石蜡包埋组织逆转录PCR技术在病毒感染性疾病中的应用

逆转录PCR(RT-PCR)的高度敏感性为包括陈旧的临床材料在内的固定石蜡组织(PET)标本的分子研究提供了条件.用于RT-PCR的PET组织的制备理论上非常简单,首先溶解组织切片中石蜡,然后处理干组织释放DNA或RNA,在感染性病原分析时一般不做核酸纯化以减少样品污染的风险.对PET标本作RT-PCR为基础的研究成功与否取决于固定剂、固定时间、蜡块保存时间、扩增的片段长度等诸多因素[1].目前,在临床上,由于一次大量收集标本困难、低温保存难于实现等条件的限制,PET组织常常成为可用于以RT-PCR为基础的各种医学研究唯一的标本来源.许多学者在病毒感染性疾病中以石蜡包埋组织为来源进行以RT-PCR为基础的研究,以进一步明确致病因子、传染性疾病的发病机制和传播机制.本文对利用石蜡包埋组织进行进行RT-PCR技术在病毒感染性疾病的运用情况作一综述.     

简易提取石蜡包埋组织DNA

DNA的提取是 PCR成功与否的关键 ,而 DNA提取最好是用新鲜标本 ,但对回顾性研究只能从石蜡包埋组织中提取。传统的石蜡包埋组织 DNA提取是用二甲苯脱蜡 ,酚 -氯仿反复多次的抽提 ,这样使得 DNA不断破坏 ,大量丢失 ,操作非常繁琐 ,费时费试剂 ,不适宜处理大量标本 ,且试剂对人体有毒害作用 ,而得到的 PCR反应的结果阳性率低 ,污染严重。为此 ,本室将传统的石蜡包埋组织 DNA提取法进行改良 ,介绍如下。1　材料与方法1.1　材料　本室 1996～ 2 0 0 0年存档的手术切除的甲状腺癌标本 41例。水浴恒温振摇器 (SHA- C型 ,深圳天南海北实…     

碎小组织石蜡包埋的改进

在制作组织切片中,技术人员对于碎小组织的包埋普遍感到棘手,原因之一是多个碎小组织往往不能包埋在同一平面;其二是在包埋过程中组织容易丢失,且在染色过程中碎小组织容易脱落,从而导致病理诊断的不全面或误诊,继而延长诊断时间,延误病人的治疗。笔经过半年的临床实践,取得     

高通量测序分析miRNAs在胃癌新鲜组织与石蜡包埋组织中的表达

目的 利用二代测序技术对FFPE标本进行高通量测序及相关的生物信息学分析,探讨miRNAs在来源于石蜡包埋胃癌组织(FFPE)中的标本检测的可靠性,探讨其临床意义.方法 选取2015年和2016年2例胃癌患者手术切除同一组织的FFPE和新鲜冰冻标本,从标本中提取RNA并分离构建small RNA文库,采用Illumina测序平台测序的方法对其进行高通量测序,统计各已知miRNAs家族序列的表达量,构建已知miRNAs表达谱,对标本miRNAs进行Spearman相关性分析,评估miR-NAs表达量的差异变化情况.结果 新鲜冰冻标本中提取的总RNA质量较高,RNA保存度完整,显示28S是18S的1.3～1.4倍,从石蜡组中提取的RNA,结果显示有不同程度的降解,28S和18S的波峰不明显,miRNAs表达谱在冰冻和FFPE标本中,Spearman相关系数分别为0.90争0.86,两者miRNAs表达量较一致,具有相关性.结论 FFPE中的miRNAs仍然保持一定的完整性,且可通过二代测序进行肿瘤标本检测.     

多重聚合酶链反应分析石蜡包埋组织多肿瘤抵制基因探讨

目的：建立一种敏感、特异和快速检测石蜡包埋组织中多肿瘤抑制基因（ＭＴＳ１）的方法。方法：利用改良的ＤＮＡ制备方法,成功的从甲醛固定、石蜡包埋组织中提取ＤＮＡ,同时用建立的多重聚合酶合链反应（ＰＣＲ）进行检测。结果：３０例石蜡包埋的正常组织与新鲜组织提取的ＤＮＡ经ＰＣＲ扩增后,电泳图谱都出现５３６ｂｐ和３１０ｂｐ,即结果相同。结论：轵要提取、纯化得当,石蜡包埋组织在分子生物学研究领域中将有重要应用价     

关于甲醛固定石蜡包埋组织提取DNA质量的探讨

目的:探讨甲醛固定石蜡包埋组织(FFPET)提取DNA后PCR扩增产物检测率的提高。方法:应用从FFPET提取的DNA,PCR反应扩增β-Globin(110bp),分析纯化前后DNAPCR产物的检测率。结果:纯化后的DNA模板PCR反应取得高质量目的基因。结论:纯化后能有效去除不能通过蛋白酶K消化和有机萃取法去除的PCR反应抑制因子,利于PCR反应成功。     

宫颈组织塑料包埋与石蜡包埋免疫组化检测CKpan的效果比较

目的:通过对宫颈组织进行塑料及石蜡包埋,对比免疫组化的检测效果,探索一种理想的组织塑料包埋免疫组化检测方法。方法:将宫颈组织进行全层取材,分别进行石蜡及塑料包埋,而后利用免疫组化技术检测CKpan在组织中的表达。石蜡包埋的具体方法参考临床病理诊疗规范,塑料包埋的关键环节均是在低温环境下进行,最大限度的保存抗原及酶的活性。结果:宫颈组织的塑料包埋免疫组化检测CKpan,细胞核细微结构清晰,阳性定位准确。结论:塑料冷包埋技术的最大优势就在于维持细胞结构的完整性,能很好的保存抗原,有利于免疫组化及原位杂交等技术的进一步检测研究,适宜于疾病的诊断和预后评估。     

福尔马林固定石蜡包埋组织DNA提取方法对PCR的影响

目的：比较多种福尔马林固定石蜡包埋组织ＤＮＡ提取方法对ＰＣＲ的影响,探讨临床组织病理标本理想的ＤＮＡ提取方法及ＰＣＲ应用。方法：采用５种不同的ＤＮＡ提取方法应用ＰＣＲ技术进行了比较。结果：Ｔｗｅｅｎ－２０,ＮＰ－４０加蛋白酶Ｋ法和亚氨基二酸法处理标本时ＰＣＲ结果较为理想。结论：合适的福尔马林固定石蜡包埋ＤＮＡ提取方法可应用ＰＣＲ进行ＤＮＡ水平的相应的研究。     

石蜡包埋组织快速DNA提取方法在诊断病理PCR分析中的应用研究

目的 改良石蜡组织DNA快速提取方法的流程,评价其提取效率,探讨其应用于病理诊断PCR分析的可行性.方法 选取包括淋巴瘤及反应性病变的52例存档蜡块,以缓冲液煮沸方法快速提取DNA,并以传统酚-氯仿抽提法和试剂盒提取法作为对照,采用PCR反应扩增看家基因β-Globin以确定模板DNA质量,并通过测序确定结果的可靠性;同时根据临床病理诊断选择性的进行免疫球蛋白重链基因(IgH)或T细胞受体γ基因(TCRγ)重排检测.结果 快速法提取DNA的浓度虽低于对照方法,但β-Globin扩增效率与对照方法相比差异没有统计学意义(P＞0.05),对IgH和TCRγ重排的检出率与对照相比差异亦没有统计学意义(P均＞0.05).测序结果显示扩增片段与目的基因序列完全符合.DNA可在-20 ℃保存至少4周.结论 快速DNA提取法可以从存档的石蜡包埋组织中提供足量的PCR反应模板,结果稳定可靠,且省时省力,在病理诊断PCR分析中具有应用价值.     

福尔马林固定石蜡包埋组织DNA提取方法对PCR的影响

目的：比较多种福尔马林固定石蜡包埋组织ＤＮＡ提取方法对ＰＣＲ的影响,探讨临床组织病理标本理想的ＤＮＡ提取方法及ＰＣＲ应用。方法：采用５种不同的ＤＮＡ提取方法应用ＰＣＲ技术进行了比较。结果：Ｔｗｅｅｎ ２０,ＮＰ ４０加蛋白酶Ｋ法和亚氨基二乙酸法处理标本时ＰＣＲ结果较为理想。结论：合适的福尔马林固定石蜡包埋组织ＤＮＡ提取方法可应用ＰＣＲ进行ＤＮＡ水平的相应的研究。     

应用原位多聚酶链反应检测喉癌组织中p53基因

采用原位多聚酶链反应技术检测了５例喉癌石蜡组织切片中ｐ５３基因，结果在全部标本中９０％以上的癌细胞核检测到ｐ５３基因，平均拷贝数为２．２４±０．２３。表明该技术可用于单拷贝基因研究，并对其改进和应用进行讨论。     

聚合酶链反应在检测乙肝病毒感染中的应用

应用PCR技术对医院临床实验室检测的265例乙肝患者血清的ELISA五项结果所用血清作了复检、结果发现：ELISA五项指标全阴40例，单纯HBsAb阳性40例，单纯HBcAg阳性40例，HBsAg两项阳性40例，HBsAg、HBeAb和HBcAb三项阳性40例，HBsAg、HBeAg和HBcAb三面阳性40例，HBsAg和HBeAg均阳性15例及单纯HBsAg阳性10例，而PCR检测HBV－DNA的阳性例数分别为2，3，7，16，11，38，15和3例，ELISA法和PCR法检测的目的物本不同同，其临床意义，学者对ELISA法已有不少报道，PCR法检出HBV－DNA证明血清中有乙肝病毒存在，对PCR检测结果，结合ELISA检测结果作了讨论。     

PCR技术在B细胞淋巴瘤诊断中的应用

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术从ＤＮＡ水平测定Ｂ细胞非霍奇金淋巴瘤的单克隆起源，以用于淋巴瘤的诊断。４０例标本检测的阳性结果为；Ｂ细胞淋巴瘤１３／１５例，Ｔ细胞淋巴瘤０／３例，霍奇金病０／３例，慢性淋巴结炎０／８例，非淋巴源性肿瘤０／１１。与组织学及免疫组化诊断符合率为８７％。本研究在把分子生物学的新方法用于Ｂ细胞淋巴瘤的临床诊断方面作出初步的探索。关键词     

应用聚合酶链反应检测支气管肺泡灌洗液中的乙肝病毒

用聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测了４５例肺科病人的支气管肺泡灌洗液（ＢＡＬＦ）中乙肝病毒（ＨＢＶ），同时对其中２４例作血清ＨＢＶ检测，发现ＢＡＬＦ中ＨＢＶ阳性率为２６．６７％（１２／４５）、血清ＨＢＶ阳性率为４１．６７％（１０／２４）；血清ＨＢＶ阳性者其ＢＡＬＦ方有可能检出ＨＢＶ、血清ＨＢＶ阴性者其ＢＡＬＦ不能检出ＨＢＶ，ＢＡＬＦ中ＨＢＶ脱氧核糖核酸（ＨＢＶ－ＤＮＡ）可以复制、有传染性。     

PCR检测婴儿肝炎综合征中巨细胞病毒感染

采用PCR技术对37例肝炎综合征患者进行了检测。结果表明,24例为HCMV阳性,占被检人数的64.9%,与已报导的资料相比,PCR方法的阳性检出率明显高于目前使用的其它方法.此外,灵敏性和特异性试验表明,HCMV—PCR方法足以能检测出0.1pg的HCMV的DNA,无非特异性带出现,因此,PCR技术具有高度敏感、特异性强、简单快速等优点,可以用于临床检测和诊断。     

聚合酶链反应检测尖锐湿疣组织中HPV DNA

为分析尖锐湿疣组织中人乳头瘤病毒感染情况。     

逆转录聚合酶链式反应检测人血标本中肠道病毒核糖核酸

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分别对119例心肌炎患者,37例正常人血标本进行肠道病毒核糖核酸(RNA)检测,检出率分别为49.6％及5.4％。患者血清柯萨奇B组病毒中和试验阳性率为21.8％。表明RT-PCR是检测肠道病毒感染的一种敏感性高、特异性强、简便快速的方法,优于中和试验。     

DIFFERENTIATION OF PSEUDOCONDYLOMA OF VULVA AND CONDYLOMA ACUMINATA BY DOT BLOT HYBRIDIZATION AND POLYMERASE CHAIN REACTION

ＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮＯＦＰＳＥＵＤＯＣＯＮＤＹＬＯＭＡＯＦＶＵＬＶＡＡＮＤＣＯＮＤＹＬＯＭＡＡＣＵＭＩＮＡＴＡＢＹＤＯＴＢＬＯＴＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮＡＮＤＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥＣＨＡＩＮＲＥＡＣＴＩＯＮＬｉｕＹｕｅｈｕａ刘跃华；Ｗａｎｇ...     

聚合酶链反应检测膀胱癌组织中人乳头状瘤病毒DNA

目的：为研究简便，快速，特异，灵敏的检测膀胱癌组织中人乳头状瘤病毒，借以探讨膀胱癌的病因。方法：采用聚合酶链反应技术行人乳头状瘤病毒ＤＮＡ检测。结果：正常膀胱粘膜组织中未检出ＨＰＶ：２０例新鲜膀胱移行细胞癌组织中有８例阳性表达，总阳性率为４０％，按ＷＨＯ分级标准，膀胱移行上皮细胞癌Ｉ级检出率５０％，Ⅱ级４３％，Ⅲ级２０％。结论：正常膀胱粘膜到病变组织ＨＰＶ ＤＮＡ从无到有，说明ＨＰＶ感染与癌的发生     

用多聚酶链式反应检测献血员巨细胞病毒感染

采用多聚酶链式反应，检测了７６份血库献血员的巨细胞病毒感染情况。结果显示：３９份表现阳性，阳性率为５１．３％。同时还检测了其敏感性和特异性。结果表明，可检测到的巨细胞病毒ＤＮＡ最低限为５ｆｇμｌ－１。本方法简单，快速，特异性较好，灵敏度高，可适用于临床巨细胞病毒感染的检测。