水凝胶与陶瓷化骨及β-磷酸三钙复合对骨髓基质细胞成骨能力的影响

目的：观察水凝胶（hydrogel，HG）分别与陶瓷化骨（ceramic bovine bone，CBB）、β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）复合成的复合材料对骨髓基质细胞（MSCs）的生长、分化的影响，寻找更适合骨组织工程的复合物支架材料。方法：将诱导的骨髓基质细胞接种于CBB/HG、β-TCP/HG上，另外MSCs分别接种于单纯的CBB、β-TCP上作为对照，进行体外培养。5、10d取材，细胞计数观察贴附及增殖情况，扫描电镜观察细胞形态以及材料的贴附情况，检测碱性磷酸酶的活性以及免疫组织化学方法检测Ⅰ型胶原的分泌情况。结果：骨髓基质细胞与各组材料均能形态良好贴附，两种复合材料上贴附的细胞数量明显高于对照组，CBB/HG、β-TCP/HG两组间细胞的碱性磷酸酶的活性以及Ⅰ型胶原的分泌量无明显差别，但显著高于对照组。结论：CBB/HG、β-TCP/HG均能促进骨髓基质细胞分化及基质分泌，是一良好的组织工程骨构建复合材料。     

陶瓷化骨对人牙囊细胞分化的影响

目的:培养人牙囊细胞(DFCs),观察陶瓷化骨(CBB)对人牙囊细胞生长和分化的影响.方法:体外分离胚胎期人DFCs,将第三代细胞以CBB为载体立体培养,以平面接种为对照组,用矿化液持续诱导,利用光镜观察细胞生长状态、免疫组织化学观察细胞矿化基质牙骨质附着蛋白(CAP,)及骨涎蛋白抗体(BSP)分泌、Vokassa染色观察矿化情况,了解CBB对DFCs生物学行为的影响.结果:体外连续诱导28 d,实验组光镜下可见DFCs与CBB相容性好,材料周边细胞生长密集,并有向BBC趋化迁移现象,附近细胞聚集,形成Vokassa染色阳性的矿化结节,免疫组织化学染色BSP,CAP阳性着色,部分细胞强阳性着色.对照组细胞复层生长,未形成矿化结节,免疫组织化学染色BSP,CAP阴性着色.结论:体外培养条件下,CBB可诱导人DFCs向成骨和成牙骨质细胞分化.     

骨髓间充质干细胞与支架材料nHA/PA66复合培养的生物活性研究

目的：研究骨髓间充质干细胞与支架材料-纳米羟基磷灰石/聚酰胺66（nHA/PA66）复合培养时生物学特性。方法：体外培养兔骨髓间充质干细胞（MSCs）,并分为A、B、C、D四组。A组为对照;B组和D组进行骨向诱导;同时,C组和D组细胞与nHA/PA66复合培养。应用MTT实验、碱性磷酸酶（ALP）染色和生物化学分析、扫描电镜,分别对各组细胞的增殖速度、ALP活性及细胞在支架上的黏附情况进行检测。结果：MTT结果显示,A组细胞增殖曲线与C组相似,而B组和D组相似;A组和C组细胞增殖略高于B组和D组。结果表明,骨向诱导可使细胞增殖轻微下降,而与支架材料复合培养对MSCs增殖无影响。ALP染色及ALP活性生化分析进一步表明,MSCs与支架材料复合培养对其骨向分化能力无影响。SEM观察则表明,C组细胞和D组细胞与支架材料均粘附良好。结论：nHA/PA66适于MSCs的黏附、增殖及骨向分化,是一种极具价值的骨组织工程支架材料。     

牙乳头/牙囊细胞交互作用对细胞多能性的作用

目的:研究细胞交互作用对细胞多能性的调控作用。方法:建立牙乳头(DPCs)和牙囊细胞(DFCs)体外共培养模型,二者单独培养的细胞为对照组。采用细胞计数、β-gal染色检测细胞生长和衰老情况;免疫荧光染色检测共培养条件下多能性相关因子Oct-4、Sox2和c-Myc的表达变化;通过ALP活性测试检测矿化诱导后的DPCs和DFCs的矿化能力。结果:共培养组的DPCs和DFCs的细胞数明显高于对照组(P<0.05);培养至第7代时,共培养组的DPCs、DFCs中与衰老相关的SA-b-gal表达较对照组明显减弱(P<0.05);Oct-4、Sox2和c-Myc在共培养组DPCs和DFCs中的表达明显强于对照组;共培养组的DPCs和DFCs经矿化诱导14、21 d后,其ALP活性均显著高于对照组(P<0.05)。结论:DPCs和DFCs可通过体外交互作用抑制细胞衰老、促进细胞的多能性相关因子的表达、提高细胞的矿化能力。     

一种新型纳米羟基磷灰石材料应用于牙周组织工程的可行性研究

目的:对一种新型纳米羟基磷灰石材料 -纳米羟晶 -胶原仿生骨材料 (nHAC)进行细胞相容性和细胞毒性的研究,以初步探讨其应用于牙周组织工程的可行性。方法:将体外培养的人牙周膜细胞(PDLCs)接种于nHAC三维支架上复合培养,采用细胞计数和扫描电镜观察PDLCs在nHAC支架上的附着、生长情况,并通过MTT测试法和碱性磷酸酶(ALP)活性检测法研究nHAC浸提液对PDLCs增殖和功能表达的影响。结果:人PDLCs在nHAC支架上形成良好贴附并增殖,扫描电镜可见nHAC具有良好的多孔网状结构,细胞在nHAC上生长旺盛,伸展充分,而PDLCs在不同浓度的材料浸提液中的生长、增殖及ALP活性与空白对照组相比无显著性差异。结论:nHAC具有良好的三维空间结构和细胞相容性,且无细胞毒性,有望成为牙周组织工程的支架材料。     

载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞构建组织工程骨的实验研究

目的：探讨载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells)构建组织工程骨的可行性,并筛选辛伐他汀的有效载药量。方法：采用溶剂浇铸—粒子沥滤技术结合相分离法,制备不同浓度(辛伐他汀质量分别为0.1、0.5、1 mg)的载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料,扫描电镜观察孔隙率,绘制药物释放曲线;茜素红染色、I型胶原染色观察成骨诱导液和辛伐他汀对骨髓基质干细胞向成骨分化的作用;将第3代BMSCs经dil染色后,接种于不同浓度的复合支架材料上,扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察细胞在支架上的黏附情况,CCK-8和碱性磷酸酶(ALP)检测对其增殖和分化作用;采用SPSS 18.0软件包对数据进行统计学分析。结果：支架材料孔隙率达90%以上,孔径平均200~300 μm,载药组药物持续缓慢释放,未见药物突释现象;经辛伐他汀和成骨诱导组I型胶原表达阳性,茜素红染色可见明显钙结节;4组支架材料与细胞黏附性较好,0.5 mg组细胞生长状态最佳。CCK-8和ALP检测0.5 mg组能够明显促进细胞的增殖和分化。结论：辛伐他汀和成骨诱导液联合利用,能够更有效地促进BMSCs向成骨分化;载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料是理想的组织工程支架材料;载0.5 mg辛伐他汀PLGA/CPC支架材料能够有效促进BMSCs的增殖和分化。     

磷酸钙骨水泥胶原支架复合P物质对大鼠骨髓间充质干细胞特性影响研究

目的    因各种原因导致的牙槽骨甚至颌骨的缺损、缺失在临床上十分常见,对患者口腔功能和美观均可造成严重影响。磷酸钙骨水泥（CPC）是公认的具有良好生物相容性的可降解骨移植材料,与Ⅰ型胶原混合后可塑性增强,孔隙率增加且弹性模量更接近于人体骨。本研究通过人工合成神经递质P物质（SP）结合于CPC胶原支架材料,体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,观察材料表面形貌及对BMSCs生物学行为的影响。方法     2015年9月至2016年1月在第四军医大学口腔医院选取4周龄雌性大鼠20只,进行BMSCs体外培养。研究材料分为3组,A组：纯CPC组;B组：CPC＋Ⅰ型胶原组;C组：CPC＋Ⅰ型胶原＋SP组。扫描电镜（SEM）观察样本表面形貌及BMSCs形态、黏附与增殖。通过测定细胞增殖对数、成骨及成脂诱导对BMSCs进行鉴定,荧光染色定量分析BMSCs的黏附与增殖,成骨诱导液培养14 d后经茜素红染色,并通过碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测细胞ALP活性。结果    原代BMSCs生长旺盛,生长曲线呈典型“S”形。成骨和成脂诱导液培养3周,行茜素红和油红O染色,镜下可见钙化结节及脂滴形成,BMSCs多向分化能力良好。SEM下B、C 组可见胶原与CPC联结紧密,胶原表面呈条索样间隙,表面BMSCs细胞与胶原附着数量多,突触长并彼此相联,细胞伸展良好。荧光显微镜下观察,C组表面活性细胞比例高于A、B 组。成骨诱导14 d后茜素红染色,肉眼观C组颜色较深,ALP检测C组BMSCs的ALP表达高于A、B 2组（P＜0.05）。结论    本研究构建的SP加载的CPC胶原复合材料支架对SD大鼠BMSCs的黏附、增殖和成骨分化均具有促进作用,为今后临床牙槽外科修复重建工作提供了新的思路方法和研究基础。     

Beagle犬骨髓基质细胞复合A-PCPC裸鼠皮下成骨的实验研究

目的:观察支架材料活性磷酸钙骨水泥(active porous calcium phosphate cement,A-PCPC)及其与Beagle犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)复合体在裸鼠体内的成骨性能.方法:抽取Beagle犬骨髓,体外分离培养、成骨诱导、扩增BMSCs并通过细胞化学方法检测其成骨表型.体外构建BMSCs/A-PCPC复合体,并行扫描电镜超微结构观察.将复合体植于裸鼠背部皮下,同期植入单纯A-PCPC作为对照组.术后2、4、8周取材,HE染色,进行组织学及组织形态计量学分析.结果:ALP染色阳性,Von Kossa染色可见钙结节形成.扫描电镜可见细胞贴附于材料表面及孔隙表面生长.HE染色显示,2周时,复合体组可见少量编织骨,单纯材料组成骨较少.4周时,复合体组可见编织骨向小梁骨转化,单纯材料组可见大量骨样组织.8周时,复合体组新骨趋于成熟,单纯材料组骨成熟度较差.结论:A-PCPC支架接种BMSCs后显示良好的成骨活性,能够促进未成熟骨矿化.可以作为骨组织工程支架材料.     

人牙髓细胞条件培养液对人牙囊细胞成骨分化作用的体外研究

目的:探索人牙髓细胞条件培养液(HDPSCs-CM)对人牙囊细胞(HDFSCs)向成骨分化的作用.方法:利用胶原酶消化法获得HDFSCs,经纯化鉴定后培养于HDPSCs-CM中;CCK-8检测HDFSCs增殖活性,观察细胞形态改变;碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红S染色定性分析细胞成骨能力的改变.qRT-PCR检测HDFSCs中骨膜蛋白(POSTN)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)以及骨桥蛋白(OPN)的mRNA表达情况.结果:经HDPSCs-CM诱导后,HDFSCs形态发生成牙骨质或成骨样改变;诱导组HDFSCs增殖活性受到明显抑制(P<0.05或P<0.01);诱导组ALP染色强于对照组,茜素红S染色矿化结节多于对照组;诱导组POSTN、Col-Ⅰ、ALP、BSP、OPN的表达量明显增高(P<0.05或P<0.01).结论:HDPSCs-CM能促进HDFSCs成骨分化.     

颅骨锁骨发育不全患者牙囊细胞的体外生物学特征

目的：在成功分离培养正常同龄人牙囊细胞（dental follicle cells,DFCs）与颅骨锁骨发育不全（cleidocranial dysplasia, CCD）患者牙囊细胞（DFCs-CCD）的基础上,研究其一般体外生物学特征,包括增殖、克隆、成骨及破骨能力。方法：采用 BrdU细胞增殖实验与倍增法研究两种来源 DFCs 增殖能力;用结晶紫染液染色培养12 d 的两种 DFCs,分析其克隆形成能力;并用成骨诱导液诱导两种 DFCs 成骨,用 Western blot 和茜素红染色法分析成骨能力,用实时定量 PCR 方法研究其破骨基因表达差异。结果：DFCs-CCD 的 BrdU 阳性率高于 DFCs,同时 DFCs 的群体倍增时间为（1．834±0．093）d,而 DFCs-CCD 的则为（1．394±0．028）d,差异具有统计学意义（P ＜0．05）;DFCs-CCD 的克隆集落多于 DFCs,但 Runt 相关转录因子2（Runt-related transcrip-tion factor 2,Runx2）、成骨细胞特异性转录因子 Osterix、骨钙素（osteocalcin,Ocn）等成骨相关蛋白表达水平低,而其茜素红染色所示钙化结节同样较少;同时,DFCs-CCD 高表达核因子-κB 受体活化因子（receptor activator for nuclear factor-κB,RANK）和骨保护素（osteoprotegerin,OPG）等破骨相关基因（P ＜0．05）,而核因子-κB 受体活化因子配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL）水平无统计学差异（P ＞0．05）。结论：相比 DFCs,DFCs-CCD 具有更强的增殖、克隆能力和更弱的成骨能力,而破骨基因表达紊乱。     

胰岛素对高糖条件下体外培养的大鼠牙囊细胞增殖、分化的影响

目的:探讨胰岛素对高糖条件下体外培养的大鼠牙囊细胞(dental follicle cells,DFC.)增殖、分化的影响.方法:取出生7d的SD大鼠上、下颌磨牙牙囊,原代培养牙囊细胞,选取生长状态良好的第4代细胞,在糖生理浓度(5.5mmol/L)和高糖条件下(16.5 mmol/L和49.5 mmol/L)与6μg/mL胰岛素共同孵育,分别于培养1、3、7、9d时采用MTT法和1～7d采用碱性磷酸酶试剂盒检测胰岛素对高糖条件下体外培养的大鼠牙囊细胞增殖、分化的影响.采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析.结果:所培养的细胞波形丝蛋白阳性,角蛋白阴性.在第1、3天,16.5mmol/L葡萄糖促进第4代大鼠牙囊细胞的增殖,而49.5 mmol/L葡萄糖抑制牙囊细胞的增殖,胰岛素下调16.5 mmol/L葡萄糖下牙囊细胞的增殖,上调49.5 mmol/L葡萄糖下牙囊细胞增殖;在第7、9天,高糖促进牙囊细胞增殖,胰岛素上调高糖下牙囊细胞的增殖.在1～7d内,高糖提高第4代大鼠牙囊细胞碱性磷酸酶活性,胰岛素下调高糖下牙囊细胞的碱性磷酸酶活性(P<0.05).结论:本实验培养的细胞是来源于外胚层间充质的牙囊细胞.实验结果表明,胰岛素能纠正急性高糖对大鼠牙囊细胞增殖和分化的影响.     

人牙周膜细胞体外三维立体培养模型的建立

目的：建立人牙周膜细胞（PDLC）体外三维立体培养模型，初步探讨两种支架材料应用于牙周组织工程的可行性，为进一步研究牙周组织生理病理及牙周组织工程奠定实验基础。方法：组织块法培养人PDLC，传代扩增后，接种于珊瑚和珊瑚转化羟基磷灰石（CHA）两种三维支架上，体外继续培养3d，进行细胞计数和扫描电镜观察。结果：细胞在两种支架材料上均能形成良好贴附并增殖，扫描电镜可见两种支架材料均具有良好的多孔网状结构，细胞在支架材料上生长旺盛，伸展充分。结论：可通过将人PDLC接种到珊瑚或CHA上建立体外三维立体培养模型，珊瑚和CHA均有望成为牙周组织工程的支架材料。     

Are Hertwig’s epithelial root sheath cells necessary for periodontal formation by dental follicle cells?

ObjectiveThe role of Hertwig’s epithelial root sheath (HERS) cells in periodontal formation has been controversial. This study aimed to further clarify whether HERS cells participate in formation of the periodontium, and the necessity of HERS cells in differentiation of dental follicle cells (DFCs) for periodontal regeneration.DesignHERS cells and DFCs were isolated and identified from post-natal 7-day Sprauge-Dawley rats. In vitro, direct co-culture of HERS cells and DFCs as well as the individual culture of HERS and DFCs were performed and followed by alizarin red staining and the quantitative real-time polymerase chain reaction analysis. For in vivo evaluation, the inactivated dentin matrix (iTDM) was fabricated. HERS cells and DFCs were seeded in combination or alone on iTDM and then transplanted into the rat omentum. Scanning electron microscope and further histological analysis were carried out.ResultsIn vitro, mineral-like nodules were found in the culture of HERS cells alone or HERS + DFCs either by alizarin red staining or scanning electronic microscope. The mineralization and fiber-forming relevant mRNA expressions, such as bone sialoprotein, osteopontin, collagen I and collagen III in HERS + DFCs were significantly higher than that of the HERS or DFCs alone group. After transplantation in vivo, cementum and periodontal ligament-like tissues were formed in groups of HERS + DFCs and HERS alone, while no evident hard tissues and attached fibers were found in DFCs alone.ConclusionsHertwig’s epithelial root sheath cells directly participate in the formation of the periodontium, and they are essential for the differentiation of dental follicle cells to form periodontal structures. The combination use of Hertwig’s epithelial root sheath cells and dental follicle cells is a promising approach for periodontal regeneration.     

狗牙周膜细胞三维立体培养的体外实验研究

目的 :探讨异体脱矿松质骨基质 (CBM )和纳米羟基磷灰石材料 (nHAC)两种支架材料应用于牙周组织工程的可行性 ,为建立牙周组织工程的动物模型及下一步进行牙周组织工程的动物实验奠定实验基础。方法 :组织块法培养狗牙周膜细胞 ,传代扩增后 ,接种于CBM和nHAC 2种三维支架上 ,体外继续培养 3d ,进行细胞计数和扫描电镜观察。结果 :狗牙周膜细胞在 2种支架材料上均能形成良好贴附并增殖 ,扫描电镜可见 2种支架材料均具有良好的多孔网状结构 ,细胞在支架材料上生长旺盛 ,伸展充分。结论 :CBM和nHAC均有望成为牙周组织工程的支架材料     

人牙源性间充质细胞与胶原类材料复合培养的体外实验研究

目的：评价胶原类材料作为牙齿组织工程研究的支架材料的可行性。方法：将生长因子诱导后的人牙源性间充质细胞与胶原类材料复合后进行体外三维培养，观察细胞生长和增殖情况。结果：细胞在胶原凝胶中生长良好，并保持了分化表型。细胞在胶原膜表面伸展充分，生长良好，增殖活跃，细胞表面可见多数分泌颗粒。结论：胶原类材料适宜牙源性间充质细胞的生长。然而，它们坚韧性不高，而且无法为矿化组织细胞的生长提供充足的矿物离子环境。因此，胶原类材料可作为牙齿组织工程研究的一类较好的辅助性支架材料。     

小鼠牙囊细胞的体外培养及表型特征

目的　建立小鼠牙囊细胞(DFC)的体外分离培养方法,研究牙囊细胞的表型特征。方法　用1%的胰蛋白酶消化分离9 d龄Balb/c小鼠的下颌第一磨牙牙胚的牙囊组织进行体外培养,倒置显微镜下观察细胞的形态,扫描电镜观察细胞的表面形貌,SP免疫组化法检测细胞碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)的表达。结果　分离培养的细胞有3种类型:立方形或多角形;长梭形;非常细长的细胞形状。扫描电镜下细胞具有多形性,有大量的线状胞浆突和微绒毛;根据细胞表面有无纤维细丝覆盖,可将细胞分为有纤维细丝、无纤维细丝两个亚群。免疫组化染色显示部分牙囊细胞的ALP、BSP、OPN的表达阳性。结论　牙囊细胞具有多种细胞的表型特征, 有分化为成牙骨质细胞、牙周膜细胞和成骨细胞的潜能。     

BMP-2和地塞米松联合诱导大鼠牙囊细胞与β-磷酸三钙生物陶瓷相容性的实验研究

目的：以BMP-2和地塞米松诱导的大鼠牙囊细胞作为种子细胞,β-磷酸三钙作为细胞支架材料,体外构建细胞生物材料复合体,观察大鼠牙囊细胞在β-磷酸三钙生物陶瓷材料的贴附、增殖情况。方法：收集培养的第3代RDFCs,血清饥饿同步化后,细胞分为四组,分别为BMP-2、Dex、BMP-2＋Dex诱导组及空白对照组。诱导3d后,将密度为4×106/ml的细胞悬液0.1ml均匀接种到预制好的β-TCP支架材料上,分别于体外培养3d、7d取细胞材料复合体,通过细胞计数、扫描电子显微镜观察细胞在材料表面的贴附、增殖情况。结果：细胞计数发现,7d时BMP-2＋Dex诱导组细胞数量显著高于BMP-2诱导组、Dex诱导组（P〈0.01）。扫描电镜观察,β-TCP表面呈多孔三维立体网状结构。细胞接种3 d和7d时,单位面积内BMP-2＋Dex诱导组细胞数量均明显高于BMP-2诱导组、Dex诱导组、对照组。结论：β-磷酸三钙具有良好的生物相容性,利于大鼠牙囊细胞的贴附和生长,证明BMP-2和地塞米松联合作用促进大鼠牙囊细胞的增殖、分化的协同效应,为进一步使用BMP-2和地塞米松诱导大鼠牙囊细胞,并与β-磷酸三钙生物陶瓷复合后体内移植实验提供依据。     

大鼠牙囊细胞体外培养技术的建立及其鉴定

目的　建立体外培养大鼠牙囊细胞的方法,观察牙囊细胞体外生长的生物学特性。方法　分离乳鼠下颌第一、第二磨牙牙胚的牙囊组织,应用组织培养的方法进行牙囊细胞原代和传代培养。显微镜观察培养细胞的形态,电镜观察体内牙囊组织和体外培养的牙囊细胞的超微结构。免疫组化法检测细胞波形蛋白、Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白的表达。结果　分离组织培养24 h后,梭形细胞和多角形细胞从组织块中游出,经消化排除法获得纯化的牙囊细胞。显微镜下牙囊细胞为成纤维细胞样,电镜下牙囊细胞无桥粒,胞浆中含有高密度电子颗粒和大量粗面内质网(RER)。免疫组化染色显示牙囊细胞表达波形蛋白、Ⅰ型胶原和纤维连接蛋白。结论　运用组织培养和细胞生物学技术可以成功获得原代和传代培养的大鼠牙囊细胞,体外培养的细胞具有与正常大鼠牙囊细胞相一致的生物学特性。     

生物活性玻璃陶瓷与骨膜源性成骨细胞体外相容性的实验研究

目的：探讨多孔状生物活性玻璃陶瓷（bioactive glass ceramics，BGC）与体外培养扩增的兔骨膜源性成骨细胞（periosteal-derived osteoblasts，POBs）的生物相容性，为骨组织工程载体材料的选择提供依据。方法：体外培养并扩增兔骨膜源性成骨细胞，运用MTT法和酶学测定法分别检测BGC提取液对细胞增殖和碱性磷酸酶（ALP）活性的影响．运用倒置相差显微镜、扫描电镜观察与BGC复合培养的细胞在材料内的生长情况。结果：BGC提取液对培养早期细胞的增殖有一定的抑制作用，对培养晚期细胞的增殖无明显影响；在细胞培养过程中能上调POBs分泌ALP的能力：细胞在BGC材料孔隙表面生长良好，并能增殖、分泌细胞外基质。结论：在体外多孔状BGC具有良好的细胞相容性，为BGC作为骨组织工程的细胞载体提供了实验依据。