大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞的原代培养及鉴定

目的探讨Wistar大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞体外培养的方法及其生物学特性.方法采用组织块培养法进行培养并行免疫组化鉴定,观察其形态及测定细胞活性.结果大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞为梭形,呈长轴平行排列,体外贴壁快,在合适的条件下能够生存并保持其稳定的生物学特性.结论大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞原培养方便可行,对研究阴茎勃起及ED机制有较大帮助.     

自发性高血压大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞培养及鉴定

目的:探讨自发性高血压大鼠(SHR)阴茎海绵体平滑肌(CCSM)细胞体外培养的方法、生物学性状及与WKY大鼠CCSM细胞培养的区别.方法:采用组织块培养法并应用差速贴壁法进行纯化,倒置相差显微镜观察其形态,免疫荧光与流式细胞仪法进行鉴定.结果:镜下可见平滑肌细胞呈梭形生长、平行排列及部分区域峰-谷现象,免疫荧光显示胞浆α-肌动蛋白染色呈阳性.WKY大鼠CCSM细胞第4d开始从组织块边缘游离出,SHR大鼠CCSM细胞第8d开始游离出.WKY与SHR大鼠CCSM细胞经纯化一次后纯度(％):WKY=97.00±1.03,SHR=84.90±5.99,差异具有统计学意义(P＜0.01);WKY与SHR大鼠CCSM细胞经两次纯化后纯度(％):WKY=98.24±1.05,SHR=96.92±1.06,其差异无统计学意义(P＞0.05).结论:SHR与WKY大鼠CCSM细胞的原代培养在生长时间及纯化上存在显著差异,但可通过适当方式缩小其差异并在短期内获得大量高纯度SHR大鼠CCSM细胞,为高血压性勃起功能障碍的研究奠定基础.     

粉防己碱对阴茎海绵体平滑肌细胞抗氧化能力的影响

【目的】 研究粉防己碱 (Tet) 对过氧化氢 (H2O2) 致新西兰白兔阴茎海绵体平滑肌细胞损伤的保护作用。【方法】体外培养新西兰白兔阴茎海绵体平滑肌细胞,随机分为3组:对照组、H2O2组和Tet + H2O2组。①四甲基偶氮唑盐还原实验观察Tet对H2O2诱导损伤的阴茎海绵体平滑肌细胞的存活率;②化学比色法观察Tet对H2O2诱导损伤的阴茎海绵体平滑肌细胞的乳酸脱氢酶 (LDH) 的释放、超氧化物歧化酶 (SOD) 活性和丙二醛 (MDA) 含量的影响。【结果】 H2O2诱导阴茎海绵体平滑肌细胞4 h,①细胞存活率由100%降至 (48.57 ± 4.1)% (n = 8; P < 0.01); ②LDH释放由对照组的(487.3 ± 78.6) U/L 增加到(1105.5 ± 65.8) U/L (n = 8; P < 0.01);③MDA含量由对照组的(3.8 ± 1.4) nmol &#8226; L-1 &#8226; mg-1增加到(77.3 ± 8.6) nmol &#8226; L-1 &#8226; mg-1(n = 8; P < 0.01);④SOD活性由对照组的(51.8 ± 5.9) U/mL降为(30.7 ± 4.5)/mL (n = 8; P < 0.01)。粉防己碱可浓度依赖性地提高细胞存活率;降低LDH释放和MDA含量,提高 SOD活性?。【结论】 粉防己碱对H2O2致阴茎海绵体平滑肌细胞损伤具有保护作用,其作用机制可能与增强细胞抗氧化能力,减少脂质过氧化物导致的细胞膜损伤有关。     

血小板源性生长因子-BB对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞增殖、迁移及表型转化的影响

目的了解血小板源性生长因子-BB（PDGFBBB）对大鼠阴茎海绵体平滑肌（CCSM）细胞增殖、迁移及表型转化的影响并
初步探讨其作用机制。方法采用改良的组织块培养法培养Wistar大鼠CCSM细胞,并用细胞免疫荧光法鉴定。利用CCK-8法
检测不同浓度的PDGFBB对培养的大鼠CCSM细胞增殖的影响,并筛选出最适PDGFBB作用浓度。分别用0 ng/mL PDGFBB
与最适浓度PDGFBB处理CCSM细胞,利用划痕实验检测PDGFBB对CCSM细胞迁移的影响,24 h和48 h时利用qRT-PCR检
测细胞中转录因子myocardin及收缩型表型标志物α-SMA、SMMHC mRNA表达水平;用最适浓度PDGFBB处理CCSM 细胞
0、24 和48 h 后,利用western blotting 检测细胞中myocardin 的蛋白表达水平。结果原代培养的CCSM 细胞中α-SMA 和
smoothelin 阳性率分别约为96.5%和96%;不同浓度的PDGFBB均能明显促进CCSM细胞增殖,其最适浓度为12.5 ng/mL。
PDGFBB（12.5 ng/mL）能促进CCSM细胞迁移,下调CCSM细胞中myocardin、α-SMA和SMMHC mRNA表达水平（P均<0.01）;
在48 h内myocardin蛋白质的表达水平随着PDGFBB作用时间增加而降低。结论改良的组织块培养法可获得高纯的CCSM
细胞;PDGFBB可促进CCSM细胞增殖、迁移,使细胞从收缩型向合成型转化,其机制可能是通过下调myocardin。
     

缺氧对SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化的影响

[目的]研究缺氧对阴茎海绵体平滑肌细胞(cavernosum smooth muscle cel s ,CCSM）表型转化的影响。[方法]用酶消化法获取SD大鼠的原代CCSM,并用细胞免疫荧光法进行鉴定。将原代CCSM置于缺氧小室中（37℃,5%CO2,1%O2,94%N2）培养,按缺氧时间分为0h组、24h组、48h组、72h组,用western-blot法检测四组的α-SMA、OPN蛋白表达量。[结果]低氧可以诱导CCSMα-SMA蛋白表达下降,且在72h内随着缺氧时间延长差异显著性增加。低氧24h组细胞OPN蛋白表达增加（P<0.05）;低氧48h组细胞OPN蛋白表达显著增加（P<0.01）;48h后随着时间延长差异可能会减小（P>0.05）。[结论]缺氧可以诱导CCSM由收缩型向合成型转化。     

外源性硫化氢通过抑制阴茎海绵体平滑肌细胞凋亡改善海绵体神经损伤大鼠勃起功能障碍

目的 观察外源性硫化氢对双侧海绵体神经损伤（BCNI）大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞（CCSMC）凋亡及勃起功能障碍的影响。方法 将24只SD雄性大鼠随机分为3组（n=8只/组）：假手术组、双侧海绵体神经损伤组（BCNI组）、硫化氢干预组（BCNI+NaHS组）。通过钳夹损伤双侧海绵体神经构建BCNI模型。BCNI+NaHS组每天腹腔注射100 μmol/kg的NaHS溶液;BCNI组每日腹腔注射等量生理盐水。治疗4周后检测海绵体内压（ICP）和平均动脉压（MAP）,并通过Western blot检测胱硫醚-β-合成酶（CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）,α-SMA,Collagen-Ⅰ,Caspase-3、Bax、Bcl-2表达水平,通过免疫组化检测CBS、CSE表达情况,Masson’s Trichrome染色检测海绵体平滑肌/胶原比值,以及 TUNEL+α-SMA组织免疫荧光双染检测CCSMC凋亡水平。结果 治疗4周后,BCNI+NaHS组ICP/MAP比值高于BCNI组（P<0.05）;Masson’s Trichrome染色结果显示,BCNI+NaHS组海绵体平滑肌/胶原比值较 BCNI 组显著升高（P<0.05）;Western blot 结果显示 BCNI+NaHS 组α-SMA 蛋白表达高于 BCNI 组（P<0.05）,同时 Collagen-Ⅰ蛋白表达低于 BCNI组（P<0.05）;TUNEL+α-SMA组织免疫荧光双染结果显示,BCNI+NaHS组CCSMC凋亡数较BCNI组降低（P<0.05）。与BCNI组相比,BCNI+NaHS组Caspase-3、Bax蛋白表达降低（P<0.05）,Bcl-2蛋白表达、Bcl-2/Bax比值升高（P<0.05）。BCNI组CBS、CSE表达较其余两组显著降低（P<0.05）。结论 外源性硫化氢可提高经典的抗凋亡蛋白Bcl-2及抑制CCSMC凋亡,进而改善BCNI大鼠勃起功能。     

高血压大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞表型转化

目的 探讨高血压大鼠阴茎海绵体平滑肌是否存在表型转化及对勃起功能的影响.方法 16周龄雄性自发性高血压大鼠(SHR)及其同系正常血压大鼠(WKY),测量尾动脉收缩压,颈部皮下注射阿朴吗啡后检测阴茎勃起功能,然后将大鼠分为高血压勃起功能障碍组(HBP&ED)、高血压组(HBP)和正常对照组(Control).免疫组化染色和彩色图文分析系统分析各组大鼠阴茎海绵体中平滑肌细胞碱性调宁蛋白(calponin 1)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达,实时荧光定量RT-PCR分析各组大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞calponin 1 mRNA和OPN mRNA的相对表达量.结果 在大鼠阴茎海绵体中calponin 1和calponin 1 mRNA表达情况:HBP&ED组低于HBP组(P=0.021,P=0.006)和control组(P=0.000,P=0.001),HBP组低于control组(P=0.000,P=0.015);OPN和OPN mRNA表达情况:HBP&ED组高于HBP组(P=0.000,P=0.000)及control组(P=0.000,P=0.000),HBP组高于control组(PP=0.013,p=0.000).结论 高血压大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞存在表型由收缩型向合成型转化,这种转化达到一定程度最终可能导致大鼠勃起功能障碍.     

阴茎包埋对大鼠阴茎海绵体缝隙连接蛋白43表达的影响

目的:探讨阴茎包埋对阴茎海绵体组织缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响。方法:通过建立隐匿阴茎大鼠模型获得实验标本,分2月组、4月组,每组25只大鼠,各阶段又分包埋组(15只),正常组(10只),光镜下观察海绵体形态结构的改变,免疫组化法观察海绵体平滑肌细胞Cx43的表达。结果:2月包埋组与2月正常组相比Cx43的表达无明显变化(吸光度值0.30±0.04比0.34±0.11,P>0.05),包埋4月组光镜下见大鼠阴茎海绵体大量间质组织增生,海绵窦狭窄,免疫组化观察包埋4月组大鼠阴茎海绵体平滑肌Cx43表达较正常组明显降低(正常4月组吸光度值0.38±0.06;包埋4月组0.18±0.03,P<0.05)。结论:随着包埋时间的延长,阴茎包埋导致海绵体形态结构上的病理改变、Cx43表达减少,可能引起阴茎勃起功能障碍。     

改良组织块法培养SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞

目的应用改良植块法体外培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞。方法15只SD雄性大鼠,随机分成3组,每组5只,分别采用组织块法、酶消化法及改良组织块法分离大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,在含双抗及20%胎牛血清DMEM,37℃、5%CO2、95%空气的细胞培养箱静置中培养,相差显微镜观察细胞形态及扩增情况,用α-平滑肌肌动蛋白(a-SM-Actin)及结蛋白(desmin)免疫组织化学染色,鉴定细胞类型。结果α-平滑肌肌动蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为96.3%,在成纤维细胞中阳性率为23.8%,结蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为74.4%,在成纤维细胞中呈阴性。三组间结蛋白阳性细胞率具有显著差异,改良组织块法组结蛋白阳性细胞率高于组织块法和酶消化法组。结论结蛋白是鉴定海绵体平滑肌细胞的特异性指标,改良组织块法可获纯度更高、结构和功能良好的阴茎海绵体平滑肌细胞。     

糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞α-肌动蛋白的表达及意义

目的了解糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞Ot一肌动蛋白（actin）的表达及意义。方法利用链脲佐菌素（STZ）制作糖尿病及糖尿病性勃起功能障碍模型,40只SPF级SD雄性大鼠,先按时间随机分为两组（每组20只）,分别是注射STZ后7周组和4周组,再按处理因素即给予大鼠腹腔注射STZ（60mg／kg）是否成模,分为对照组（未注射STZ,5只）、成糖尿病性勃起功能障碍模型组、成糖尿病性非勃起功能障碍组、未成模组。利用免疫组化SP染色法对不同处理组的标本进行α-肌动蛋白的研究,利用免疫组化SABC染色法对不同处理组的标本进行肌间线蛋白的研究,利用原位杂交技术检测不同组别骨桥蛋白（OPN）mRNA含量的改变。图像分析利用彩色图文分析系统,第三人进行图像分析及数据采集,测量随机每高倍镜视野下累积光密度（IOD）,以IOD的值反映组织切片中相应阳性物质的表达程度。结果糖尿病性勃起功能障碍组IOD均小于对照组、糖尿病非勃起功能障碍组及未成模组（均P〈0．05）,糖尿病非勃起功能障碍组的IOD小于对照组和未成模组（P〈0．05）,不同时间点间的IOD不存在显著性差异（F＝3．801,P＝0．62）,交互效应不显著（F＝1．549,P=0．225）。免疫组化染色不同时间点间的IOD不存在显著性差异（F=0．052,P=0．821）,各处理组间的IOD不存在显著性差异（F=0．045,P=0．987）,交互效应不显著（F=0．572,P=0．639）。OPN mRNA原位杂交染色不同时间点间的IOD不存在显著性差异（F=1．288,P=0．266）,交互效应不显著（F=1．819,P=0．168）,糖尿病性勃起功能障碍组的IOD均大于其余三组（P均〈0．001）。糖尿病非勃起功能障碍组的IOD大于对照组和未成模组（P均〈0．001）。对照组的IOD与未成模组未见显著差异（P=0．873）。结论糖尿病可以引起阴茎海绵体平滑肌的表型转化;阴茎海绵体平滑肌表型转化可以导致勃起功能障碍。     

caveolae对血管平滑肌细胞增殖的影响及可能机制

目的 观察caveolae对血管平滑肌细胞增殖的影响及可能机制.方法 取培养第3代VSMCs培养皿中培养.干扰组细胞加甲基-β-环糊精(methyl-β-cyclodextrin,MβCD)(5mmol/L,DMEM配置)作用2h;对照组加入与MβCD等量的DMEM作用2h后以DMEM冲洗3次后正常培养48 h.采集细胞进行RT-PCR检测Caveolin-1、pSmad2 mRNA表达变化,Western blot法检测Caveolin-1、pSmad2蛋白表达变化,免疫组化检测Caveolin-1、TGF-β受体1(TGF-βR1)在细胞中的表达分布,CCK-8法检测细胞增殖能力.结果 Caveolin-1在MβCD干扰后,基因和蛋白表达水平明显下降(P＜0.01),并且以细胞膜和细胞质高表达为主;而Smad2在MβCD干扰后,基因和蛋白表达水平明显上升,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.01);并且TβR-1在MβCD干扰后细胞内表达增加.CCK-8检测结果显示,MβCD干扰后,VSMCs增殖被显著抑制(P＜0.01).结论 破坏caveolae结构后可以抑制VSMCs的增殖,其可能的机制是caveolae被破坏后,TGF-β/Smad信号通路增强,不能抑制Smad2磷酸化和下游的信号转导,从而达到抑制VSMCs的增殖的作用.     

自噬对血管平滑肌细胞增殖的影响

血管平滑肌细胞异常增殖是血管增殖性疾病的病理基础,自噬是真核生物维持细胞内环境稳态的一种自我保护机制。近年来的研究发现,自噬参与多种细胞因子、血管活性物质、剪切应力、ncRNA等诱导的血管平滑肌细胞增殖,一些抗血管增生性疾病的药物往往通过调节自噬通量和自噬活性发挥抗血管平滑肌细胞增殖作用。本文综述了自噬对血管平滑肌细胞增殖的影响,为探索血管增生性疾病的病理生理机制提供新的思路。     

胰岛素对大鼠血管平滑肌细胞表型转化的影响

目的:探讨胰岛素对体外培养的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)表型转化的影响.方法:用酶消化法分离大鼠VSMC,采用免疫组织化学法检测胰岛素作用后VSMC肌动蛋白(α-SM actin),RT-PCR 检测胰岛素作用后VSMC中bFGF、TGF-β、PDGF、matrix Gla和OPN各目的基因mRNA相对表达水平.结果:胰岛素组VSMC的3H-TdR掺入值比对照组升高47％(P<0.01), VSMC α- SM actin免疫组化结果显示对照组的α-SM actin比胰岛素组染色深.而matrix Gla和OPN在培养的VSMC中mRNA的表达量,胰岛素组明显高于对照组(P<0.05),同时bFGF、TGF-β、PDGF的表达胰岛素组也明显高于对照组(P<0.05).并可明显见到细胞骨架F-actin、G-actin重新分布.结论:在合成表型的matrix Gla和OPN表达量明显高于收缩表型,而合成表型的α- SM actin表达量明显低于收缩表型.提示胰岛素对VSMC的表型转化起了一定作用.胰岛素在促进了VSMC增殖的同时,伴有VSMC由收缩型转变为合成型及细胞骨架F-actin、G-actin重新分布.     

Effect of Amlodipine on the Growth of Vascular SmoothMuscle Cells of Spontaneously Hypertensive Rats

Abnormalvascularsmoothmusclecell(VSMC)proliferationisanimportantpathologicalcharacteristicofhypertension.IthasbeenapopularsubjectthathowtoinhibitVSMCproliferationintheresearchofhypertensioncontrol.Nowwhetheraantihypertensivedrugcanpreventandregresshypertrophyofyascularwallandleftventriclehasbeenbelievedtobeoneofimportantcriteriaintheevaluationofananti-hypertensivedrug.Amlodipineisoneofcalciumantagonistofdihydropyriodines.ItreducesbloodpressurebyblockingcalciumchannelsonVSMCmembrane.Butno…     

urantide对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的:探讨在尾加压素Ⅱ(UⅡ)受体拮抗剂urantide干预下,UⅡ在大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)中的表达,阐明其可能的作用机制.方法:采用贴块法对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞进行体外培养,实验分为正常对照组(C组)、UⅡ组(M组)、阳性药对照组(Flu组)及urantide干预组(浓度分别为1×10-10、1×10-...     

壳多糖对兔主动脉平滑肌细胞和内皮细胞增殖的影响

目的：研究壳多糖对体外培养的兔主动脉平滑肌细胞和内皮细胞生长的影响。方法：将不同质量浓度（０．２,２,２０,２００,２０００μｇ／ｍｌ）的壳多糖溶液分别加入兔主动脉平滑肌细胞和内皮细胞培养液中,培养１２,２４,４８ｈ后用ＭＴＴ经色法测定细胞数。结果：平滑肌细胞数随着壳多糖质量浓度和作用时间的增加而减少;内皮细胞数随着其质量浓度和作用时间的增加,在一定范围内相应增加。结论：壳多糖能抑制兔主动脉平滑肌     

硫化氢联合阿托伐他汀钙对血管平滑肌细胞凋亡的影响

目的 观察硫化氢联合阿托伐他汀钙对血管平滑肌细胞凋亡的影响.方法 培养兔血管平滑肌细胞（VSMCs）3～8代,分为对照组、硫化氢组、阿托伐他汀钙组以及硫化氢联合阿托伐他汀钙组（简称联合干预组）,共4组,分别给予相应干预,TUNEL法检测VSMCs的凋亡情况.结果 VSMCs凋亡率：与对照组相比,硫化氢组、阿托伐他汀钙组以及联合干预组VSMCs的凋亡率均增加（P＜0.01）;与硫化氢组相比,联合干预组VSMCs凋亡率增加（P＜0.01）,阿托伐他汀钙组VSMCs凋亡率减少（P＜0.01）.结论 硫化氢、阿托伐他汀钙以及两者联合均可促进VSMCs的凋亡,其中以两者联合效果最为明显,硫化氢的作用强于阿托伐他汀钙.     

穹窿主体蛋白对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的:探讨穹窿主体蛋白(major vault protein,MVP)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖的影响?方法:分离培养野生型小鼠VSMCs,用血小板源性生长因子(PDGF-BB)或15% 胎牛血清(FBS)刺激VSMCs增殖,Western blot检测VSMCs的MVP表达水平,同时检测特异性分化标记物α-SMA和SM22α表达水平?然后用PDGF-BB刺激人主动脉平滑肌细胞(HAoSMCs),检测MVP的表达差异?再分别分离培养野生型小鼠和MVP敲除型小鼠的VSMCs,通过CCK8细胞增殖实验检测两者的增殖能力;同时用siRNA干扰的方法,使HAoSMCs中MVP低表达,检测其增殖能力的变化?结果:用PDGF-BB或15% FBS刺激VSMCs后,MVP表达水平呈浓度和时间依赖性下降,α-SMA和SM22α表达水平也相应降低?MVP缺失或低表达情况下,VSMCs的增殖能力均下降?结论:MVP在VSMCs增殖中起了重要作用?     

Inhibitory effect of iron on in vitro proliferation of smooth muscle cells

Background Iron is a biocorrodible metal that might be used in bioabsorbable stents.This study investigated the effects at the cellular and protein levels of soluble divalent iron （ferrous gluconate） and soluble trivalent iron （ferric chloride） on the proliferation of human aortic smooth muscle cell （HASMC） in vitro.Methods The water-soluble tetrazolium （WST-1） test was used to evaluate the effect of iron on proliferation of HASMC and Western blotting was used to measure the levels of signaling proteins involved in proliferative and apoptosis pathways.Results HASMC proliferation was inhibited in a concentration dependent manner after treatment with soluble divalent and trivalent iron at concentrations of 100-500 μmol/L.Western blotting analysis showed that the proliferating cell nuclear antigen （PCNA） expression following treatment with soluble divalent iron and trivalent iron at 100,300 and 500 μmol/L was reduced compared to the control.The PCNA expression decreased with increasing iron concentration and to a greater extent with the trivalent iron than with the divalent iron treatment group.The p53 expression was markedly increased in a concentration dependent manner in both iron treatment groups.Conclusion The soluble divalent iron and,to a greater degree trivalent iron,inhibited HASMC proliferation in a dosedependent manner,which may be attributed to reduction of PCNA expression and increase of p53 expression.     

胃促生长素对人主动脉平滑肌细胞增殖及线粒体融合蛋白2表达的影响

目的 通过体外培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs),研究胃促生长素(ghrelin)对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及线粒体融合蛋白2(Mfn-2)表达的影响.方法 体外培养HASMCs,第4～6代细胞用于试验.给予不同浓度(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L)的ghrelin 或10-6 mol/L ghrelin不同时间(0、6、12、18、24 h)处理,用四甲基偶氮唑蓝比色(MMT)法观察其对HASMC增殖的影响.RT-PCR,Western blot方法检测不同处理方法对Mfn-2表达的影响.结果 10-7～10-5 mol/L的ghrelin可明显抑制HASMC增殖,浓度为10-6 mol/L抑制作用最为明显(P<0.01).ghrelin在6～24 h内均能明显抑制HASMC增殖,在24 h达最高峰(P<0.01).10-6 mol/L ghrelin能明显上调Mfn-2 mRNA和蛋白的表达(P<0.01).10-6 mol/L ghrelin在18 h上调Mfn-2 mRNA和蛋白表达的作用最为明显(P<0.01).结论 ghrelin可能通过上调Mfn-2的表达来抑制HASMC增殖.