MEX3A在人膀胱癌组织细胞中的表达及分析

目的探讨MEX3A基因沉默对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响,并验证MEX3A蛋白在人膀胱癌组织中的表达。方法选取8例病理诊断证实为膀胱癌患者的癌组织和癌周组织标本,其中男性5例,女性3例;年龄50~84岁,平均年龄63.4岁。实验组应用MEX3A-shRNA慢病毒颗粒转染5637膀胱癌细胞株,对照组采用阴性对照慢病毒转染。实时定量聚合酶链反应(PCR)检测MEX3A基因敲减效率,使用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,Caspase3/7法检测细胞凋亡。应用免疫组织化学染色检测膀胱癌及癌周组织细胞中MEX3A蛋白表达量。结果实时荧光定量PCR检测经shRNA慢病毒感染两组目的基因mRNA水平的表达丰度,实验组为(0.26±0.05),对照组为(1.00±0.05);两组比较,MEX3A基因在实验组5637膀胱癌细胞中的mRNA水平的表达量受到抑制(t=17.7,P0.05)。实验组与对照组相比,细胞增殖明显受到抑制(P0.05),细胞凋亡显著增加(P0.05)。在400倍光学显微镜下观察,棕黄色颗粒为人MEX3A蛋白与兔MEX3A抗体反应后染色所致,表示有MEX3A蛋白表达;在癌组织中较多,着色较深,癌周组织中较少,着色较浅。MEX3A蛋白在癌及癌周组织总的表达量分别为(7.33±2.73)分、(4.42±1.98)分,两组比较差异有统计学意义(P0.05);癌组织中的表达量约是癌周组织中的1.66倍。结论MEX3A基因可以促进膀胱癌细胞增殖,并抑制其凋亡;MEX3A蛋白在膀胱癌组织中呈现高表达。     

SF3B1敲减通过RAS等信号通路影响MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡

目的:检测剪接因子3B亚基1(SF3B1)基因敲减对人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、侵袭、迁移及凋亡等生物学行为的影响,并初步探讨其作用机制。方法:将SF3B1基因RNA干扰慢病毒载体(LV-SF3B1-RNAi)转染MDA-MB-231细胞,以敲减SF3B1基因。实验分为阴性对照组(转染空载体)和SF3B1敲减组(转染SF3B1-shRNA-1和SF3B1-shRNA-2)。采用qPCR和Western blot检测SF3B1的敲减效率;分别用MTT法和集落形成实验检测SF3B1敲减对细胞生长及集落形成能力的影响;Transwell小室法测定SF3B1敲减对细胞侵袭和迁移能力的影响;annexin V-APC单染法结合流式细胞术检测SF3B1敲减对细胞凋亡的影响;采用转录组测序检测SF3B1敲减后的差异表达基因及富集的信号通路。结果:MTT结果显示,SF3B1敲减组MDA-MB-231细胞的A值在96和120 h均显著低于阴性对照组(P0.01);SF3B1敲减组的集落形成数显著低于阴性对照组(P0.01),凋亡率显著高于阴性对照组(P0.01),侵袭和迁移细胞数均显著低于阴性对照组(P0.01);SF3B1敲减后差异表达基因富集的信号通路包括RAS信号通路、紧密连接、MAPK信号通路等。结论:在MDA-MB-231乳腺癌细胞中敲减SF3B1可能通过RAS等信号通路的异常抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡。     

ORP-150基因沉默对SKOV-3细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的:探讨沉默ORP-150基因对体外培养卵巢癌细胞SKOV-3的增殖、转移及侵袭的影响并初步探讨其可能作用机制.方法:运用慢病毒包装shRNA方法沉默SKOV-3细胞的ORP-150基因;研究分为3组:实验组(ORP-150 shRNA)、阴性对照组(NC shRNA)和空白对照组(CON);采用qRT-PCR和Western印迹法检测基因敲减效率,CCK8法、克隆形成试验检测ORP-150沉默对细胞增殖能力的影响,划痕试验、Transwell试验检测SKOV-3细胞侵袭迁移能力的变化,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,Western印迹法探讨ORP-150基因敲减后影响细胞表型改变的作用机制.结果:沉默ORP-150基因可以抑制卵巢癌细胞的增殖能力、克隆形成能力以及跨膜转移扩散能力(P<0.05),但对细胞的侵袭能力无明显影响(P>0.05);敲减ORP-150基因后卵巢癌细胞凋亡明显增加(P<0.05);敲减ORP-150基因后的卵巢癌细胞可能通过Wnt信号通路及Caspase级联反应影响细胞的修复,最终抑制细胞增殖,促进凋亡发生.结论:沉默ORP-150基因可以抑制卵巢癌细胞SKOV-3的增殖和转移,同时促进凋亡发生.这种细胞表型的改变可能是通过下调Wnt信号通路中β-catenin,同时的表达,以及抑制Caspase级联反应从而下调c-myc,cyclin D1和caspase-3蛋白的表达来实现,ORP-150基因沉默可能是卵巢癌治疗的新靶点.     

siRNA下调SNCG基因表达抑制膀胱癌细胞系5637的增殖和侵袭

目的探讨突触核蛋白γ(SNCG)基因对膀胱癌细胞5637增殖和侵袭能力的影响。方法设计并合成3对SNCG-siRNA序列,转染5637细胞后,用RT-q PCR和Western blot检测SNCG的表达。分别通过CCK-8增殖实验和侵袭实验评估5637细胞增殖和侵袭能力。结果与膀胱癌细胞系T24、EJ和UMUC-3相比,5637细胞中SNCG表达水平最高(P0.05);与空白和阴性对照组相比,3对SNCG-siRNA序列转染5637后均可抑制SNCG mRNA和SNCG蛋白的表达(P0.05),但SNCG-siRNA-244组抑制效果最明显;实验组5637细胞的增殖受到明显抑制(P0.05),且细胞的侵袭能力显著下降(P0.05)。结论通过特异性干扰SNCG基因的表达可抑制膀胱癌细胞5637的增殖和侵袭,SNCG的siRNA序列可能成为膀胱癌治疗的新靶点。     

下调X连锁调亡抑制蛋白基因表达增强多西他赛诱导膀胱癌细胞凋亡的作用

目的: 观察人源性膀胱癌细胞在下调X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)基因表达后,多西他赛对其敏感性的影响。方法: 以shRNA和shRNA-XIAP质粒分别稳定转染人源性膀胱癌T24T细胞。以荧光显微镜观察转染细胞。以RT-PCR和Western blotting法分别检测膀胱癌细胞XIAP mRNA和蛋白的表达。与T24T以及转染空载体的T24T细胞相比较,以ATPase法检测多西他赛对转染 XIAP 基因的膀胱癌细胞的细胞毒性。相差显微镜下观察,流式细胞术检测多西他赛预处理转染 XIAP 基因的膀胱癌细胞的凋亡率;以Western blotting法检测细胞内的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)和caspase-3蛋白表达和裂解水平。结果: 荧光显微镜下分别观察shRNA和shRNA-XIAP转染的T24T细胞,均见稳定荧光。Western blotting和RT-PCR检测结果显示,人源性膀胱癌T24T细胞在稳定转染反义XIAP基因后,其XIAP蛋白和mRNA水平均显著降低。经多西他赛处理24 h后, 转染反义XIAP基因的T24T细胞IC₅₀为(1.23±0.62)nmol/L,远低于T24T以及转染空白载体的对照组细胞 。流式细胞术检测结果显示, T24T shRNA-XIAP细胞组(2 nmol/L和5 nmol/L)凋亡率 显著高于转染空载体细胞的凋亡率 。与转染空载体的细胞相比较,T24T shRNA-XIAP细胞内的PARP和caspase-3明显降低。结论: 下调膀胱癌细胞的XIAP基因表达后,可显著增强化疗药物多西他赛所诱导的膀胱癌细胞的凋亡,并增强多西化赛的细胞毒性。     

携带端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体对星形胶质细胞凋亡的影响

背景：端粒酶反转录酶对端粒酶的激活和活化有重要的作用,利用端粒酶反转录酶的慢病毒载体抑制星形胶质细胞表达对脊髓损伤修复的影响鲜见报道。目的：利用靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体转染大鼠星形胶质细胞,并观察端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体对星形胶质细胞凋亡的影响。方法：原代及传代培养大鼠星形胶质细胞。实验分为端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组、单纯慢病毒转染组和空白组,转染后并测其转染率,且在转染后的不同时间段测量大鼠星形胶质细胞的凋亡情况。结果与结论：端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组及单纯慢病毒转染组对星形胶质细胞的转染率达85%-90%。免疫荧光染色及流式细胞仪检测显示,端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组在转染后24-48 h细胞凋亡率达50%-60%。在单纯慢病毒转染组及空白组细胞凋亡率并无显著改变。结果说明,携带端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体可促进大鼠脊髓星形胶质细胞凋亡。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

EFNB2对膀胱癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响及其机制

目的 研究EFNB2对膀胱癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等生物学功能的影响，探讨其作为免疫治疗的可能性。方法 以膀胱癌细胞系T24、5637、J82和UM-UC-3细胞为研究对象，选用人膀胱上皮永生化细胞系SV-HUC-1细胞作为阴性对照。通过慢病毒载体转染shRNA-EFNB2进行敲低实验，然后分别采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中EFNB2的mRNA和蛋白表达水平；CCK8和克隆形成实验检测细胞增殖活力；流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率；Transwell和细胞划痕实验检测细胞侵袭和迁移能力；Western blot检测Bcl2、Bax、Vimentin和E-cadherin的蛋白表达水平。结果 与人膀胱上皮永生化细胞系SV-HUC-1细胞相比，膀胱癌细胞系中EFNB2的表达水平显著增高,其中以T24细胞表达最高(P<0.01)。敲低T24细胞系EFNB2基因表达后，T24细胞增殖活力显著下降(P<0.05)；细胞周期虽然尚未有显著变化，但细胞凋亡率显著增高(P<0.05)，并且抗凋亡蛋白Bcl2表达显著下降（P<0.05）,促凋亡蛋白B...     

敲低核蛋白1(NUPR1)基因抑制人U266多发性骨髓瘤细胞增殖并促进其凋亡北大核心CSCD

目的构建核蛋白1-短发夹RNA(NUPR1-sh RNA)慢病毒载体定向敲低NUPR1基因,研究NUPR1基因下调对人多发性骨髓瘤U266细胞增殖及凋亡的影响。方法以正常浆细胞为对照,通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测骨髓瘤U266细胞和RPMI8226细胞的NUPR1 m RNA水平。设计针对NUPR1基因的sh RNA并包装慢病毒载体感染U266细胞,流式细胞术观察转染效率,q RT-PCR、Western blot法验证NUPR1基因干扰效果,CCK-8法及台盼(trypan)蓝染色检测细胞增殖,流式细胞术及Hoechst染色观察细胞凋亡。结果与正常人浆细胞相比,U266、RPMI8226细胞NUPR1 m RNA水平较高;U266细胞慢病毒感染效率达80%,NUPR1-sh RNA慢病毒载体构建成功。敲低NUPR1水平后,U266细胞增殖减弱,抑制率高达(58.71±1.64)%;与阴性对照组和空白对照组相比,敲低NUPR1水平后,U266细胞凋亡率明显增加。结论敲低U266细胞NUPR1水平后,可明显抑制U266细胞增殖并促进其凋亡。     

miR-520c-3p靶向MEX3A调控肺癌细胞增殖、凋亡的分子机制

为研究miR-520c-3p对肺癌细胞增殖和凋亡的影响及其潜在的作用机制,用实时定量RT-PCR检测肺癌细胞H1299、NCI-H460、A549和正常肺上皮细胞BEAS-2B中miR-520c-3p和MEX3同源物A(MEX3 homolog A,MEX3A)的表达水平。将miR-NC、miR-520c-3p、si-NC、si-MEX3A、anti-miR-NC、anti-miR-520c-3p转染至H1299细胞后,用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting检测蛋白表达,双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光活性。结果显示,与正常肺上皮细胞BEAS-2B比较,肺癌细胞H1299、NCI-H460、A549中miR-520c-3p的表达水平均显著降低(P0.05),MEX3A mRNA和蛋白的表达水平显著升高(P0.05)。miR-520c-3p过表达、MEX3A抑制表达均可抑制H1299细胞的增殖活力,促进细胞凋亡;miR-520c-3p过表达抑制CyclinD1、Bcl-2蛋白的表达,促进p21、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白的表达;MEX3A抑制表达抑制CyclinD1、Bcl-2蛋白的表达,促进p21、Bax蛋白的表达。miR-520c-3p可靶向调控MEX3A的表达;MEX3A过表达逆转了miR-520c-3p过表达对肺癌细胞H1299的增殖抑制和凋亡促进作用。提示miR-520c-3p可抑制肺癌细胞H1299的增殖,促进其凋亡,其机制可能与靶向MEX3A有关,这将为肺癌的预防和治疗提供新靶点。     

Apoptin基因通过激活caspase-3诱导人黑色素瘤细胞A375凋亡

目的研究caspase-3在肿瘤特异性凋亡基因诱导人黑色素瘤细胞A375凋亡中的作用。方法用含有apoptin基因的真核表达载体瞬间转染体外培养的人黑色瘤细胞A375;采用RT-PCR、DNA凝胶电泳、流式细胞术检测A375细胞的凋亡;以比色法检测caspase-3的相对活性。结果Ap-optin基因瞬间转染的A375细胞可出现典型的细胞凋亡所具有的DNA梯状带;流式细胞术发现实验组细胞凋亡率明显高于其他各组(P<0.01);转染后24h实验组caspase-3的活性开始升高,72h达高峰,明显高于其他各组(P<0.01)。结论Apoptin基因可通过激活caspase-3诱导人黑色素瘤细胞A375凋亡。     

SPARC基因RNAi慢病毒载体的构建及其在SKM-1细胞中的表达

目的:构建SPARC基因RNAi慢病毒载体获得稳定产毒的细胞,并观察其对人MDS细胞株SKM-1细胞的转染效率及其对SPARC基因的抑制效率。方法:针对已经筛选确定的SPARC基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生GC-shSPARC慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆并进行测序鉴定。用GC-shSPARC、pHelper1.0和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度,并将获得的重组慢病毒GC-shSPARC转染SKM-1细胞,通过荧光显微镜检测转染后GFP表达情况,测定转染效率;RT-PCR和Western blot分别验证转染后SKM-1细胞SPARC mRNA及蛋白的表达。结果:经测序证实,构建出了SPARC shRNA的慢病毒载体GC-sh SPARC。包装、浓缩病毒悬液的滴度为1×109TU/mL。荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为70%,RT-PCR、Western blot技术分别检测到GC-shSPARC慢病毒转染SKM-1细胞SPARC mRNA、SPARC蛋白表达水平较空白组明显降低(P<0.05)。结论:成功构建SPARC基因RNAi慢病毒载体,其能高效干扰SKM-1细胞SPARC基因的表达。     

小鼠B7-1 基因RNAi 慢病毒载体的构建及其沉默效应研究

目的:构建介导小鼠B7-1 基因RNAi 的慢病毒载体,研究其对L929 细胞表面B7-1 分子表达的沉默效应。方法:从小鼠B7-1 基因编码区选择3 段RNA 干扰靶序列,制备转录双发夹RNA 的前体DNA,并克隆至慢病毒穿梭质粒,构建B7-1 的RNAi 慢病毒穿梭载体,测序鉴定。将重组质粒及辅助质粒共转染293T 细胞产生慢病毒,经超速离心获得浓缩慢病毒颗粒。通过测定293T 细胞GFP 表达水平确定病毒滴度,流式细胞术检测感染效率以及对细胞表面B7-1 的干扰效率。病毒感染细胞经嘌呤霉素筛选及克隆培养获得小鼠B7-1 基因RNAi 慢病毒稳定感染的L929 细胞,流式细胞术分析细胞中GFP 及B7-1 分子表达的状况;将感染细胞与分离的小鼠脾脏T 细胞混合培养,分析B7-1 稳定沉默细胞刺激T 细胞增殖的能力。结果:成功了构建小鼠B7-1 基因RNA 干扰的重组慢病毒载体;获得了滴度达(3 ~ 5) 108 TU/ ml 的浓缩重组慢病毒,重组慢病毒可有效感染L929 细胞介导GFP 表达以及沉默其表面的B7-1。经筛选获得慢病毒稳定感染的L929 细胞,该细胞表面B7-1分子表达受到抑制,刺激T 细胞增殖的能力显著下降(P<0.05)。结论:构建了能够高效感染及沉默小鼠B7-1 分子的RNAi 慢病毒载体,该载体可稳定沉默L929 细胞表面B7-1 分子表达,抑制B7-1/ CD28 信号诱导的T 细胞增殖效应。     

Effect of lentivirus-mediated shRNA targeting VEGFR-3 on proliferation, apoptosis and invasion of gastric cancer cells

It has been reported that vascular endothelial growth factor receptor 3 (VEGFR-3) is highly expressed in most tumor tissues, including gastric cancer. However, the effects of VEGFR-3 knockdown on the proliferation, apoptosis and invasion of gastric cancer cells and downstream signaling molecules have not yet been well established. In the present study, four short hairpin RNA (shRNA) sequences targeting the VEGFR-3 gene (NM_002020) were designed and cloned into a lentiviral vector, pRNAT-U6.2/Lenti, to construct four recombinant lentiviral vectors. The vectors with the two highest interfering efficiencies were selected to be co-transfected with packaging vectors in HEK293T cells to assemble lentivirus particles. Results from Western blot analysis showed that the VEGFR-3 shRNA-4 lentivirus-infected group (sh#4) had the highest efficiency of gene silencing in the MKN45 cell line compared with the parental and control group. The sh#4 group significantly slowed cell proliferation, decreased the mean percentage of S-phase cells and increased the mean percentage of G1 phase cells, promoted cell apoptosis, and also significantly inhibited cell invasion of MKN45 compared with the other two groups. Furthermore, the expression of the anti-apoptotic factor Bcl-2 was significantly decreased in the sh#4 group compared to that of the other two groups. Moreover, results from qRT-PCR revealed that knockdown of VEGFR-3 with the shRNA lentiviral vector resulted in down-regulation of the downstream neural cell adhesion molecule contactin-1 (CNTN-1). In conclusion, the recombinant lentivirus particles were able to remarkably suppress VEGFR-3 expression, regulate the cell cycle, inhibit proliferation and induce apoptosis in the MKN45 cell lines.     

转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因共转染骨髓干细胞

背景：骨形态发生蛋白2及转化生长因子β是骨再生中重要的因子,提高其表达可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。 目的：构建携带转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的慢病毒载体,观察其在骨髓间充质干细胞中的表达情况。 方法：应用重组慢病毒技术构建同时携带转化生长因子β3、骨形态发生蛋白2和绿色荧光蛋白基因的重组慢病毒表达载体,并用其转染体外培养的第3代兔骨髓间充质干细胞,以转染携带转化生长因子β3或骨形态发生蛋白2单一基因的慢病毒或单独慢病毒的骨髓间充质干细胞作为对照。转染后1周分别提取各组细胞的总RNA和蛋白进行检测。 结果与结论：荧光显微镜下见转染转化生长因子β3和(或)骨形态发生蛋白2基因3 d的骨髓间充质干细胞发绿色荧光,转染效率达90%以上。RT-PCR和Western blot结果显示,转染转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因的骨髓间充质干细胞转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2 mRNA和蛋白的表达均高于单一基因转染组及空白对照组。可见应用慢病毒可成功将转化生长因子β3和骨形态发生蛋白2基因转染至骨髓间充质干细胞并实现其高效表达,且两种基因具有协同促表达作用。     

稳定转染增强型绿色荧光蛋白大鼠骨髓间充质干细胞系的建立

背景：利用间充质干细胞或含有治疗因子的干细胞进行有选择性的杀伤肿瘤细胞是一种有前途的治疗方法。 目的：建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。 方法：通过脂质体介导慢病毒质粒pVector-EGFP、pHelper、Envelope 共转染293T细胞完成载体病毒构建,以实时荧光定量PCR检测慢病毒滴度;取对数生长期的SD大鼠骨髓间充质干细胞,以复感染指数MOI值0,5,10,15,20加入携带报告基因增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体稀释液,72 h后观察各组增强型绿色荧光蛋白的表达效率及阳性转染率。 结果与结论：携带增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体系统转染293T细胞能够正确表达,滴度为1×10⁸ TU/mL。包装好的病毒颗粒转染大鼠骨髓间充质干细胞二三天后,各孔均有增强型绿色荧光蛋白的表达。MOI值从0增至10,细胞的阳性表达率逐渐提高(P < 0.05),MOI值为10的组能获得>70%的转染率,但MOI值从10增至20,转染率变化不明显。说明以MOI值为10的滴度将慢病毒载体可将外源基因高效转入大鼠骨髓间充质干细胞内,建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。     

慢病毒介导的RWDD3沉默对人胶质瘤U251细胞增殖和侵袭的影响

目的:探讨沉默RWDD3表达对人胶质瘤U251细胞生物学特征的影响。方法:构建靶向RWDD3的shRNA重组慢病毒并转染U251细胞,通过real-time PCR和Western blot在mRNA及蛋白水平鉴定转染结果。MTT法检测转染后细胞的细胞活力;平板克隆实验检测克隆形成能力;Brd U实验检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡的改变。结果:real-time PCR和Western blot结果均表明成功建立稳定沉默RWDD3的U251细胞株。与空白对照组及阴性对照组比较,转染RWDD3-shRNA组的细胞活力和克隆形成能力降低;侵袭及迁移能力均下降,穿膜细胞数明显减少;细胞周期进展被抑制,阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率增高(P0.05)。结论:RWDD3在胶质瘤细胞增殖和侵袭过程中发挥重要作用,提示RWDD3有望成为人脑胶质瘤基因治疗的候选靶点。     

环氧化酶2基因沉默不影响人骨髓间充质干细胞定向分化的能力

背景：目前环氧化酶2基因沉默在干细胞中的研究还处在初级阶段。 目的：构建携带环氧化酶2基因沉默的慢病毒载体,观察其在人骨髓间充质干细胞中的表达,以及其定向分化潜能变化情况。 方法：应用重组慢病毒技术构建携带沉默环氧化酶2基因和绿色荧光蛋白的慢病毒载体,并用其转染体外培养第3代的人骨髓间充质干细胞,以无目的基因的慢病毒转染人骨髓间充质干细胞的实验组和未做处理的人骨髓间充质干细胞分别作为阴性对照组和空白组进行对比。转染后7 d分别提取各组细胞的总RNA和蛋白检测环氧化酶2表达量。对环氧化酶2基因沉默的人骨髓间充质干细胞和正常人骨髓间充质干细胞定向诱导,观察环氧化酶2基因沉默对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力的影响。 结果与结论：慢病毒转染3 d后,荧光显微镜下可见人骨髓间充质干细胞发出绿色荧光,阴性对照组转染效率可达90%以上,实验组转染效率达85%以上。RT-PCR和Western blot检测结果显示, 环氧化酶2基因在人骨髓间充质干细胞中的基因水平和蛋白水平均得到了明显抑制。环氧化酶2基因转染对人骨髓间充质干细胞成脂、成骨、成软骨能力无明显影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

慢病毒载体Pax6-EGFP构建及转染人骨髓间充质干细胞

BACKGROUND:Pax6 gene plays an important role in eye development and differentiation, and to study how it regulates the differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), gaining the BMSCs stably over-expressing Pax6 is crucial, which is also the basis of stem cell replacement therapy. OBJECTIVE:To construct a lentivirus vector containing Pax6 and detect the expression of Pax6 in transfected human BMSCs. METHODS:Pax6 gene was extracted using PCR. After its connection with lentivirus vector pHIV-EGFP, it was then packaged by 293T cells. The human BMSCs were transfected with recombinant lentivirus Pax6-EGFP as well as lentivirus vector pHIV-EGFP, which was considered negative control group. The cellular morphology was observed by a fluorescence microscope, and the mRNA expression of Pax6 was detected by real-time PCR. RESULTS AND CONCLUSION:The recombinant lentivirus Pax6-EGFP was constructed successfully with a titer of 3×109 pfu/L. After the transfection, both the green fluorescent protein and Pax6 gene were expressed detected using fluorescence microscope and real-time PCR, showing that the method of lentiviral transfection is a safe and effective way to modify BMSCs.     

沉默c-myc基因对Jiyoye细胞增殖与凋亡的影响

目的 运用RNA干扰（RNAi）技术,探讨经慢病毒载体介导的小干扰RNA（siRNA）转染Jiyoye细胞对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响,以期为靶向c-myc基因的白血病和恶性淋巴瘤基因治疗提供体外实验依据。方法 设计、合成一对针对c-myc基因的c-myc-3寡聚核苷酸链和一对阴性对照c-myc- neg寡聚核苷酸链。退火,然后连接到pLVX干扰载体上,包装,慢病毒介导转染人Jiyoye细胞株。转染后培养72 h,流式细胞术检测各组细胞转染率,pLVX-c-myc-3转染Jiyoye细胞,MTT法检测细胞增殖;Annexin V-异硫氰酸荧光素/碘化吡啶（FITC/PI）双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果 ①转染72 h后,流式细胞术鉴定阳性细胞比例,c-myc-neg组与c-myc-3组比较,差异无统计学意义（P 〉 0.05）[（54.3 ± 4.2） % vs（52.8 ± 2.9） %];两组细胞平均荧光强度差异、细胞转染率差异无统计学意义。②转染168 h生长曲线显示,转染pLVX-c-myc实验组细胞生长缓慢,与阴性对照组和空白对照组比较,差异有统计学意义（P 〈 0.05）。转染pLVX-c-myc 72 h后,实验组细胞抑制率为（46.40 ± 1.41） %,阴性对照组细胞抑制率为（17.03 ± 1.32） %,差异均有统计学意义（P 〈 0.05）。③转染pLVX-c-myc 72 h后,实验组早期凋亡细胞比例（25.6 ± 4.2） %,阴性对照组早期凋亡细胞（15.1 ± 4.2） %,空白对照组早期凋亡细胞为（12.7 ± 1.8） %,差异有统计学意义（P 〈 0.05）。实验组晚期凋亡细胞比例（11.5 ± 4.7） %,阴性对照组为（9.3 ± 4.7） %,空白对照组为（8.14 ± 2.8） %,差异有统计学意义（P 〈 0.05）。结论 设计合成构建的干扰序列pLVX-c-myc-3,可沉默c-myc基因,抑制Jiyoye细胞增殖,诱导细胞凋亡,为进一步探讨沉默c-myc基因在白血病和淋巴瘤靶向治疗中的作用提供了实验依据。     

Effects of lentiviral-mediated Foxp1 and Foxq1 RNAi on the hepatocarcinoma cell

Foxp1 and Foxq1 are two multifunctional molecules of “forkhead box (Fox)” family. The objective of this paper was to construct the lentiviral vectors expressing RNA interference (RNAi) against Foxp1 or Foxq1 genes, and the effects of both vectors with two RNAis on the proliferation, migration and apoptosis of 7721 hepatocarcinoma cell line were evaluated. Six target sequences against human Foxp1/Foxq1 mRNA were designed respectively and six pairs of their corresponding double-strand DNA oligo (siRNA) were synthesized prior to being transfected into 7721 cells with lipo2000, then a most efficient siRNA were selected to be subcloned into pLL3.7-GFP/Lenti plasmids. These plasmids were transfected into 293T cells to package lentiviral particles for subsequent transfection into 7721 cells after their sequences were confirmed. The expression of Foxp1and Foxq1 genes in the transfected cells were identified by real-time PCR. The migration, infiltration, viability and apoptosis of the transfected cells were assessed by wound healing assay, Transwell assay, CCK-8 assay and flow cytometry. Sequencing results showed that lentiviral vectors contained Foxp1 or Foxq1 gene. After being transfected into 7721 cells, Foxp1 and Foxq1 expression were significantly down-regulated by siRNA-823 and siRNA-834. The migration and infiltration ability, and the viability of 7721 cells transfected with two siRNAs were significantly suppressed; flow cytometry assay exhibited the apoptosis rate of transfected 7721 cells with the lentivirus RNAi vector of Foxp1 or Foxq1 was increased. All the results showed that the lentivirus RNAi vectors of Foxp1 and Foxq1 were able to inhibit the expression of Foxp1 and Foxq1 in 7721 cells efficiently, and the down-regulation of either Foxp1 or Foxq1 resulted in suppression of migration, infiltration and viability of 7721 cells and an increase in cell apoptosis. Our data indicated that both Foxp1 and Foxq1 genes played an oncogenic role in hepatocarcinoma cells, which proposed the two genes as new therapeutic targets for the cancer.