通过16S rRNA聚合酶链反应单链的构象多态性（polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)方法对30株耐多药分离株和20株药物敏感株进行初步分子菌种鉴定。通过PCR－SSCP分析30株耐多药结核病临床分离株的rpoB,katG,rpsL基因。结果：经16S rRNA PCR-SSCP菌种鉴定,所分析菌株均为结核分支杆菌;30株耐多药分离株经SSCP分析,56．7％存在rpoB基因突变,43．3％有katG基因突变,91．3％有rpsL基因突变,结论：rpoB,rpsL,katG基因突变分别是结核分支杆菌耐利福平,链霉素,异烟肼的分子机制,耐多药结核病是药物靶基因突变所致。通过PCR－SSCP可简便,快速地检测大部分耐多药结核病的耐药基因。     

结核病临床标本中结核分支杆菌利福平耐药基因型的快速测定

目的：建立快速测定结核临床标本中结核分支杆菌RFP耐药性的方法，探讨其应用价值。方法：应用PCR－SSCP银染色法和EB染色法对58株结核分支杆菌临床分离株和17例临床标本的rpoB基因进行分析。结果：PCR－SSCP分析结核分支杆菌rpoB基因的敏感性为1～10PgDNA；通过SSCP图谱分析可特异检测结核分支杆菌的rpoB基因突变。32株RFP耐药株中30株（93．8％）发生rpoB基因突变，呈现四种类型的异常SSCP图谱；26株RFP敏感株中1株（3，8％）有rpoB突变。2例涂片阳性培养阳性结核性疾标本有rpoB基因突变，与常规药敏试验相符；5例涂片阳性培养阴性和10例涂阴培阴的结核性标本均未发现rpoB基因突变。结论：大部分结核分支杆菌RFP耐药性产生是由于其rpoB基因突变所致，采用PCR－SSCP方法可快速测定结核病临床标本中结核分支杆菌RFP耐药基因型。     

等位特异PCR检测结核分支杆菌耐异烟肼基因katG突变研究

目的 建立等位特异多聚酶链反应检测结核分支杆菌耐异烟肼基因katG 突变的快速敏感检测方法。方法 利用在PCR时，3′端的碱基如果与模板DNA不配对，PCR扩增阴性的原理，根据我们对katG基因突变特点的研究结果，建立了AS－PCR检测katG基因突变的方法。结果 AS－PCR检测结核菌耐异烟肼相关基因katG的敏感性为85％，特异性达90％。15株经测序证实有katG突变的菌株，AS－PCR检测均为阳性。二者的符合率为100％。与PCR－SSCP检测的总符合率为88％，阳性符合率81．0％，阴性结果的符合率为93．1％。检测试验可在数小时内完成。结论 AS－PCR方法是检测结核菌耐异烟肼基因突变的敏感方法，可为临床医师提供判断结核菌对异烟肼是否敏感的依据。     

几种方法检测结核分支杆菌的比较

目的：评价聚合酶链反应（PCR）,细菌培养,抗酸染色,荧光染色对结核病的诊断价值。方法：PCR检测43例临床标本中结核分支杆菌（MTB）DNA,并与常规细菌学检测作对比。结果：PCR检测法敏感性为48.8%,荧光染色法为44.2%。细菌培养为32.6%,抗酸染色法为25.6%。结果表明,PCR法检测结核分支杆菌较抗酸染色法更敏感。结论：PCR法具有简便快速的特点。对结核病有较高的诊断价值。     

膜-反向斑点杂交技术检测肺结核患者肺组织和肺泡灌洗液中的结核杆菌

目的探讨膜-反向斑点杂交技术（RDB）在病理石蜡组织和肺泡灌洗液检测结核杆菌的临床应用价值。方法以97例病理石蜡组织、97例肺泡灌洗液为研究对象,分别以膜-反向斑点杂交、实时荧光PCR（RT—PCR）、抗酸染色三种方法检测结核杆菌,对三种方法进行方法学评价。结果结核组病理石蜡组织、肺泡灌洗液三种方法检测的总阳性率分别为：抗酸染色为32．8％,RT—PCR阳性率为82．8％,RDB阳性率为89．9％,两两比较差异均有统计学意义（均P〈0．05）,对照组三种方法检测结果均为阴性;三种结核杆菌的检测方法的方法学评价,RDB灵敏度（90．6％）、约登指数（0．91）、符合率（93．9％）、阴性预测值（85．0％）均较好。结论膜-反向斑点杂交技术在病理石蜡组织和肺泡灌洗液结核杆菌的检测上有很高的临床应用价值,值得临床推广应用。     

反向斑点杂交法快速检测嗜肺军团菌

目的　探讨早期、快速检测嗜肺军团菌的方法。方法　根据嗜肺军团菌特异的巨噬细胞感染增强子mip基因设计引物 ,通过聚合酶链反应合成一段特异的 2 6 0bp长链DNA探针 ,采用反向斑点杂交法检测生物素标记细菌DNA ,并应用于痰标本的检测。结果　所合成的 2 6 0bpDNA探针具有高度特异性 ,只和嗜肺军团菌杂交 ,与其他细菌、真菌、病毒无交叉反应 ,该探针最低可检测出 1ng的细菌DNA。杂交法和培养法分别检测 10 0份痰标本 ,两者的阳性率分别为 8%和 2 %。结论　该方法快速、特异 ,对嗜肺军团菌的早期诊断具有较高的应用价值。     

结核分枝杆菌耐异烟肼基因突变的快速检测

目的：探讨编码过氧化氢-过氧化物酶的katG基因突变与结核分枝杆菌异烟肼(INH)耐药性的相关关系。方法：根据结核分枝杆菌genebank中katG序列，自行设计特异性寡聚核苷酸引物，采用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)分析和直接测序法(direct sequencing，DS)分析结核分枝杆菌中katG基因突变情况．以H37，Rv标准株为对照。结果：所有23株敏感菌均未有SSCP结果异常；35株耐药菌中，有2株(5．7％)katG基因扩增阴性，且发生在高度耐药菌中．进一步分析发现，SSCP法突变检出23株(65．7％)，测序法突变检出24株(68．6％)，符合率为95．8％(23／24)．结论：参照测序法对耐药菌突变序列的分析结果，PCR-SSCP敏感、特异，可快速检测结核分枝杆菌katG耐药基因突变，有利于耐药结核分枝杆菌耐药性的快速检测。     

应用基因芯片技术检测耐利福平结核分枝杆菌基因型

目的研制一种新型DNA芯片，用于快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变。方法根据结核分枝杆菌rpoB基因序列设计探针并制作DNA芯片，用TAMRA标记的引物扩增结核分枝杆菌rpoB基因突变热点的片断，与DNA芯片杂交，同时以PCR-SSCP和DNA测序法为对照。结果240株结核分枝杆菌临床分离株中，55株全敏感株和66株耐其他药物的利福平敏感株的PCK—SSCP和DNA芯片杂交结果与结核分枝杆菌标准株完全相同；119株耐RFP临床分离株中DNA芯片杂交有117株检测到rpoB基因突变，其中111株单位点突变，78株为531住密码子TCG→TTG（Ser→Leu）、TCG→TGG（Ser→Trp）和TCG→TAC（Ser→Tyr）突变；24株为526位蓉码子CAC→TAC（His→Tyr）、CAC→GAC（His→Asp）、CAC→CCC（His→Pr0）、CAC→CTC（His→Leu）和CAC→CGC（His→A职）突变；4株为516住客码子GAC→GTC（Asp→Val）和GAC→GGC（Asp→Gly）突变；3株为533位密码子CTG→CCG（Leu→Pro）突变；1株为511位密码子CTG→CCG（Leu→Pro）突变；1株为513位密码子CAA→AAA（Gln→Lys）突变；6株为双位点突变，其中3株511和516位联合突变，2株533和515住联合突变，1株517位密码子CAG→CAC（Gln→His）和518位密码子AAC→GAC（Asn→Asp）联合突变。DNA测序结果与DNA芯片杂交结果完全一致。1株516位GAC—TAC（Asp→Tyr）突变的分离株及1株516位GAC—TAC（Ssp→Tyr）和518住AAC—CAC（Asn→His）联合突变的分离株DNA芯片检测阴性，是因为芯片上无相应的探针。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpoB基因突变。可用于临床耐药性的检测，指导临床用药。     

PCR结合反向斑点杂交在侵袭性肺曲霉病早期诊断中的价值

目的评价和比较血清半乳甘露聚糖(GM)浓度测定和PCR结合反向斑点杂交实验在侵袭性肺曲霉病(IPA)早期诊断中的临床价值。方法用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中GM的浓度;PCR结合反向斑点杂交法检测各组小鼠血清、肺泡灌洗液、肺组织中的曲霉菌DNA。结果 ELISA法测定GM浓度中,实验组血清、BALF的GM实验敏感性、特异性与对照组间差异有统计学意义(P0.05);反向斑点杂交检测血清、肺泡灌洗液、肺组织中曲霉菌DNA含量,实验组阳性率明显高于对照组(P0.05)。用血清标本的反向斑点杂交实验与GM实验、组织病理阳性率进行比较,组织病理的阳性率最高,其次是反向斑点杂交。三种方法的差别均有统计学意义(P0.05)。结论 GM-ELI-SA检测是一项较灵敏、快速的诊断方法,反向斑点杂交实验在IPA早期诊断上的作用优于GM实验。     

DNA微阵列芯片法检测结核分枝杆菌耐异烟肼基因的研究

目的采用DNA微阵列芯片法检测结核分枝杆菌INH耐药基因,为临床诊治提供实验依据。方法应用DNA微阵列芯片法和改良罗氏培养加比例法药敏试验对疑似结核病患者的150份痰液标本进行检测,并对检测的结果进行比较分析。结果 150份痰液标本的涂阳率为60.0%(90/150),DNA微阵列芯片法检测到结核分枝杆菌阳性率为62.7%(94/150),改良罗氏培养法阳性率为60.0%(90/150),比例法药敏试验异烟肼的耐药率为43.9%(36/82),异烟肼的kat G/inh A基因总突变率为35.1%(33/94);以改良罗氏培养加比例法药敏试验为标准,DNA微阵列芯片法检测结核分枝杆菌阳性、异烟肼耐药性和敏感性的符合率分别为97.7%、86.1%和100.0%。结论 DNA微阵列法可快速准确地检测大部分疑似结核病临床标本的kat G和inh A基因突变,可用于临床耐药性的检测从而指导临床用药,也可用于临床诊断中的推广。     

反向点杂交法检测广东地区丙型肝炎病毒基因型和基因亚型

目的 建立并应用HCV基因分型技术PCR-反向点杂交法(PCR-RDH),调查广东地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型和亚型的分布情况.方法 应用生物信息学软件针对HCV 5'端非编码区(5'UTR)和核心蛋白区(C区)设计特异性捕获探针及生物素标记引物,建立HCV基因分型的PCR-反向点杂交技术.应用本技术对115例慢性丙型肝炎患者血清标本进行HCV基因型和亚型检测,同时对其中38份标本中的HCV进行RT-PCR扩增、测序、系统进化树分析确定HCV基因型和亚型,以评价反向点杂交法的准确性及临床应用价值.结果 115份血清标本中,反向点杂交法HCV基因型及亚型检出率为96.5%(111/115),15份阴性对照全部为阴性.111例检出基因型的标本中1b型63例(56.8%)、2a型9例(8.1%)、3a型4例(3.6%)、3b型6例(5.4%)、6a型28例(25.2%)、1b/2a混合型1例(0.9%).经测序分型确定此法检测准确度为100%,特异度为100%.结论 HCV基因型反向点杂交法检测准确可靠、简便经济、高效,适用于临床检测.广东地区的HCV基因型分布以1b型为主,呈现出1b型比例下降,3a、6a型比例升高的趋势.