重组弓形虫致密颗粒蛋白7的表达及免疫活性分析

目的:重组表达弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7),分析其免疫活性。方法:采用聚合酶链反应(PCR)从刚地弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因,经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23a(+),转化大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GRA7,用His-bindTM亲和层析柱纯化,免疫印迹和小鼠免疫分析其抗原性。结果:PCR扩增出大小约660bp的GRA7基因片段,并被亚克隆到原核表达载体pET-23a(+),构建了原核重组表达质粒pET-GRA7;表达纯化获得分子量约29,000的重组GRA7;重组GRA7能被弓形虫感染兔血清所识别,并诱导小鼠产生抗体滴度达1:12800。结论:获得了具有良好免疫学活性的重组抗原GRA7。     

含KSHV vIL-6基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与鉴定

目的:在大肠埃希菌中表达卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)vIL-6基因,并进一步纯化和鉴定表达蛋白.方法:以本实验室已构建的重组质粒pGEX-6p-1-vIL-6为模板,PCR扩增目的基因片段,将PCR产物克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,构建vIL-6的重组原核表达质粒pET-32a(+)-vIL-6.将重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.表达产物通过镍亲和层析柱纯化并经蛋白质印迹法鉴定.结果:限制性内切酶检测和基因测序证实,成功构建了含有vIL-6基因的原核表达载体.蛋白质印迹法结果显示,在大肠埃希菌BL21(DE3)中His-Tag融合蛋白得到了表达,亲和层析法纯化后获得了相对分子质量为43 000的vIL-6融合蛋白.结论:重组质粒pET-32a(+) -vIL-6能在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,利用镍亲和层析柱可纯化获得融合蛋白.     

Nogo-66蛋白氨基酸肽的克隆及在原核细胞的表达

目的: 克隆编码Nogo-66氨基酸多肽基因,构建原核重组表达载体,并诱导其在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达。方法: 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增出编码Nogo蛋白环外-66氨基酸多肽基因,将其克隆于T载体PMD18-T,酶切鉴定后再亚克隆于原核表达载体pET-42a(+),酶切及测序证实序列正确后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白-Nogo-66。结果: 克隆了编码Nogo蛋白环外-66氨基酸多肽基因,构建了融合蛋白的重组表达质粒,融合蛋白的表达随着时间延长增加。结论: 获得了编码Nogo蛋白环外-66氨基酸多肽基因及其原核表达产物,对研究Nogo蛋白的生物学功能及其mAb的制备奠定基础。     

重组人Importin α的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的重组表达人细胞核输入蛋白α（Importin α）,制备多克隆抗体。方法提取人肝癌细胞HepG2中的总RNA,RT-PCR法扩增Importin α基因。构建pGEX-6P-1-Importin α融合表达载体,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达GST-Importin α重组蛋白,经谷胱甘肽亲和层析纯化,然后免疫小鼠,制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。结果 RT-PCR扩增出的Importin α基因片段（1300bp）与理论大小一致。SDSPAGE和蛋白质印迹分析纯化GST-Importin α重组蛋白相对分子质量为83kD,与质谱分析的相对分子质量结果相符。重组蛋白免疫小鼠后收获抗血清,ELISA显示抗体效价高。结论在大肠埃希菌中成功表达并纯化Importin α蛋白,获得多克隆抗体,为进一步研究输入系统及其应用打下基础。     

日本血吸虫重组质粒pET28α-Sj26GST的构建及其表达

目的 构建日本血吸虫重组质粒pET28a-Sj26GST,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得Sj26GST抗原编码基因,克隆至原核表达载体pET28a,构建重组质粒pET28a-Sj26GST,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定.结果 RT-PCR扩增出676 bp的Sj26GST基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST基因成功插入pET28a中,SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约为36×103的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的26%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了日本血吸虫重组质粒pET28d-Sj26GST,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.     

粉尘螨第五组主要变应原(Der f5)的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定

目的 克隆表达粉尘螨第五组变应原(Dermatophagoides farinae,Der f5)基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性.方法 提取活粉尘螨总RNA,扩增Der f5片段.PCR产物与克隆载体pMD18-T连接,转化入大肠埃希菌JM109,经酶切及测序鉴定获得pMD18-Der f5阳性菌株,再提取质粒进行双酶切,与表达载体pET-30a(+)连接,转化人大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其表达效果.Ni-IDA亲和层析柱纯化蛋白,利用尘螨病人血清鉴定其免疫原性.结果 构建了重组质粒pMD18-Der f5和pET30a-Der f5,SDS-PAGE结果表明Der f5基因在BL21中获得良好的可溶性表达,蛋白质分子量与理论值相符.纯化的蛋白与病人血清有良好的IgE结合活性.结论 获得广州地区Der f5的原核表达载体,高效表达纯化重组蛋白.初步鉴定了该蛋白的免疫原性.     

阴道毛滴虫RRas基因的cDNA克隆和原核表达

目的克隆和表达阴道毛滴虫RRas(TvRRas)基因,以便进一步探讨其组织定位及功能。方法应用PCR方法从构建的阴道毛滴虫cDNA表达文库中扩增TvRRas基因片段,克隆至pGEM-T载体,经PCR、酶切和测序鉴定后亚克隆至原核表达载体pET-41a,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21,经异丙基硫代--βD-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍-硝基三乙酸(Ni-NTA)柱纯化表达产物后用SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析鉴定。结果从阴道毛滴虫cDNA表达文库中扩增的TvRRas基因片段长522bp,酶切及DNA测序证实pET-41a/TvRRas重组质粒构建正确,表达融合蛋白分子量约为45000u。结论成功构建重组原核表达质粒pET-41a/TvRRas,并能在大肠埃希菌内表达,所表达的融合蛋白分子量大小与预期一致。     

日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的 构建日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST-Sj32,分析该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达情况.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫提取总RNA,通过RT-PCR扩增获得Sj26GST和Sj32抗原编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)剪接Sj26GST和Sj32,得到Sj26GST-Sj32融合基因,克隆至原核表达载体pET32α(+),构建重组质粒pET32α-Sj26GST-Sj32,转化人大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析和鉴定.结果 基因拼接法扩增出约1991 bp的Sj26GST-Sj32融合基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST-Sj32融合基因成功插入pET32a(+)中,SDS-PAGE分析显示表达产物为分子质量约82000 Mr的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的22%;Westem-blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.     

粉尘螨Der f5克隆表达、纯化和免疫原性鉴定

目的克隆表达粉尘螨第5组变应原(dermatophagoides farinae,Der f5)基因,并鉴定纯化蛋白免疫原性。方法根据Der f5基因已知序列,设计出相应的引物,提取粉尘螨总RNA,采用RT-PCR方法扩增出Der f5基因片段,PCR产物克隆入pMD18-T载体,转化大肠埃希菌Top10,经PCR和酶切鉴定并测序。将上述所得阳性克隆菌株扩大培养,碱裂解法提取质粒,所得重组质粒pMD18-T-Der f5和空质粒pET-32a同时用限制性内切酶Bam HⅠ与HindⅢ双酶切,经纯化后连接并转化至大肠埃希菌Top10。构建的重组质粒pET32a-Der f5,经PCR、酶切和测序鉴定后,再转化至大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定其表达效果,用Ni+离子亲和层析柱纯化重组质粒pET32a-Der f5表达产生的组氨酸重组蛋白。结果构建了重组质粒pMD18-T-Der f5和pET32a-Der f5。SDS-PAGE结果表明Der f5基因在大肠埃希菌BL21(DE3)中获得良好的表达,经亲和层析纯化后,SDS-PAGE结果显示单一条带。该蛋白以尘螨过敏患者血清进行Western blotting,结果表明具有良好的IgE结合活性。结论克隆、表达并纯化了具有良好尘螨致敏患者IgE结合活性的Der f5,为粉尘螨变态反应性疾病的特异性诊断和治疗以及进一步的实验研究奠定了基础。     

伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB：z66的克隆表达及其多克隆抗体的制备

目的: 克隆表达H:z66阳性伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66,并纯化制备相应的多克隆抗体.方法: 利用PCR 技术从H:z66阳性伤寒沙门菌基因组DNA中得到鞭毛素基因fljB:z66,将该基因克隆到表达载体pET-28a(+)上并在大肠埃希菌JM109中进行表达;fljB:z66的表达产物经Ni柱纯化后作为抗原免疫兔以制备多克隆抗体.结果: 经PCR及序列分析证实,伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66 被成功导入表达载体pET-28a(+),并在大肠埃希菌JM109中获得了高效表达,以此作为抗原成功制备了兔抗z66的多克隆抗体.结论: 成功克隆表达了H:z66阳性伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:z66,并制备了相应的多克隆抗体,为今后深入研究H:z66阳性伤寒沙门菌的单向相变换机制奠定了基础.     

DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒载体的构建与鉴定

目的构建表达DREAM基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒(rAAV)载体,并观察感染PC12细胞后DREAM蛋白表达受抑制情况。方法设计并合成shRNA对应的2条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,构建pDC316-EGFP-DREAMshRNA-U6质粒,以其为模板设计引物并引入EcoRⅠ和SalⅠ位点,PCR产物酶切后与pSANV2.0连接构建重组质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,酶切测序证实后,重组腺相关病毒介导将pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP感染PC12细胞,Western blot检测DREAM蛋白表达水平。结果经PCR、酶切及测序证实,重组腺相关病毒载体质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP构建成功,包装成病毒感染PC12细胞48 h后,Western blot结果显示与对照组细胞相比,DREAM蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论成功构建和筛选出介导特异性shRNA-DREAM的重组腺相关病毒载体。     

日本血吸虫合抱相关未知功能基因SJCHGC00821的克隆及生物信息学分析

目的 克隆与日本血吸虫合抱相关但未知功能的新基因SJCHGC00821，构建其真核表达载体，并应用生物信息学初步探讨其功能。方法 应用PCR技术从日本血吸虫成虫cDNA文库中扩增SJCHGC00821基因全长ORF，将其亚克隆到真核表达载体pcDNA3中，通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定。应用生物信息学初步分析其细胞定位、蛋白序列、结构域及功能。结果 获得日本血吸虫合抱相关未知基因SJCHGC00821的克隆，序列分析结果提示该cDNA序列含有一个597bp的完整阅读框序列，编码198个氨基酸，其编码蛋白的理论分子量为22．76kDa，等电点为4．84。二级结构分析预测提示其具有一定抗原性。结论 成功地克隆了日本血吸虫SJCHGC00821基因全长ORF，构建了其pcDNA3真核表达载体，为进一步研究其结构与功能创造了条件。     

人CYB5R2基因真核表达载体的构建

目的构建人CYB5R2基因真核表达载体,并观察其在人鼻咽癌细胞HONE1中的表达。方法根据表达载体pCMV-Tag3A上的多克隆位点和CYB5R2基因CDS序列设计引物,应用RT-PCR从人睾丸cDNA中克隆出CYB5R2的CDS,并进行TA克隆。对经PER、双酶切和双向测序验证正确的质粒,进行CDS目的片段的回收,将其连接于pCMV-Tag3A载体的多克隆位点内构建真核载体,然后进行PCR、双酶切和双向测序验证。脂质体法转染鼻咽癌细胞HONE1细胞,荧光显微镜观察和RT—PCR验证该基因的表达。结果PCR、双酶切和双向测序结果显示pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体构建成功,荧光显微镜和RT—PER的结果显示该重组质粒在HONE1细胞中正确表达。结论成功构建了pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体,并在鼻咽癌细胞HONE1中表达,为进一步验证其抑癌作用及探索其抑癌机制做准备。     

hHGF-αcDNA的克隆及表达载体的构建

目的定点突变法扩增制备完整hHGF-α cDNA,克隆并构建其原核表达载体。方法与结果以含有人HGF cDNA全序列的质粒pRC/CMV-hHGF为模板,设计合成一对特异引物进行聚合酶链反应(PCR),扩增hHGF-α cDNA基因,琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示扩增得到了1.34 kb长的目的基因产物。将扩增产物以限制性内切酶Xho Ⅰ酶将其切为386 bp、954;bp两个片段,分别以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、Xho Ⅰ/BamH Ⅰ与pBSKS载体连接重组,对目的基因分段克隆后进行序列测定,结果表明除通过定点突变引入的起始密码ATG、终止密码子TAA、TGA及EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ识别位点外,扩增得到的PCR产物序列与Nakamura等报道的HGF cDNA中不包括前体序列的α链部分完全相同。将以EcoR Ⅰ/Xho Ⅰ、Xho Ⅰ/BamH Ⅰ从pBSKS-HGF-α 386、pBSKS-HGF-α 954中切出的386 bp、954 bp两个片段以EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ与pBV220连接构建重组表达质粒pBV220-HGF-α,限制性内切酶图谱分析显示HGF-α cDNA插入到载体pBV220的EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ位点,插入方向正确。温度诱导表达,SDS-PAGE显示一分子量与单体hHGF-α链吻合的蛋白带,证明表达质粒构建成功。结论设计制备了hHGF-α链cDNA,克隆建立了hHGF-α链原核表达质粒。     

乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因载体的构建及表达

目的：构建乏氧（HRE）/辐射（Egr1）双敏感启动子介导的分泌型人TRAIL (shTRAIL)基因表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,观察乏氧和辐射对其表达的影响。 方法：利用化学合成HRE上、下链,PCR扩增得到双链HRE;pMD19T-Egr1经Sac Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切得到Egr1;pshuttle-shTRAIL 经Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切得到shTRAIL;利用基因重组技术构建含有HRE/Egr1双敏感启动子介导shTRAIL的表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,经酶切、PCR和测序鉴定正确。肺腺癌A549细胞分为正常组、乏氧组（1%）、照射组(6 Gy)和乏氧加照射组;表达载体转染肺腺癌A549细胞,RT-PCR及ELISA法检测shTRAIL的表达。结果：BamH Ⅰ和Sma Ⅰ酶切,所得片段大小分别为1 284和4 998　bp、2 292和3 990 bp;以Egr1和shTRAIL引物PCR扩增该载体,得到469和820 bp产物;将pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL进行测序,所得结果与设计一致,说明构建正确。转染肺腺癌A549细胞后,乏氧组、辐射组及乏氧加照射组shTRAIL mRNA和蛋白表达增加,与对照组比较差异有显著性（P<0.05）,且乏氧加照射组表达更明显。结论：成功地构建了乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因表达的载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL;乏氧及照射能够诱导TRAIL表达增加,且二者具有协同作用。     

人肝细胞生长因子真核表达载体的构建及在COS7细胞中的表达

目的:构建人肝细胞生长因子（HGF）的真核表达载体,并在COS₇细胞中进表达。方法:利用PCR技术扩增HGF基因,与PCI-Neo载体连接,构建成重组真核表达载体PCI-neo-HGF,应用限制性内切酶法及测序方法进行鉴定。利用脂质体将PCI-HGF转入COS₇细胞系中,用ELISA法检测培养液上清中的HGF的表达水平。结果:重组真核表达载体PCI-neo-HGF经限制性内切酶分析,片段与理论值相符,测序结果与GenBank 对比, HGFcDNA序列同源性99%, 插入正确;将重组真核表达载体PCI-neo-HGF转染COS₇细胞,于转染12 h开始有表达,36～72 h表达量较高(约2 000 ng•L^-1),以后逐渐下降。结论: 成功构建了带有HGF 基因真核表达载体,并能在转染细胞中表达。     

GST-Fank1融合蛋白表达载体构建及表达纯化的研究

 摘要 目的： 研究转录因子Fank1与GST融合蛋白原核表达载体的构建和表达。方法： 根据编码Fank1蛋白的DNA序列,经引物设计软件Primer Premier 5.0优化设计出上下游引物（Ⅰ,Ⅱ）,同时在5′端引入BamHⅠ酶切位点,3′端引入SalⅠ酶切位点。以pdsRED-Fank1质粒为模板进行PCR扩增Fank1目的片段,经限制性内切酶酶切后连接到原核表达载体pGEX4T-2, 构建成pGEX4T-2- Fank1原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,通过异丙基硫代-β-D半乳糖苷诱导进行目的蛋白表达。 结果： 经菌液PCR、电泳分析及测序证明成功构建了Fank1融合表达载体,融合蛋白产物经蛋白印迹显示,相对分子量为44KD的蛋白条带,与预期一致。 结论： 成功构建了pGEX4T-2- Fank1原核表达载体,并在原核细胞中有表达,为进一步研究转录因子Fank1的功能奠定了基础。     

日本血吸虫碱性调宁蛋白样蛋白P14基因的原核表达及鉴定

目的:原核表达并鉴定日本血吸虫P14基因(SjP14)。方法:提取日本血吸虫成虫总RNA,RT-PCR扩增SjP14基因,插入pGEM-T载体后酶切鉴定,再亚克隆至pET28a(+)原核表达载体并转化感受态细胞E.coli BL21,1mmol/L的IPTG诱导表达后,用纯化试剂盒纯化并进行SDS-PAGE分析和Western blot鉴定。结果:RT-PCR扩增后获得一特异性基因片段,测序及比对后确认为SjP14基因。用IPTG诱导含重组pET28a(+)-SjP14的E.coli BL21后,经SDS-PAGE分析表明其表达成功,分子量约为38 ku。Western blot鉴定结果表明纯化后的SjP14蛋白可被SjP14多克隆抗体识别。结论:成功表达并纯化了日本血吸虫P14基因产物,为下一步动物免疫保护性实验奠定了基础。     

日本血吸虫新基因——蛋白酶体激活因子PA28亚单位的发现与克隆

目的将用EST策略及同源性搜索发现的日本血吸虫新基因——蛋白酶体激活因子PA28亚单位（proteasome activatorPA28 subunit,PA28）cDNA克隆到表达质粒pET32a（+）上,为下一步对该基因进行功能研究做准备。方法将插入于pTrip1Ex2质粒上的cDNA进行测序,测序结果经BLASTx程序搜索,发现该插入cDNA序列所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白高度同源。根据表达质粒pET32a（+）上的克隆位点及该cDNA序列设计PCR引物,将PCR产物纯化后连接到pMD 18-T载体上,将重组T载体经EcoRI/XhoI双酶切后切下的SjPA28基因导入原核可溶性表达质粒pET32a（+）中。结果所发现的cDNA所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白的同一性达41％,PCR产物的片段长度与预期大小一致,重组T载体及表达质粒经EcoRI/XhoI双酶切后证明具有与目标片段长度相符的插入片段。结论本研究所发现的cDNA所编码的蛋白与小鼠肌肉内的PA28亚基蛋白高度同源,并且已成功地构建出重组表达质粒pET32a（+）-SjPA28。     

结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6基因测序质粒及真核表达重组质粒的构建

目的 构建结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT—6基因测序质粒及真核表达重组质粒，为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用PCR法对基因ESAT—6进行扩增，将扩增的产物连接于测序载体pUCm—T上，经测序反应确定无误，再将PCR反应产物经酶切后，克隆于真核表达载体pcDNA3．1( )上。结果 构建了结核杆菌基因ESAT—6的重组测序质粒，并对其进行了测序。真核表达重组质粒pcDNA3．1( )—ESAT—6亦构建成功。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT—6真核表达重组质粒的成功构建为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及相应抗原、抗体的制备打下基础。