噬菌体颗粒抗原与MHC-Ⅱ类分子的交叉递呈位于内质网囊泡

目的研究噬菌体呈现颗粒交叉递呈过程中,MHCⅠ抗原肽复合物在细胞内的形成部位,及其与MHCⅡ类分子阳性区域和内质网标志物阳性区域的关系。方法构建呈现OVA257264表位的噬菌体颗粒,大量制备此重组噬菌体颗粒。巨噬细胞与重组噬菌体颗粒共孵育后,使用抗MHCⅠ抗原肽复合物特异性单克隆抗体,观察巨噬细胞中MHCⅠ抗原肽复合物形成的部位。使用抗MHCⅡ类分子、内吞相关区域标志蛋白的单克隆抗体以及能显示内质网的特异性荧光染料,观察巨噬细胞内MHCⅠ抗原肽复合物和内吞相关区域及内质网的关系。结果成功构建了呈现OVA257264表位的噬菌体颗粒,纯化并鉴定了此噬菌体颗粒表达OVA257264表位的情况。共聚焦显微镜观察到MHCⅠ抗原肽复合物和MHCⅡ类分子阳性区域共聚,进一步染色发现此复合物位于转铁蛋白受体和LAMP1(晚期内体/溶酶体的表面标志物)阳性区域中,同时此区域呈现内质网标志蛋白阳性。结论重组噬菌体颗粒能在MHCⅡ类分子阳性、内体内质网标志物阳性的区域内完成交叉递呈。     

树突状细胞的移行与递呈抗原作用的实验研究

借助异硫氰酸荧光素的可显示性，将其作为抗原免疫ＣＢＡ小鼠，以观察树突状细胞的移行及其抗原递呈方式与功能。结果表明，经ＦＩＴＣ两次刺激后，移行至局部淋巴结的树突状细胞数明显高于对照组ＦＡＣＳ的分析结果亦表明，局中淋巴结内的树突状细胞荧光阳性率显著率高，且荥光显微镜观察呈现不均一的膜荧光。提示该细胞的抗原递呈方式为单纯膜结合型，而无内在化过程。ＣｏｎＡ刺激的淋巴细胞增殖反应及ＦＩＴＣ特异性刺激的细胞增     

树突状细胞的移行与递呈抗原作用的实验研究

借助异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）的可显示性，将其作为抗原免疫ＣＢＡ小鼠，以观察树突状细胞的移行及其抗原递呈方式与功能。结果表明，经ＦＩＴＣ两次刺激后（皮内），移行至局部淋巴结的树突状细胞数明显高于对照组（Ｐ＜０．０５）。ＦＡＣＳ的分析结果亦表明，局部淋巴结内的树突状细胞荧光阳性率显著增高，且荧光显微镜观察呈现不均一的膜荧光，提示该细胞的抗原递呈方式为单纯膜结合型，而无内在化过程。ＣｏｎＡ刺激的淋巴细胞增殖反应及ＦＩＴＣ特异性刺激的细胞增殖反应则分别体现了树突状细胞抗原递呈作用的后效应。     

朗格汉斯细胞特异性递呈在巨噬细胞亲和性人类免疫缺陷病毒感染中的作用

目的 观察巨噬细胞亲和性HIV经皮肤感染的细胞学机制,区别巨噬细胞亲和性及T细胞亲和性HIV感染的差异。方法 以基因枪转染AD8及NL43分子克隆至皮肤,流式细胞仪和荧光显微镜观察病毒在表皮细胞中的表达,磁分离术分离CD80^ 和CD80^-的游离细胞,进而以PCR和逆转录酶检测游走细胞中HIV对CD4^ T淋巴细胞的感染和表达。结果 AD8及NL43经基因枪直接转染皮肤后,表皮游走细胞皆显示HIV转染,可扩增到gag基因。只有AD8转染的游走细胞能进一步感染CD4^ T淋巴细胞,CD4^ T淋巴细胞可扩增到gag并表达逆转录酶;含NL43的游走细胞,不能感染CD4^ T淋巴细胞,不能扩增到gag,不能表达逆转录酶。AD8转染的1/2log稀释的CD80^ 细胞能够感染CD4^ T淋巴细胞。即使4次稀释后,仍能感染CD4^ T细胞,PCR扩增到gag并有大量逆转录酶表达,超过对照组的2-3倍。AD8转染的CD80^-细胞仅第1次稀释与CD4^ T细胞共孵可扩增到gag,仍可见逆转录酶表达。进一步稀释后不能扩增到gag。NL43转染的CD80^ 或CD80^-游走细胞与CD4^ T细胞共孵,皆不能扩增到gag,也无逆转录酶表达。结论 直接转染AD8的CD80^ 的游走表皮细胞能特异性地感染CD4^ T细胞。这种特异性不仅依赖于细胞表面HIV受体的亲和性结合,还依赖于转染AD8的CD80^ 细胞的特异性递呈和感染CD4^ T细胞。即使排除了受体因素,CD80^ 细胞也只递呈转染的AD8,而非NL43。所以病毒受体的特异性不是HIV感染的惟一原因。     

抗原递呈细胞在异基因造血干细胞移植中的研究进展

造血千细胞移植尤其是异体造血干细胞移植是恶性血液肿瘤的一种根治性治疗手段。然而移植物所引起的免疫反应不仅仅是移植物抗肿瘤（GVL）,移植物抗宿主反应（GVHD）往往也同时出现。因此,如何能使移植病人减少威胁生命的GVHD而又提高GVL效应,达到治疗恶性肿瘤目的,是当前急需解决的一项重要研究课题。到目前为止,人们仍不完全清楚GVHD和GVL的确切机制,但均认为与供者来源的T细胞、NK细胞,受体及供体来源的抗原递呈细胞（APC）,如树突状细胞（DC）以及与它们所分泌的细胞因子有关。近年来APC的基础和应用研究受到了众多研究者的重视,作者对APC在移植中的研究进展综述如下。     

硒增强细胞免疫的研究——Ⅲ.硒通过增强抗原递呈促进迟发超敏反应

硒处理小鼠能提高小鼠对致敏剂三硝基氯苯(TNCB)诱发的迟发超敏反应(DTH)的敏感性。体外实验证明,经硒处理的小鼠脾脏粘附细胞向TNCB致敏的T淋巴细胞递呈半抗原三硝基苯基进而刺激T细胞增殖反应的能力,即抗原递呈功能比未处理的对照强。正常小鼠的脾脏粘附细胞在体外经硒处理后,其递呈抗原的能力更强。提示硒通过加强抗原递呈细胞的功能实现促进DTH反应。     

B淋巴细胞对卡介苗颗粒性抗原的递呈作用

作者通过体外试验,将分离纯化的人外周血B细胞先与卡介苗(BCG)共育,成为激发的B细胞,再与建立的对BCG具特异性的T细胞株细胞混合培养,在无单核巨噬细胞存在的情况下,检测B细胞对颗粒性抗原的递呈效应。结果显示,6％的B细胞与BCG共育24小时后,胞浆中可见有BCG菌体,48小时后菌体界限模糊;激发的B细胞能明显地刺激T细胞株出现增殖反应及产生IL-2,但可被氯奎所抑制。表明B细胞对颗粒性抗原有递呈给T细胞,使之有激活作用。     

胶原抗原肽表位诱导的耐受性抗原递呈细胞对大鼠类风湿关节炎的治疗作用

目的:观察抗原肽表位(CTE)1和CTE2诱导、TGF-β2刺激的抗原递呈细胞(APC)对大鼠类风湿关节炎的疗效.方法:雌性Wistar大鼠32只,分为关节炎组、免疫性细胞组、耐受性细胞组和正常对照组,每组8只.关节炎、免疫性细胞和耐受性细胞组大鼠使用鸡Ⅱ型胶原(CⅡ)加完全福氏佐剂诱导CIA后,分别静脉注射免疫性APC、耐受性APC和Hanks平衡盐溶液(HBSS),1周后观察大鼠关节炎指数,1月后检测外周血血清中抗CⅡ抗体吸光度(A)值,流式细胞仪检测各组大鼠外周血CD4+T细胞中Th1和Th2细胞比例.结果:各组大鼠关节炎指数、外周血抗CⅡ抗体A值和Th1型/Th2型CD4+T细胞比率比较,差异均有统计学意义(F=20.911、22.498和10.775,P＜0.001);耐受性细胞、免疫性细胞和关节炎组较正常对照组升高(P＜0.05),耐受性细胞组较免疫性细胞和关节炎组降低(P＜0.05).结论:CTE1和CTE2诱导、TGF-β2 刺激的APC对大鼠类风湿关节炎有抑制作用.     

荧光蛋白在肿瘤分子影像研究中的应用

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是在水母中发现的新型报告分子,该蛋白及其衍生物能在多种生物体内表达并发出荧光,是目前在生物学中研究和开发应用得最广泛的蛋白质之一。尤其是在肿瘤的研究中,荧光蛋白的分子影像可为深入揭示肿瘤发生发展的病理过程的机制,以及对其治疗进行实时、动态、细致、无创、靶向性的探测和跟踪提供有效手段。     

pBR002-HLA-DRB1*0803转基因载体构建、表达及其抗原递呈功能研究

目的 构建可以表达人类HLA-DRB1*0803的转基因载体,并在细胞水平验证其表达及抗原递呈功能.方法 提取人WATANABE细胞株(基因型为HLA-DRB1 *0803纯合子)的总RNA,RTPCR扩增DRB1*0803基因片段,与小鼠Eα promoter和兔β-globin基因内含子序列同时导入pBR002-lacz载体.pBR002-HLA-DRB1*0803转基因载体转染小鼠DCS细胞和B细胞系,用Western blot和免疫荧光的方法对HLA-DRB1蛋白进行检测.流式细胞术检测转染小鼠DCS细胞对HBcAg特异性CD4+T细胞的刺激和极化效应.结果 经双酶切和测序验证,成功构建了pBR002-HLA-DRB1*0803转基因载体;转染载体后的小鼠DCS细胞和B细胞系均表达出了大小约为29×103的HLA-DRB1蛋白;免疫荧光结果表明HLA-DRB1蛋白主要表达于细胞质内.转染后的小鼠DCS细胞可将负载的HBcAg递呈给HLA-DRB1 *0803阳性基因型的人CD4+T细胞,产生明显的CD4+T细胞应答.结论 成功构建了HLA-DRB1 *0803转基因载体,该载体可以在细胞水平特异性表达HLA-DRB1蛋白,并具有HLA-DRB1*0803特异性抗原递呈功能.     

HSP65-MUC1／HSP65抗体免疫复合物对人树突状细胞的活化作用

目的：探讨免疫复合物能否诱导树突状细胞的活化与成熟。 方法：用免疫复合物刺激来自人外周血经细胞因子IL-4和GM-CSF诱导的未成熟的树突状细胞, 观察免疫复合物对未成熟树突状细胞的活化与成熟的影响。 结果：HSP65-MUC1/HSP65免疫复合物与HSP65-MUC1抗原或HSP65抗体相比较,能够显著地活化树突状细胞,使其表面的协同刺激分子CD86的表达显著上调,为激活细胞毒性T淋巴细胞提供第二信号,这一结果说明免疫复合物具有交叉递呈的作用;同时,加入免疫复合物的树突状细胞培养上清中IL-6和TNFα分泌量明显增加。结论： 免疫复合物能够诱导树突状细胞的活化与成熟,免疫复合物具有交叉递呈的作用。     

鼠疫耶尔森氏菌 YopD 抗原基因在大肠杆菌中的克隆表达

目的：利用 DNA 重组技术,在大肠杆菌中获得融合表达的鼠疫耶尔森氏菌 YopD 抗原基因。方法根据查找文献及基因比对选取了鼠疫菌重要功能蛋白-YopD 蛋白。利用分子克隆技术克隆后,在原核系统中进行表达。根据云南玉龙菌株（D106004）全基因组序列设计引物,PCR 扩增目的基因片段。采用 pET-32a（＋）作为表达载体,通过双酶切和连接反应,将目的基因片段定向插入载体中,构建重组表达质粒。IPTG 诱导,使重组质粒在其宿主菌 E ．coli BL21（DE3）中表达。结果在大肠杆菌中成功获得了融合表达蛋白,即重组 YopD 蛋白。结论以质粒 pET-32a（＋）作为表达载体,鼠疫菌重要功能蛋白 YopD 能够在大肠杆菌 E ．coli BL21（DE3）中稳定高效地表达,为鼠疫潜在诊断靶点及新型疫苗选择的可能性奠定了基础。     

大肠埃希菌提取物和LPS对单核巨噬细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨不同浓度大肠埃希菌提取物（菌胞质蛋白）对单核细胞增殖和凋亡的影响。方法采用MTT法测定不同浓度的胞质蛋白和LPS作用72 h后,对U937细胞的细胞抑制率,并用流式细胞术检测胞质蛋白作用24 h U937细胞凋亡率。结果大肠埃希菌胞质蛋白对U937细胞增殖有显著抑制作用,并可诱导细胞凋亡。低浓度的LPS不能抑制U937细胞增殖,高浓度LPS可以明显抑制U937细胞增殖。结论大肠埃希菌提取物对单核巨噬细胞有显著的增殖抑制和诱导凋亡作用。     

结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的高效表达

目的 通过结核分支杆菌Ag85B蛋白编码基因在大肠杆菌中稳定表达，以获得大量纯化的Ag85B蛋白。方法 采用DNA重组技术构建结核分支杆菌Ag85B基因的表达载体，双酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定重组子，阳性重组子转化大肠杆菌，并诱导表达外源蛋白。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中的表达，对染色的凝胶扫描，以测定目的蛋白表达水平。结果 菌体蛋白经SDSPAGE，含阳性重组质粒的菌体蛋白中出现一条新蛋白带，表达量占菌体总蛋白的33％～38％。Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中表达方式主要是包涵体形式。结论 构建的大肠杆菌重组体能高效表达结核分支杆菌Ag85B蛋白抗原。     

致病性大肠杆菌和出血性大肠杆菌的研究进展

致病性大肠杆菌(EPEC)是导致婴幼儿腹泻的主要病原菌，特别在发展中国家。近期研究表明，EPEC病原与宿主细胞的作用可视为三个阶段。第一阶段，局限性的粘附在上皮细胞；第二阶段，产生分泌蛋白：第三个阶段，紧密粘附和受体蛋白的作用。一些出血性大肠杆菌侵袭人的肠上皮细胞也靠粘附和损伤作用。     

泡球蚴18基因的克隆、原核表达质粒的构建及其初步表达的研究

目的：克隆、分析泡球蚴18(Em18)抗原基因,构建pET41a-Em18原核表达质粒．并初步诱导表达Em18重组蛋白。方法：DNAman软件设计引物．RT-PCR法克隆Em18 cDNA并构建pMD18-T／Em18质粒，测序确定序列，利用DNAman和BLAST软件．对其进行基因序列分析。构建pET41a-Em18原核表达质粒，测序鉴定插入序列正确性。IPTG初步诱导和表达rEm18-GST重组蛋白。SDS-PAGE电泳检测。结果：测序结果显示Em18抗原基因长度为486bp，编码161个氨基酸。BLAST比对分析表明为一新序列并被GenBank收录(AY513691)。构建的pET41a-Em18原核表达质粒．经IPTG诱导后．SDS-PAGE检测表明rEm18-GST重组蛋白得到成功表达，在相对分子量为50KDa处有表达条带。结论：成功克隆并构建了pET41a-Em18原核表达质粒．初步诱导表达出rEm18-GST重组蛋白，为新一代包虫病诊断试剂盒的研制莫定基础。     

中药复方肺瘤平膏对树突状细胞功能影响的拆方研究

目的观察肺瘤平膏及其拆方干预体外培养体系中树突状细胞(DC)抗原递呈功能的作用并探讨其分子机制。方法建立体外人外周血单个核细胞(PBMC)诱导分化成熟DC的诱导培养体系,从健康人外周血中分离获得PBMC,采用多种细胞因子(TNFα、IL-4、GM-CSF)联合诱导,获得了分化与功能相对成熟的DC,用流式细胞仪检测肺瘤平膏及其拆方含药血清干预DC与抗原递呈功能相关表面分子表达,及其对DC分泌IL-12含量的影响,进行初步研究。结果肺瘤平膏可上调DC与抗原递呈功能相关膜分子MHC-Ⅱ、CD80、CD83、CD86及CD40的表达,并促进DC分泌IL-12含量。结论肺瘤平膏能够调节DC抗原递呈功能,提高机体的抗肿瘤免疫监视功能。     

大肠杆菌感染对人巨噬细胞系U937凋亡的影响

目的：探讨大肠杆菌（E.coli）感染与人巨噬细胞系U937细胞凋亡的关系.方法：以Annexin V FITC/PI双染流式细胞仪检测及Hoechst 33258荧光染色,Giemsa染色等细胞形态学观察为指标,研究E.coli感染对U937细胞凋亡的诱导作用.结果：Giemsa染色：E.coli感染10,20 min（U937：E.coli=1：20）后偶见细胞凋亡,感染30,60及90min时可见许多细胞有典型的凋亡形态学改变,并可见凋亡小体;Annexin V FITC/PI双染可见U937细胞凋亡百分率随E.coli感染时间的延长而增高.感染30,60及90min时,细胞凋亡率与对照组相比明显增高,有显著性差异（P＜0.001）.Hoechst 33258荧光染色结果表明当细胞与细菌浓度比较低时（1：10）即可引起部分U937细胞发生凋亡,U937细胞凋亡百分率随E.coli感染剂量的增加而增加,且Hoechst 33258荧光染色及流式细胞仪二种方法所得结果一致.结论：E.coli以时间和剂量依赖方式诱导U937细胞凋亡.     

CEA-rV对巨噬细胞抗原提呈功能的影响

目的：探讨CEA－rV对巨噬细胞抗原提呈功能的影响。方法：采用混合淋巴细胞反应（MLR）检测MΦ的抗原提呈功能，采用流式细胞仪（FCM0检测MΦ表面分子MHC－I（H－2K^b),MHC-II(I-A^b)及B7（B7－2）的表达，采用荧光抗体直接染色法检测肿瘤细胞表达H－2K^b,I-A^b的表达。结果：CEA－rV接种小鼠腹腔MΦ组（CEA－rVMΦ组）T细胞分泌IL－2的水平较W－VV及NS组显增强（P＜0．01），小鼠腹腔MΦ自身表达的I－Ab和B7－2分子较低（分别为41．7％，13．7％），接种W－VV后其I－A^b及B7－2分子表达改变不明显（分别为44．3％和15．1％），而接种CEA－rV后其I－Ab及B7－2分子表达明显增强（分别为87．2％，39．5％），各组CEA阳性肿瘤细胞表面分子MHC－I强表达，却没有MHC－II表达，结论：CEA－rV腹腔接种MΦ可使MΦ抗原提呈功能显增强，MΦ的表达分子MHC－II与B7－2表达增强可能是其抗原提呈功能增强的主要原因，提示MHC－II与B7－2可能在CEA－rV抗瘤中发挥重要作用。     

转染SEA基因肝癌细胞中SEA和抗原呈递相关分子的表达

目的:检测转染SEA基因的BEL-7402肝癌细胞(SEA-肝癌细胞)中,SEA蛋白和抗原呈递相关分子的表达情况.方法:免疫组化检测SEA蛋白在SEA-肝癌细胞中的表达情况,流式细胞仪检测SEA-肝癌细胞HLA-ABC、HLA-DR、CD54、CD80和CD86的表达情况,并与BEL-7402肝癌细胞进行对照.结果:SEA-肝癌细胞经过多次冻存复苏和传代培养,可稳定表达SEA蛋白;BEL-7402肝癌细胞和SEA-肝癌细胞高表达HLA-ABC,部分表达CD54,基本不表达HLA-DR、CD80和CD86,SEA-肝癌细胞表面CD54表达率高于BEL-7402肝癌细胞(P＜0.01).结论:SEA-肝癌细胞经过多次冻存复苏和传代培养,仍能够稳定表达SEA蛋白,SEA-肝癌细胞表面CD54表达水平高于BEL-7402肝癌细胞.