UVB诱导人皮肤成纤维细胞中beta-catenin基因的变化研究

目的：观察中波紫外线（UVB）诱导人皮肤成纤维细胞中β-catenin及其下游基因c-myc的变化,探讨其在紫外线诱导光老化和肿瘤发生中的作用。方法：使用组织块法分离培养原代成纤维细胞,使用第2～8代人皮肤成纤维细胞进行紫外线处理,倒置荧光显微镜观察其形态学改变,β-gal半乳糖苷酶细胞衰老试剂盒染色衰老细胞、western blot检测衰老相关蛋白P16的表达,western blot检测紫外线处理人皮肤成纤维细胞各时相点β-catenin、c-myc蛋白表达水平,RT-PCR检测紫外线处理人皮肤成纤维细胞各时像点β-catenin、c-mycmRNA水平的表达变化。结果：40mJ/cm2UVB单次照射后可以诱导人皮肤成纤维细胞衰老,β-gal衰老染色阳性率达到约90%,衰老相关基因P16蛋白表达明显升高,β-catenin、c-myc蛋白表达水平和mRNA水平照射后较未照射组均明显降低。结论：紫外线UVB处理人皮肤成纤维细胞可以诱导其发生衰老改变,衰老细胞中β-catenin、c-myc表达水平明显降低,这些结果与皮肤黑色素细胞瘤相关基因改变的研究相近,为以后皮肤恶性肿瘤的研究提供了线索。     

TGF-β1对UVA照射皮肤成纤维细胞Ⅰ型，Ⅲ型胶原合成和表达的影响

目的：探讨转化生长因子-β1（tansforming gowth factor—beta 1,TGF—β1）对长波紫外线（ultraviolet A,UVA）照射皮肤成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原合成和表达的影响。方法：通过MTT法检测TGF-β1干预后成纤维细胞增殖活性,选择UVA照射剂量为15J／cm^2,联免疫法（ELISA）测定不同剂量即TGF—β1小剂量组（UVA＋TGF—β1 0．1ng／ml）、中剂量组（UVA＋TGF—β1 1ng／ml）、大剂量组（UVA＋TGF—β1 10ng／ml）处理后成纤维细胞清夜中Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量,半定量RT—PCR检测成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达。结果：UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞,导致成纤维细胞增殖活性下降,给予不同剂量TGF-β1干预后,成纤维细胞增殖活性与UVA照射组比较,明显提高;成纤维细胞上清液中Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量增加,成纤维细胞内Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达增强。结论：TGF-β1可提高UVA照射体外培养成纤维细胞增殖活性;增加UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量,增强成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达,对皮肤成纤维细胞起保护作用。     

植块法原代培养人衰老皮肤成纤维细胞

目的：探索和建立人表老皮肤成纤维细胞的体外培养的方法,为其在医学美容抗衰老研究中的应用提供科学依据。方法：植块法原代培养人衰老皮肤成纤维细胞;倒置显微镜下观察细胞的生长状态;HE染色观察细胞的形态及着色情况。结果：用植块法培养的人衰老皮肤成纤维细胞在显微镜下呈长梭形,有突起,平行、放射状或漩涡状排列。结论：确立了人衰老皮肤成纤维细胞的体外培养的方法,使其可供于延缓皮肤衰老的实验研究。     

高代次人皮肤成纤维细胞致肿瘤性的研究

目的 研究高代次人皮肤成纤维细胞的染色体变异性和致肿瘤性,为验证其作为组织工程肌腱种子细胞的安全性提供相应依据.方法 采用常规染色体G带处理方法分别对8个样本的第2、第10代人皮肤成纤维细胞进行核型分析,并通过裸鼠皮下致肿瘤实验对其致肿瘤性进行考察.结果 各样本、各代次的人皮肤成纤维细胞均未发现染色体核型异常改变,裸鼠皮下致肿瘤实验在观察期内均未见结节或可疑病灶产生,符合国家标准.结论 高代次(第10代以内)人皮肤成纤维细胞具有正常的染色体核型,且无致肿瘤性,作为组织工程肌腱种子细胞具有较高的安全性.     

釉基质蛋白对人皮肤成纤维细胞黏附、增殖及Ⅰ型胶原前mRNA合成影响的体外研究

目的 观察釉基质蛋白(enamel matrix proteins,EMPs)对体外培养的人正常皮肤成纤维细胞黏附、增殖及Ⅰ型胶原前mRNA合成的影响.方法 取自愿捐赠包皮环切术后包皮组织,采用组织块法培养人皮肤成纤维细胞,取第3～6代细胞进行实验.以终浓度为50、100、150、200 μg/mL的EMPs工作液预铺培养板.①细胞黏附实验:取细胞以1 × 106个/mL置于预铺EMPs的96孔培养板,每孔0.2 mL,作为实验组(A、B、C、D组).培养1.5、3.0和4.5 h后MTT比色法测定黏附细胞量.②细胞增殖实验:取细胞以5 × 104个/mL置于预铺EMPs的培养板,每孔0.2 mL,作为实验组(A1、B1、C1、D1组).于第2、4、6、8天以MTT比色法测定增殖细胞量.③细胞Ⅰ型胶原前mRNA合成实验:取细胞以1×106个/mL置于预铺EMPs培养板,每孔2 mL,作为实验组(A2、B2、C2、D2组).于培养第5天RT-PCR法测定Ⅰ型胶原前mRNA合成的量.以上实验均以相同浓度细胞悬液加入未预铺EMPs的板孔作为对照组,每组均3个复孔.结果 ①细胞黏附实验中,各时间点B、C、D组与A组及对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);A组与对照组间及B、C、D组间比较差异均无统计学意义(P＞005).②细胞增殖实验中,第2天各组间差异均无统计学意义(P＞0.05):第4、6天,B1、C1、D1组吸光度(A)值分别为0.598±0.020、0.582±0017、0.574±0.021及0.639±0.016、0.641±0.020、0.635±0.021,均高于对照组的0.548±0.021及0.605±0.019(P＜0.05);A1组A值分别为0.545±0.023及0.603±0.016,与对照组差异无统计学意义(P＞0.05).第8天,B1、C1组A值分别为0.629±0.012、0.631±0.014,高于对照组的0.606±0.031(P＜0.05),A1、D1组与对照组比较,差异无统计学意义(P＞005).③细胞Ⅰ型胶原前mRNA合成实验中,B2、C2、D2组Ⅰ型胶原前mRNA合成量高于对照组.结论 EMPs促进人正常皮肤成纤维细胞黏附、增殖及Ⅰ型胶原前mRNA合成,且EMPs在100μg/mL浓度时可发挥最大促进作用.     

体外培养的不同个体人肌腱细胞与皮肤成纤维细胞中胶原表达水平的比较研究

目的 对几种胶原在体外培养的不同个体的人第二代肌腱细胞和皮肤成纤维细胞中的表达水平进行比较研究,以探讨利用皮肤成纤维细胞作为组织工程肌腱构建种子细胞的可行性.方法 在无菌条件下取外伤病人术中修剪的废弃的肌腱和皮肤组织,经胶原酶和胰蛋白酶消化获取两种细胞,体外培养至第二代后,取两种细胞进行细胞学检测.采用基因芯片和RT-PCR技术对两种细胞几种胶原进行检测及比较.结果 体外培养的第二代人肌腱细胞和皮肤成纤维细胞两种细胞贴壁后形态相似.从基因水平可以看出体外培养的第二代人肌腱细胞和皮肤成纤维细胞在几种胶原的合成方面差异不大.结论 第二代人肌腱细胞与皮肤成纤维细胞的胶原表达基本相似,皮肤成纤维细胞有可能替代肌腱细胞,作为肌腱组织工程新的种子细胞来构建组织工程化肌腱.     

衰老真皮成纤维细胞胶原基因调控研究

目的针对衰老真皮成纤维细胞胶原基因表达减少的特点，应用胎儿皮肤源性活性蛋白（ＳＣＦ）进行调控，以增加胶原基因的表达。方法应用真皮成纤维细胞培养、胶原基因ｍＲＮＡ裂隙杂交和图像分析技术，观察胎儿皮肤源性活性蛋白对真皮胶原基因的调控作用。结果以Ａｃｔｉｎ作为对照，ＳＣＦ对老人成纤维细胞胶原基因有明显的调控作用，可以使Ⅰ、Ⅲ型胶原基因表达增加，处理后，Ｉ型胶原基因表达增加１５０％，Ⅲ型胶原基因增加５０％。结论ＳＣＦ可以促进衰老真皮成纤维细胞胶原基因的表达。     

皮肤伸展术对真皮成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达的影响

目的:观察皮肤伸展术对真皮组织中成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达的影响,从分子学水平解释皮肤伸展术后皮肤间质生物性生长的机理。方法:分别于皮肤牵张1周时及牵张后1、2、3、4、6、8周的皮肤和正常皮肤取1cm×1cm×0.5cm皮肤组织块,用Ⅰ、Ⅲ型前胶原cDNA探针原位杂交技术观察真皮组织中成纤维细胞内Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达。结果:皮肤伸展术后成纤维细胞的Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达较对照组明显增强,以2～4周时最强。Ⅰ型前胶原、mRNA表达高于Ⅲ型。对照组Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达在1、2周时高于正常皮肤,此后逐渐减弱。结论:伸展术能刺激真皮中成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达,并持续较长的时间。这是皮肤伸展术能够获得生物性增长的分子学基础。     

17β雌二醇对人皮肤成纤维细胞胶原和弹性蛋白合成的影响

目的探讨不同浓度17β雌二醇（17β-estrogen,17β-E2）在不同时间点对体外培养的人皮肤成纤维细胞（Human skin fibroblast,h SFB）合成胶原及弹性蛋白的影响。方法体外培养hSFB,分别加入不同浓度的17β-E2(10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11mol/L),继续培养24 h、48 h、72 h,在不同时间点分别提取相应的RNA,RT-PCR检测经17β-E2处理后的hSFB的Ⅰ、Ⅲ型前胶原及原弹性蛋白mRNA的表达情况。结果 RT-PCR结果显示,17β-E2处理组较空白对照组前胶原及原弹性蛋白表达水平在24 h没有变化,48 h时明显上调,72 h时呈现下降;在48 h时,17β-E2对前胶原与原弹性蛋白的影响,10^-10 mol/L组上调作用较其他浓度组明显;在48 h时,同一浓度17β-E2对前胶原蛋白的促进作用较原弹性蛋白明显,尤其是对Ⅲ型的促进作用更强。结论 17β-E2对胶原及弹性蛋白的合成有一定的促进作用,不同时间、不同浓度对其影响不同,在10^-10 mol/l、48 h时作用最强。     

光老化作用对体外人皮肤成纤维细胞的影响

目的 建立体外分离培养人皮肤成纤维细胞的光老化模型,观察研究中波紫外线对人皮肤成性纤维细胞的影响.方法 使用组织块法分离培养原代人皮肤成纤维细胞,并用免疫荧光特异性标记物鉴定证实,选择不同剂量的紫外线照射人皮肤成纤维细胞后,倒置显微镜观察细胞形态学的改变;β-半乳糖苷酶(β-gal)细胞衰老试剂盒染色;MTT检测不同剂量的紫外线照射对成纤维细胞增殖能力影响;western blot检测衰老标志物P16蛋白的表达.结果 组织块法成功分离获得人皮肤成纤维细胞,用20～60mJ/cm2 UVB单次照射后,可以成功诱导人皮肤成纤维细胞出现衰老形态学的改变,其增殖能力降至正常对照组的一半左右,β-gal染色阳性率约90%,衰老相关蛋白P16表达随时相明显升高.结论 20～60mJ/cm2中波紫外线照射人皮肤成纤维细胞可诱导人皮肤成纤维细胞衰老,为今后皮肤光老化的体外研究提供了参考.     

前列腺素E2（PGE2）对瘢痕成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因表达的影响

探索PGE2抑制搬痕成纤维细胞胶原合成的机理。方法 从新鲜的增生期瘢痕组织中培养成纤维细胞,采用Dot blot杂交法观测PGE2对瘢痕成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因表达的影响。结果 PGE2显著降低瘢痕成纤维细胞内Ⅰ、Ⅲ前胶原mRNA的含量。结论 PGE2在胶原转录水平抑制瘢痕成纤维细胞的胶原合成。     

苦参碱对人增生性瘢痕成纤维细胞合成胶原的影响

目的　研究苦参碱对人瘢痕成纤维细胞合成胶原的影响。方法　将苦参碱作用于体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞 ,分别测定其分泌胶原、Ⅲ型前胶原、细胞内胶原含量。结果　苦参碱可减少瘢痕成纤维细胞分泌胶原、细胞内胶原和Ⅲ型前胶原的含量。结论　苦参碱在体外能明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞胶原的合成     

苦参碱对人增生性瘢痕成纤维细胞合成胶原的影响

目的研究苦参碱对人瘢痕成纤维细胞合成胶原的影响.方法将苦参碱作用于体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞,分别测定其分泌胶原、Ⅲ型前胶原、细胞内胶原含量.结果苦参碱可减少瘢痕成纤维细胞分泌胶原、细胞内胶原和Ⅲ型前胶原的含量.结论苦参碱在体外能明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞胶原的合成.     

三维培养的人皮肤成纤维细胞的实验研究

目的探讨三维培养的人皮肤成纤维细胞的生物学特性,为其在皮肤组织工程中的应用提供进一步的实验依据。方法培养人皮肤成纤维细胞,制备鼠尾胶原;对人皮肤成纤维细胞进行三维培养,流式细胞仪检测细胞的增殖和凋亡,RTPCR检测TGFβ1、层粘连蛋白(fibronectin,Fn)mRNA的表达,电镜观察细胞的形态学特征。结果三维培养的人皮肤成纤维细胞增殖缓慢,未见明显细胞凋亡。RTPCR检测二维、三维培养的人皮肤成纤维细胞TGFβ1、FnmRNA的表达无明显差异。电镜观察细胞染色质多,细胞器丰富。结论三维培养的人皮肤成纤维细胞增殖缓慢,但生物学活性良好。     

苦参碱对人增生性瘢痕成纤维细胞合成胶原的影响

目的：研究苦参碱对人瘢痕成纤维细胞合成胶原的影响。方法：将苦参碱作用于体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞,分别测定其分泌胶原、Ⅲ型前胶原、细胞内胶原含量。结果：苦参碱可减少瘢痕成纤维细胞分泌胶原、细胞内胶原和Ⅲ型前胶原的含量。结论;苦参碱在体外能明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞胶原的合成。     

透明质酸对胚胎成纤维细胞胶原网架收缩的影响

目的　探讨羊水中抑制胚胎伤口收缩的成分是否为透明质酸 (HA)以及HA对胚胎伤口收缩是否有直接的抑制作用。方法　使用一种体外胚胎伤口收缩模型含成纤维细胞的胶原网架FPCL) ,观察HA浓度为 1μg/ml～ 10mg/ml时对FPCL收缩的影响。 结果　低浓度组 ( 1、5、2 0、5 0、10 0、10 0 0 μg/ml)的HA对FPCL的收缩指数 (CI)与对照组比较 ,差异无显著意义 (P >0 .0 5 ) ;高浓度组 ( 2、6、10mg/ml)的HA对FPCL的CI与对照组比较 ,差异有显著意义 (P <0 .0 5 )。结论　羊水中抑制胚胎伤口收缩的成分并非为HA ,可能胚胎伤口中高浓度的HA与羊水共同参与了胚胎伤口收缩的抑制作用。     

PRP促进光老化人皮肤成纤维细胞胶原与透明质酸合成的研究

目的体外研究人皮肤成纤维细胞（HSFs）发生光老化时,富血小板血浆（PRP）对其合成胶原与透明质酸的影响。方法使用紫外线（UVA）照射体外培养的原代人皮肤成纤维细胞,并检测光老化细胞的细胞增殖情况及细胞倍增时间。用含不同浓度PRP（10%、30%、50%）的培养液培养光老化细胞,正常培养的光老化细胞为阴性对照,原代人皮肤成纤维细胞为阳性对照。ELISA检测各组细胞外液中胶原蛋白与透明质酸含量。结果经紫外线照射后,细胞增殖减弱,加入PRP后,伴随PRP浓度的增加,细胞倍增时间缩短;ELISA检测发现,经过UVA照射的成纤维细胞COL1、COL3及透明质酸合成量,显著低于正常培养的成纤维细胞（P〈0.01）。在PRP作用后,成纤维细胞的COL1、COL3及透明质酸合成量均明显增加（P〈0.01）。结论PRP能显著促进光老化人皮肤成纤维细胞胶原与透明质酸合成,可应用于皮肤抗衰老的研究。     

不同复温温度对-10℃处理的体外培养人成纤维细胞形态和Ⅰ型胶原代谢的影响

目的探讨不同复温温度对低温处理人成纤维细胞形态和Ⅰ型胶原代谢的影响。方法将体外培养的人成纤维细胞制成悬液后接种于培养皿中,随机分为对照组、20℃复温组、37℃复温组。将两个复温组培养细胞渐冷冻至-10℃制成冻伤模型,然后各自于20、37℃下复温,再与对照组一起继续培养,于伤前及伤后即刻、24、48、72、96h进行观察,每组各时相点9个培养皿。采用噻唑蓝法观察细胞活力的变化,以波长570nm下的吸光度(A)值表示;倒置相差显微镜观察细胞形态变化;免疫组织化学染色法及IMAGE-J图像分析软件测定细胞内胶原含量变化,以灰度值表示;双抗夹心亲和素-生物素酶联免疫吸附测定法测定细胞外胶原含量,以A值表示。结果20℃复温组细胞活力伤后先降低后升高,各时相点明显低于伤前值(0.95±0.16,P<0.05或0.01);细胞伤后即刻脱水,胞浆丢失、核浆比例增大,伤后72、96h细胞增生活跃,核分裂相增多,部分细胞出现漂浮后再贴壁现象,细胞排列杂乱;细胞外胶原含量较伤前值(96.4±2.9)呈先升高后降低再缓慢升高的趋势,细胞内胶原含量则较伤前值(0.0479±0.0027)呈先降低后逐渐升高趋势,与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05或0.01)。37℃复温组伤后细胞活力各时相点与伤前值相近(P>0.05);与对照组比较,其细胞形态、胶原代谢基本无变化(P>0.05).结论低温处理后细胞脱水是一种保护机制,适宜的复温条件能使细胞复苏;与20℃相比,37℃复温对细胞的损伤较轻。     

前列腺素E_2(PGE_2)对瘢痕成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因表达的影响

目的　探索PGE2 抑制瘢痕成纤维细胞胶原合成的机理。方法　从新鲜的增生期瘢痕组织中培养成纤维细胞 ,采用Dotblot杂交法观测PGE2 对瘢痕成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原基因表达的影响。结果　PGE2 显著降低瘢痕成纤维细胞内Ⅰ、Ⅲ前胶原mRNA的含量。结论　PGE2 在胶原转录水平抑制瘢痕成纤维细胞的胶原合成。     

两种扩张方法对成纤维细胞I、Ⅲ型前胶原mRNA和蛋白表达的影响

目的：研究持续恒压组织扩张术（CPTE）和常规间断组织扩张术（CITE）对成纤维细胞胶原合成能力的影响。方法：用12只白色小家猪制作CPTE和CITE动物模型，用核酸分子原位杂交和免疫组织化学技术观察成纤维细胞前胶原mRNA和前胶原蛋白的表达。结果：扩张中成纤维细胞内前胶原mRNA和前胶原蛋白的表达增强，扩张皮瓣移植后进一步增强，皮肤厚度恢复后下降，CPTE组的表达强度高于CITE组。皮瓣形成后CPTE组的真皮厚度恢复时间早于CITE组。结论：终止扩张后成纤维细胞前胶原mRNA和前胶原蛋白的表达高于扩张期。持续恒压扩张能更有效地诱导皮肤生长。