胶质瘤细胞与星形胶质细胞骨架荧光成像的比较

目的探讨C6胶质瘤细胞与侵袭性相关的骨架构筑特点。方法利用免疫荧光技术对C6胶质瘤细胞及星形胶质细胞的骨架成分进行成像及比较分析,流式细胞仪检测两种细胞F-actin的荧光强度。结果C6胶质瘤细胞的三种骨架成分呈网架结构,以核为中心向外周放射,边界不齐、毛糙,此外,微丝发达密集,中间丝呈高度网络结构。星形胶质细胞三种骨架成分呈网架结构,但细胞边界整齐,微丝稀疏,中间丝发达密集,呈栏栅状排列。C6胶质瘤细胞内F-actin的荧光强度(202.54±11.06)明显强于星形胶质细胞内F-actin的荧光强度(62.64±10.23),P<0.01。结论C6胶质瘤细胞骨架呈网架结构,边界不齐、毛糙,微丝发达密集,中间丝呈高度网络结构,可能均与侵袭性相关的特征结构表现,C6胶质瘤细胞含有丰富的F-actin与侵袭性有关。     

胶质纤维酸性蛋白和波形蛋白在胶质瘤诊断中的应用

<正> 有关人脑胶质瘤中胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、波形蛋白(vimentin,VIM)免疫组化的研究近年来十分活跃。GFAP与VIM在星形细胞瘤中共存的情况及意义;二者在各型星形细胞瘤中的分布与肿瘤的分型、分级、肿瘤组织分化程度的研究都取得了可喜的进展。本文综述这方面的研究进展。1 中间丝所有细胞的细胞质内都含有细丝状的网架,称细胞骨架。这些骨架有3类:直径6nm的微丝、25nm的微管和介于两者之间直径10nm的中间丝。不同类型细胞的     

层粘连蛋白受体与配体在C6胶质瘤细胞中的表达及意义

目的 检测层粘连蛋白受体与配体在C6胶质瘤细胞中的表达水平，探讨两者在胶质瘤细胞侵袭性生长和诱导神经干细胞迁移中的意义。方法 从新生3～5d的SD大鼠大脑皮层中分离和培养星形胶质细胞为对照，同时培养C6胶质瘤细胞。采用半定量RT—PCR方法分析层粘连蛋白受体和配体mRNA在星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞中表达的差异。结果 星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞中均表达层粘连蛋白受体和配体mRNA，而C6胶质瘤细胞呈明显高表达（P〈0．05，P〈0．01）。结论 C6胶质瘤细胞中表达上调的层粘连蛋白受体和配体可能是胶质瘤细胞侵袭性生长和诱导神经干细胞迁移的因素之一。     

星形胶质细胞和星形胶质瘤细胞骨架的光镜和电镜观察

目的：观察正常星形胶质细胞和星形胶质瘤细胞系SWO-38的细胞骨架的区别。方法：分别用光镜和电镜观察正常星形胶质细胞和SWO-38的细胞骨架。结果和结论：两种方法都很清晰地显示出微管和微丝。正常星形胶质细胞微管和微丝发达,属丰满型;粗大的张力纤维贯穿细胞全长,接近平行分布,偶见交叉呈“Z”形状。而SWO-38细胞的微管则明显减少,属稀疏型;细胞中仅见少量纤细的张力纤维,多数微丝束形成点状或树根状肌动蛋白小体,微管和微丝呈收缩趋势。     

星形胶质细胞和星形胶质瘤细胞骨架的光镜和电镜观察

目的观察正常星形胶质细胞和星形胶质瘤细胞系ＳＷＯ－３８的细胞骨架的区别。方法分别用光镜和电镜观察正常 星形胶质细胞和ＳＷＯ－３８的细胞骨架。结果和结论两种方法都很清晰地显示出微管和微丝。正常星形胶质细胞微管和 微丝发达,属丰满型;粗大的张力纤维贯穿细胞全长,接近平行分布,偶见交叉呈“Ｚ”形状。而ＳＷＯ－３８细胞的微管则明显 减少,属稀疏型;细胞中仅见少量纤细的张力纤维,多数微丝束形成点状或树根状肌动蛋白小体,微管和微丝呈收缩趋势。     

人恶性胶质瘤细胞系CHG-5和SHG-44细胞骨架的比较研究

目的：比较人恶性肿瘤胶质瘤细胞系CHG－5和SHG－44的细胞骨架系统成分,以进一步了解胶质瘤细胞骨架特征与其分化程度的关系。方法：利用免疫荧光细胞化学染色结合激光共聚焦显微镜观察两种细胞系微管、微丝、中间丝的含量及分布,并比较几种常用固定剂和缓冲液对各骨架成分检测的影响。结果：除微管和微丝均被染色外,所有细胞表达Vimentin(波形蛋白）,而只有部分细胞呈胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性。微管及中间丝在两种细胞胞质中的分布特征基本相似,但两种相细胞微丝的定位、分布及荧光强度有一定差异。Vimentin型中间丝在SHG－44细胞中表达较强,而GFAP在CHG－5细胞中表达较强。丙酮、75％酒精和4％多聚甲醛对微管的固定效果较好;用醛类固定后中间丝（尤其是Vimentin）染色极弱。结论：CHG－5分化程度较SHG－44高,两种细胞系细胞骨架状态的差异可能是二者生物学特性差异的结论基础。     

巨细胞病毒感染细胞内微丝骨架重组异常

目的:探讨巨细胞病毒(CMV)感染对人胚成纤维细胞(HF)微丝骨架影响及与病毒复制状态的可能关系。方法:显微镜观察细胞形态;W estern-b lot法分别检测细胞内β型肌动蛋白(β-actin)、球状肌动蛋白(G-actin)和纤维形肌动蛋白(F-actin)的含量;间接免疫荧光标记病毒即刻早期抗原(IE);微丝骨架探针观察HF细胞内感染状况及微丝骨架变化。结果:HF细胞CMV感染率大于95%,IE抗原主要位于细胞核。受染细胞变粗、变圆,甚至脱壁,呈时间依赖性。与未感染组相比,CMV感染后细胞内β-actin蛋白质含量有所下降,但无显著性差异(P>0.05);G-actin水平在感染24 h后增加(0.941±0.061 vs 0.714±0.119,P<0.05),但在感染后72 h、96 h却下降(0.218±0.035、0.230±0.055 vs 0.714±0.119,P<0.05);F-actin水平在感染后24 h、72 h、96 h呈渐进性下降(0.256±0.021、0.127±0.032、0.026±0.008 vs 0.373±0.050,P<0.05)。受染细胞内微丝排列紊乱,极性消失;细胞融合,荧光强度明显减弱。结论:CMV引起HF细胞内肌动蛋白质、微丝骨架形态及重组异常,可能有助于其侵袭宿主细胞并进一步活化及复制。     

C6胶质瘤细胞培养上清诱导神经干细胞迁移的初步研究

目的:观察体外培养的胶质瘤细胞在体外能否引起神经干细胞的迁移,从而为研究胶质瘤细胞中存在促进神经干细胞迁移的物质打下基础。方法:分别培养神经干细胞、星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞。以星形胶质细胞为对照,做细胞迁移实验,观察其结果;将C6胶质瘤细胞、星形胶质细胞的无血清培养上清分别浓缩,并行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,观察其结果。结果:(1)C6胶质瘤细胞的培养上清引起神经干细胞迁移的数目明显多于星形胶质细胞的培养上清和新鲜无血清培养基(P<0.01);(2)将无血清培养的等浓度的C6胶质瘤细胞、星形胶质细胞的上清浓缩蛋白电泳,可见二者蛋白条带存在明显差异。结论:(1)从新生大鼠大脑皮层组织可以培养出神经干细胞和星形胶质细胞。(2)C6胶质瘤细胞无血清培养的上清中存在着能够诱导神经干细胞迁移的物质。     

双向电泳技术分析大鼠星形细胞和C6细胞的蛋白差异

目的：建立大鼠星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的双向电泳（2-DE）技术体系,寻找星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的蛋白表达差异。方法：提取大鼠星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞中的总蛋白,进行第一向等电聚焦（IEF）和第二向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离总蛋白,GS-800获得凝胶图像,并测量不同凝胶间蛋白斑点在IEF和SDS-PAGE方向上的位置偏差,使用PDQuest7.3软件对凝胶图像进行分析,找出星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的差异表达蛋白。结果：星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的蛋白表达谱上,分别检测到523±16和550±20个蛋白点,平均匹配点数为452±18和472±21,匹配率达86.4%和85.8%,不同凝胶间蛋白质点在IEF方向的偏差为（0.67±0.48）mm,在SDS-PAGE方向上的偏差为（0.73±0.56）mm,对比分析了星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的2-DE图谱,发现有24个点发生了明显的表达变化（P〈0.01）,在星形胶质细胞中高表达的点有8个,在C6胶质瘤细胞中高表达的点有14个,星形胶质细胞中没有发现表达的点有2个。结论：建立了大鼠星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞的双向电泳技术体系,发现两者的双向电泳图谱存在明显差异,C6胶质瘤细胞中表达上调以及星形胶质细胞中没有发现表达的蛋白可能与肿瘤的发生,神经干细胞的迁移有关,表达下调的蛋白可能与抑制肿瘤的发生有关。     

C6胶质瘤细胞对体外共培养大鼠神经干细胞增殖影响的初步研究

目的探索与C6胶质瘤细胞体外共培养后大鼠神经干细胞（Neural Stem Cells NSCs）的增殖变化。方法分别培养神经干细胞、星形胶质细胞和C6胶质瘤细胞。利用共培养池（cell culturetranswell inserts）建立两种细胞的体外共培养模型。应用相差显微镜及电镜观察各组共培养后NSCs的形态变化;共培养后NSCs MTT法作生长曲线。结果原代培养后获得神经干细胞及星形胶质细胞;与C6胶质瘤细胞共培养7天后的NSCs增殖较对照组快,电镜观察可见核质比增高,细胞器较发达。结论 C6胶质瘤细胞对体外共培养的大鼠NSCs的增殖有一定促进作用。     

流体剪切力和细胞骨架阻断对肌动蛋白丝的影响

目的：探讨流体剪切力对成骨细胞细胞骨架的影响.方法：实验分为3组,Ⅰ组（流体剪切力）,Ⅱ组（流体剪切力＋细胞松弛素D,Cytochalasin D）,Ⅲ组（流体剪切力＋噻氨酯哒唑,Nocodazole）.分别对Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ组施加12dyne/cm2流体剪应力,应力作用时间分别为：0,10,30,60min.采用激光共聚焦显微镜、免疫荧光显微镜技术和免疫荧光染色方法对小鼠成骨细胞骨架进行形态学观察、F-肌动蛋白表达的荧光定量分析.结果：细胞在不同时间点受到同一剪切应力后,细胞的排列方向发生改变,细胞内的F-肌动蛋白排列同应力方向一致,随着应力时间延长到1h,F-肌动蛋白变得厚而丰富,F-肌动蛋白的荧光强度同0时段剪切力组相比明显增强（P〈0.01）.当加入细胞松驰素D后,细胞内F-肌动蛋白结构发生改变,在力的作用下,细胞内微丝断裂明显,随着拉伸时间的延长,微丝断裂更为明显,F-肌动蛋白的荧光强度同0时段剪切力组相比显著减弱（P〈0.01）.加入噻氨酯哒唑后,在剪切力作用下细胞内微管断裂,F-肌动蛋白丝完整且边缘呈锯齿状改变,它的荧光强度同0时段剪切力组相比也有明显减弱（P〈0.05）.结论：不同时间点受到同一剪切应力对细胞骨架微丝、微管结构产生一定的影响,微丝解聚和重排以及微管断裂与否在细胞力传导中起重要作用.     

Localization of Vibrio vulnificus infection in dendritic cells and its effects on the cytoskeleton

Background  Vibrio vulnificus (Vv) is an estuarine bacterium that can cause primary septicemia as well as serious wound infections. However, little is known about the mechanisms by which Vv infects dendritic cells (DCs) and its effects on cytoskeleton. In this study, we aimed to investigate the invasion, internalization, and the organelles damage of the cultured dendritic cells (a DC 2.4 strain) during Vv infection.

Methods  The study model was the cultured DCs infected by a Vv 1.758 strain. Electron microscopy was used to observe the localization of bacteria at the different time points of infection, cell morphology, and the process of organelles changes. The cytoskeleton structure including the microfilaments and the microtubules rearrangement was examined under a fluorescence microscope.

Results  The Vv were pinocytosised into the DC cells through double-sides, and localized at 1-2  mm of the inner side membrane. It took 1.3, 1.9, and 3.4 hours to reach the infection ratio of 25%, 50%, and 75%, respectively. Using electron microscopy, the DCs had been observed to have developed chromatin aggregation within 4.0 hours, and significant cytoskeleton structure disruption was noted within 6.0 hours.

Conclusion  The high lethality of Vv infection may be associated with the direct disruption of the DCs cytoskeleton structure.

     

不同培养时期多细胞肿瘤球体表层细胞F－肌动蛋白微丝的研究

使用特异荧光探针定位术，对不同培养时期人喉癌细胞系（ＨＥｐ２）ＭＴＳ表层细胞的Ｆ－肌动蛋白微丝骨架进行了对比观察。结果表明，随着多细胞肿瘤球体（ＭＴＳ）转移培养时间的延长，表层细胞中出现数目较多的Ｆ－肌动蛋白小体，其直径约为０．３～１．０μｍ。Ｆ－肌动蛋白微丝结构的改变，可能与ＭＴＳ表层细胞的侵袭与转移活性增强有关，但也有可能是表层细胞在不同生理状况下的一种反应。     

人骨形成蛋白-2和透明质酸对脑胶质细胞瘤侵袭性的影响

目的 探讨人骨形成蛋白-2(rhBMP-2)和透明质酸(HA)对C6胶质细胞瘤体内侵袭的影响。方法 将携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的pEGFP-N3质粒体外转染C6胶质瘤细胞,将C6阳性克隆以立体定向法植入SD大鼠脑实质内,建立大鼠胶质瘤移植模型。移植瘤区给予不同剂量的rhBMP-2和HA,用病理检查、流式细胞计数、荧光显微镜及电子显微镜观察rhBMP-2和HA对胶质瘤侵袭的影响。结果 稳定转染EGFP基因的C6瘤细胞于体内、外均可发出绿色荧光,在荧光显微镜下易于区分肿瘤与非肿瘤区,并能检测到少量C6瘤细胞的远处侵袭性生长。10μl的5μg／ml rhBMP-2可明显抑制肿瘤体内侵袭;而10μl的100μg／ml HA则具有相反的作用。结论 EGFP标记的C6瘤细胞移植于大鼠脑内,可建成稳定的脑胶质细胞瘤体内侵袭动物模型。rhBMP-2降低了C6瘤细胞的体内侵袭性,而HA则明显促进了其体内侵袭作用。     

脑胶质细胞瘤体内侵袭性的实验研究

目的 探讨胶质瘤的体内侵袭和转移特性。方法 利用体外转染有绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）基因的大鼠Ｃ６脑胶质瘤细胞移植模型,将携有增强型绿色荧光蛋白（ＥＧＦＰ）基因的pＥＧＦＰ－N３质粒体外转染Ｃ６细胞,筛选能稳定表达ＧＦＰ的瘤细胞克隆,并做流工细胞仪和电镜检测。将阳性转染和未转染瘤细胞以立体定向法植入ＳＤ大鼠脑实质仙,建立大鼠移植瘤模型。４周后处死大鼠并作脑连续石蜡切片,相邻切片分别行苏木素－伊红（ＨＥ）及免疫组织化学染色和荧光显微镜（激发光波长为４８８mm)检测。对移植瘤细胞行原代培养,以检测荧光基因在体内的保存情况。结果 阳性转染的Ｃ６瘤细胞的ＥＧＦＰ在大鼠脑内获得稳定表达,在荧光显微镜下较易于区分肿瘤与非肿瘤区,并能发现侵袭至远处的单个瘤细胞,其敏感性及特异性明显优于ＨＥ染色或免疫组化方法。结论 ＧＦＰ基因体外转染Ｃ6胶质瘤细胞并行大鼠脑内移植,是一种较好的研究脑胶质瘤侵袭性的体内实验模型。     

金黄色葡萄球菌侵入人脐静脉内皮细胞初期细胞骨架的动态变化

目的探讨不同毒力的金黄色葡萄球菌（标准菌株ATCC25923,产肠毒素株FRS6B）感染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）初期,细胞骨架动态变化情况。方法常规方法制备菌液,分别感染HUVEC,1、2、4h后流式细胞仪分析细胞凋亡,应用激光共聚焦荧光显微镜观察细胞骨架的动态变化。结果两种不同毒力的金黄色葡萄球菌与HUVEC共育1h后即有凋亡细胞发生,共聚焦显微镜观察可见两种细胞作用1h后细胞骨架微丝、微管均发生了改变,作用4h后细胞内聚集大量细菌,细胞骨架微丝、微管部分开始解离。结论两种金黄色葡萄球菌感染HUVEC初期,产肠毒素菌株FRS6B诱导细胞凋亡明显高于ATCC25923,细胞骨架的动态变化存在差异。     

大肠杆菌K1株毒力岛基因ibeT参与调节脑微血管内皮细胞骨架重排

目的探讨大肠杆菌K1株毒力岛基因ibeT与人脑微血管内皮细胞(HBMEC)骨架重排的关系。方法从大肠杆菌K1 E44中剔除侵袭基因ibeT,利用ibeT基因缺失突变株侵袭HBMEC 10 min后,再用罗丹明标记的毒伞素对细胞骨架进行染色,荧光显微镜观察。结果 E44与E44:△ibeT均能引起HBMEC的微丝发生重新分布。与E44相比,E44:△ibeT侵袭HBMEC的微丝向细胞周边延伸的程度较E44侵袭后的HBMEC弱,所形成的膜皱褶结构较少。E44侵袭细胞皮质区的肌动蛋白纤维基本消失,E44:△ibeT侵袭HBMEC细胞皮质区的肌动蛋白纤维仍然清晰可见。结论侵袭基因ibeT参与大肠杆菌K1侵袭HBMEC骨架重排。     

成骨生长肽对大鼠成骨细胞骨架蛋白的影响

目的 研究成骨生长肽OGP在体外对大鼠颅盖骨成骨细胞细胞骨架的影响.方法 在体外培养的新生大鼠颅盖骨成骨细胞中加入浓度为10-8mol/L的OGP,处理30min,6、12h后收集细胞爬片,采用BODYPY-Phalloidin对骨架蛋白直接荧光染色,在激光扫描共聚焦显微镜下观察OGP作用后,不同时间点成骨细胞细胞骨架的变化情况.结果 OGP作用于成骨细胞后,细胞骨架出现解聚重组现象,在6h时解聚作用最为明显,12h后可见细胞骨架发生重组.结论 OGP可促进成骨细胞细胞骨架的重组.     

磷脂酶C分子在结核分枝杆菌触发树突状细胞细胞骨架重排中的作用

目的：研究结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）侵入小鼠树突状细胞株（DC2.4）时细胞骨架微丝、微管变化及其与磷脂酶C（PLC）分子的关系。 方法：建立人结核分枝杆菌H37Rv株DC2.4细胞混合培养模型。采用罗丹明标记的鬼笔环肽（Palloidin-TRITC）染细胞F-actin,用抗微管蛋白β亚单位的小鼠一抗和荧光素标记的兔抗小鼠二抗染细胞微管,检测H37Rv株侵入DC2.4细胞时细胞骨架的变化情况,并计算F-actin重排率。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测DC2.4细胞浆和细胞膜中PLC分子的表达。采用PLC分子抑制剂U73122预处理DC2.4细胞,观察H37Rv株侵入率变化以及对细胞骨架变化的影响。 结果：结核分枝杆菌H37Rv株与DC2.4细胞共育2 h,即见有细菌侵入,共育4、6、8、10、12 h后,H37Rv侵入率分别为（26.1±4.5）%、（39.9±5.6）%、（51.2±5.9）%、（57.9±6.1）%和（63.9±6.8）%;H37Rv侵入2、4、6、8、10、12 h时,F-actin重排百分率分别为（26.9±1.5）%、（59.3±2.8）%、（72.7±4.8）%、（78.2±5.9）%、（63.3±2.9）%和（43.2±2.6）%,而PLC信号分子阻断后,DC2.4细胞的侵入率则分别为（13.6±3.1）%、（14.2±3.9）%、（15.1±4.3）%、（16.8±4.0）%和（18.3±5.2）%,F-actin重排率也分别为（18.5±1.2）%、（22.3±1.7）%、（23.6±2.5）%、（24.8±2.3）%、（22.3±1.3）%和（23.8±1.8）%,而微管变化不大;混合培养4、6、8、10 h,PLC信号通路阻断前的侵入率和F-actin重排率明显高于PLC分子阻断后（P＜0.05）。侵入2 h后,DC2.4细胞膜中的PLC分子表达即开始升高,至8 h时达最高;U73122可抑制DC2.4细胞膜中PLC分子的表达,而对细胞浆中的PLC分子影响不大。 结论：结核分枝杆菌可通过激活DC2.4细胞PLC分子触发F-actin细胞骨架重排,从而侵入DC2.4细胞,且PLC分子的表达主要存在于DC2.4细胞膜上。