弓形虫SAG1、SAG3基因的克隆和复合基因SAG1/SAG3真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫表面抗原SAG1、SAG3复合基因的真核表达重组质粒,为弓形虫疫苗的研制作准备。方法提取弓形虫基因组DNA;用PCR技术扩增出表面抗原SAG1、SAG3的基因,再分别重组入pGEM-T克隆载体;将pGEM-SAG1和pGEM-SAG3重组质粒分别经酶切、纯化后定向亚克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体,经PCR、酶切及测序等方法对重组子进行鉴定。结果从弓形虫基因组DNA中扩增出SAG1、SAG3基因;构建了pGEM-SAG1、pGEM-SAG3克隆质粒;成功构建pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3真核表达复合基因质粒,测序表明目的基因定向正确连接。结论构建了pcDNA3.1(+)-SAG1-SAG3复合基因表达质粒,为今后研制弓形虫复合多价疫苗提供候选抗原奠定了实验基础。     

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因的克隆与序列分析

目的：克隆并分析我国刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶（NTPase）的编码基因。方法：采用聚合酶链反应（PCR）扩增弓形虫RH株的NTPase基因,克隆入pGEM-TEasy载体,转化后挑取阳性克隆进行酶切与测序鉴定,并对获得的NTPase基因及推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果：PCR扩增得到特异的弓形虫NTPase基因序列,测序结果表明,获得的弓形虫NTPase-Ⅱ基因全长1812bp,编码的603个氨基酸与Genebank报道的氨基酸序列同源性为100%。经DNAStar预测NTPase-Ⅱ存在6个潜在抗原表位。结论：成功克隆出序列正确的弓形虫NTPase-Ⅱ基因,为其相关研究奠定了基础。     

人纤溶酶真核表达重组质粒的构建

目的：构建人纤溶酶真核表达载体以用于抗栓、溶栓的研究。方法：人胎肝组织经PCR技术扩增人纤溶酶基因,定向克隆至真核表达质粒pC-DNA-3后测序。经测序鉴定正确后构建人纤溶酶真核表达重组质粒,利用PCR和酶切方法鉴定重组真核表达质粒的正确性。结果：目的基因 PCR扩增产物为1 740 bp,测序结果显示,目的基因PCR扩增产物与GenBank登记的序列完全相同。PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的人纤溶
酶基因全长序列。结论：成功构建了含有人纤溶酶基因的真核表达重组质粒,并进行了鉴定。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的　构建弓形虫棒状体蛋白2（POP2）基因真核表达重组质粒。方法　根据ROP2基因已知序列,设计合成一对引物,上、下游引物分别引入EcoRI、SalI酶切位点,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段,插入pGEX-4T-1质粒,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2,而后经EcoR　I、Not　I双酶切出ROP2基因片段,再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果　ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论　在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2,为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）基因真核表达重组质粒，方法 根据ROP2基因已知序列，设计合成一对引物，上，下游引物分别引入EcoRI,SalI酶切位点，用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段，插入pGEX-4T-1质粒，构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2，而后经EcoRI,NotI双酶切除ROP2基因片段，再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp，重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子，克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2。为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

hTERT片段真核表达质粒的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒,方法：从肿瘤组织中提取总RNA．采用RT—PCR法扩增hTERT基因并克隆人PGEM—T Easy载体中,然后再亚克隆于pcDNA3．1真核表达载体,用PCR扩增及限制性酶切法筛选重组真核表达质粒,并以DNA测序鉴定。结果：PCR扩增及限制性酶切法证实重组真核表达质粒的构建成功。测序表明,hTERT基因片段与GenBank公布的相应基因同源性比较,核苷酸序列的同源性为98．73％,氨基酸序列的同源性为99．68％。结论：成功构建了hTERT真核表达质粒,为进一步研究与hTERT相关的抗肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

新型基因佐剂SPreS2真核表达载体的构建及其瞬时表达

目的 构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2作为基因佐剂,用以增强或调节弓形虫DNA疫苗的体液及细胞免疫效果。方法 采用重叠延伸PCR技术,扩增乙肝病毒表面抗原S和PreS2基因,引入编码GSGSGS柔性多肽序列作为接头拼接S和PreS2基因,构建重组克隆载体pMD18T-SPreS2和重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,分别进行PCR、酶切和测序鉴定;脂质体法将重组载体pVAX1 SPreS2转染人成纤维细胞,建立体外真核细胞瞬时表达系统,SDS-PAGE和Western blot检测重组载体转染HFF细胞瞬时表达状况及其表达产物的免疫活性。结果 PCR、酶切、测序结果表明,重组克隆载体pMD18T SPreS2和重组真核表达载体pVAX1 SPreS2正确构建,融合基因SPreS2在真核细胞中可以瞬时表达,其表达产物具有一定的免疫活性。结论 成功构建重组真核表达载体pVAX1-SPreS2,为增强或调节弓形虫DNA疫苗免疫效果提供一种新型基因佐剂。     

人酸性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人酸性成纤维细胞生长因子真核表达载体pEGFP-N1-haFGF。方法 PCR扩增人酸性成纤维细胞生长因子（haFGF）基因,BglⅡ和HindⅢ双酶切后克隆入真核表达载体pEGFP-N1,构建haFGF真核表达载体pEGFP-N1-haFGF,并经限制性酶谱分析和DNA测序对重组表达载体的正确性进行鉴定。结果重组真核基因表达载体pEGFP-N1-haFGF经限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ酶切,DNA电泳显示465 bp的haFGF目的片段和4 700 bp的pEGFP-N1载体片段,重组载体经DNA测序显示所克隆的haFGF基因核苷酸顺序与Genbank中记载的haFGF序列一致。结论本实验成功构建人酸性成纤维细胞生长因子真核表达载体,为进一步研究haFGF的功能奠定基础。     

人肝细胞癌抗原HCA661 DNA疫苗的构建

目的：构建人肝细胞癌特异性抗原HCA661的DNA疫苗。方法：通过PCR从SMMC7721中获得编码肝细胞癌特异抗原HCA661的基因组DNA序列,插入pGEM-T easy载体后测序,并将目的基因定向亚克隆进入真核表达载体pCI-neo,以PCR和酶切方法鉴定构建的重组真核表达质粒pCI-neo-HCA661。结果：PCR产物为 1 040 bp,测序结果与Gene Bank登记完全相同;PCR和酶切结果表明,构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的目的基因片段。结论：成功地构建了含有HCA661基因的DNA疫苗。     

人类p27kip1基因正、反义真核表达质粒的构建

目的：克隆人类p27^kip1基因，构建其正、反义真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术，从人类伯基特淋巴瘤细胞株Raji中扩增出人类p27^kip1 cDNA全长序列，通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3．1真核表达载体上，构建p27^kip1正、反义表达质粒。通过酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组表达质粒进行鉴定。结果：通过酶切鉴定及测序分析证实，本实验构建的重组表达质粒目的基因片段为人类p27^kip1 cDNA。结论：本实验成功地克隆了人类p27kipl基因并构建了其正、反义真核表达质粒，为进一步研究p27^kip1在淋巴瘤发生中的意义奠定了基础。     

真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的：构建含MAGE—1基因的重组真核表达质粒。方法：用RT—PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列，克隆至pGEM—T载体，测序证实基因碱基序列无误后，再克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，构建了pcDNA3.1—MAGE—1重组质粒。结果与结论：RT—PCR获得长度为927bp的阳性产物，经T载体和pcDNA3.1( )真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后。证实真核表达质粒pcDNA3．1—MAGE—1构建成功。     

小鼠α1,3-半乳糖基转移酶基因的克隆及其重组真核表达载体的构建

目的：构建α1,3-半乳糖基转移酶的重组真核表达质粒pcDNA3.1/V5-HisAα1,3GT,为进一步利用其进行胃癌的基因治疗奠定基础。方法：从BALB／c小鼠腹腔巨噬细胞中提取总RNA，行RT－PCR扩增出编码α1,3-半乳糖基转移酶的全长cDNA，并克隆入pUCm-T测序载体。经DNA测序证实序列无误后，将α1,3-半乳糖基转移酶基因片段亚克隆入pcDNA3.1/V5-HisA真核表达载体。结果：经RT－PCR扩增出大小约为1．2kb的基因片段，成功克隆入pUCm-T载体。经DNA测序证实为α1,3-半乳糖基转移酶（α1,3-galactosyltransferase,3GT），大小为1221bp，编码序列及读框均正确。经亚克隆酶切鉴定，获得携有α1,3GT基因的重组质粒pcNDA3.1/V5-HisAα1,3GT。结论：成功地构建α1,3GT真核表达载体，为进行肿瘤基因治疗奠定了基础。     

人组织激肽释放酶基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定人组织激肽释放酶基(h-TKK)基因真核表达质粒。方法 设计含pnI和BamH Ⅰ酶切住点的人组织激肤释放酶基因引物，采用PCR法从原核pBluescripe Ⅱ KSKK( )中扩增KKcDNA片段，亚克隆至padtrack-CMV真核表达裁体，转化感受态大肠杆菌DHl0B，酶切鉴定阳性重组子，并进行序列测定。结果经 PCR能扩增出738bp的片段，与预期片段大小相符，构建的重组体经酶切鉴定能切出插入片段，测序结果与预期序列完全一致。结论 成功构建了人组织激肽释放酶基因真核表达重组体pAdtrack-CMV KK。     

pBiG-CAR真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建及鉴定pBiG-CAR真核表达载体.方法 提取C57BL/6胎鼠总RNA,逆转录合成cDNA,经PCR扩增获得CAR基因,与双酶切的pBlue质粒连接,经转化、蓝白筛选及测序鉴定pBlue-CAR载体构建成功.扩增pBlue-CAR的CAR基因,经双酶切后与pBiG质粒连接,构建pBiG-CAR真核表达载体.结果 经琼脂糖凝胶电泳,获得目的基因CAR条带,pBlue-CAR目标条带及pBiG-CAR目标条带.基因测序证实所检测重组质粒序列与pBiG-CAR序列完全一致.结论 克隆C57BL/6鼠CAR基因、pBlue-CAR重组质粒的构建获得成功,并初步证实pBiG-CAR真核表达载体的构建获得成功,为进一步构建可控心肌特异性CAR过表达转基因鼠提供基础.     

结核杆菌HSP70真核表达载体的构建

目的：构建结核杆菌HSP70重组真核表达质粒。方法：用PCR方法从结核杆菌H37RV基因组中扩增出结核杆菌HSP70基因DNA序列,应用T－A克隆技术,克隆到质粒GPEM－G vector, 经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到真核表达质粒PCDNA3．1（＋）,构建成PCDNA3．1－HSP70重组质粒。结果：经酶切鉴定,证实重组质粒构建正确。结论：结核杆菌HSP70真核表达载体构建成功。     

重组突变型DNA聚合酶β表达载体pcDNA3.1—polβ的构建

目的：构建含突变型polβ基因重组表达载体。方法：从食管癌标本中提取总RNA,反转录合成cDNA,克隆入pCDNA3．1质粒。以通用鉴定引物PCR扩增、小量提取质粒酶切鉴定重组质粒,并进行测序。结果：测序结果证实重组载体中的外源片段序列与所选取的标本完全相符。结论：成功构建了含突变型polβ基因重组表达载体,可应用于下游研究。     

果蝇成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体cDNA克隆及其载体的构建

目的克隆果蝇成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体(FGFR-1)全长基因序列,构建其真核表达载体pdFR1。方法采用PCR方法扩增果蝇FGFR-1基因全长序列,克隆人载体pT—Adv,转化大肠杆菌XL1-Blue,挑选白色菌落行酶切鉴定及测序。重组质粒pT—Adv／FGFR-1酶切,回收目的基因片段,将其克隆人真核表达载体pcDNA3．1( )中,命名为pdFR1,挑选白色菌落行酶切鉴定。结果pT-Adv／FGFR-1测序结果与GenBank完全一致,pdFR1行限制性内切酶酶切,酶切片段与预期值相符。结论克隆了果蝇成纤维细胞生长因子Ⅰ型受体全长基因序列,构建了其真核表达载体pdFR1,为完善异种分子疫苗免疫理论莫定基础。     

紧密连接蛋白claudin-1和claudin-2表达载体的构建

目的：为进一步研究紧密连接蛋白claudin-1和claudin-2在结肠直肠癌中的作用,分别构建包含claudin-1和claudin-2基因编码区的重组质粒,并在人类结肠癌细胞株T84中表达。方法：从T84细胞中提取总RNA,反转录PCR获得cDNA,插入pCRⅡ-TOPO质粒中测序鉴定。将测序正确的cDNA连接入pcDNA3.1（-）表达载体,进一步测序鉴定后转染入T84细胞,并采用反转录荧光定量实时PCR技术及Western blot技术检测重组质粒在T84细胞中的表达。结果：重组质粒经限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列分析,显示所克隆的DNA分子大小及序列正确。经重组质粒转染的T84细胞能大量稳定地表达目标蛋白。结论：本研究成功地构建了claudin-1/pcDNA3.1（-）和claudin-2/pcDNA3.1（-）重组表达质粒,并能在结肠癌细胞中稳定表达。