变异链球菌、表兄链球菌复合防龋DNA疫苗的研制

目的 构建包含变异链球菌和表兄链球菌两种致龋菌的主要抗原片段的复合防龋DNA疫苗,以期增强DNA防龋疫苗对表兄链球菌的抑制作用.方法 PCR获得表兄链球菌OMZ176GTF-1的CAT区,克隆至靶向防龋DNA疫苗pGJA-P/VAX中,构建编码变异链球菌PAc、GLU基因序列和表兄链球菌CAT基因序列的复合防龋DNA疫苗pGJGAC/VAX,转染CHO细胞系检测其表达.重组质粒及对照质粒分别经股四头肌注射和鼻腔滴注免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测血清和唾液中的特异性抗PAc,抗GLU和抗CAT抗体水平.重组质粒及对照质粒经鼻腔滴注免疫分别定植了变异链球菌和表兄链球菌的Wistar大鼠,龋齿记分评价防龋疫苗的龋齿保护效能.结果重组质粒pGJGAC/VAX构建成功.免疫小鼠后实验组小鼠血清和唾液抗PAc、抗GLU和抗CAT抗体水平均显著高于空载体对照组(P<0.01).血清特异性抗CAT抗体水平最高值在肌肉免疫组第8周和黏膜免疫组第10周时出现,分别为62.13μg/ml和11.43 μg/ml;唾液特异性抗CAT抗体水平最高值在肌肉免疫组第8周和黏膜免疫组第10周时出现,分别为0.67%和0.80%.大鼠龋齿保护实验结果显示在变异链球菌和表兄链球菌定菌鼠中实验组釉质龋(E),牙本质浅龋(Ds)和牙本质中龋(Dm)均显著低于pVAX1免疫组(P<0.05),实验组Ds和Dm均低于pGJA-P/VAX免疫组,但两组间E差异没有统计学意义(P>0.05).结论 复合防龋DNA疫苗构建成功,可在真核细胞中正确表达,动物实验证实能有效地诱导黏膜和系统体液免疫反应,并增强了DNA防龋疫苗对表兄链球菌的抑制作用.     

人参皂苷Re对防龋疫苗rPAc免疫效应的影响

目的 研究人参皂苷Re作为防龋亚单位疫苗rPAc佐剂的免疫保护效应.方法 40只BALB/c小鼠随机分为4组:防龋疫苗(rPAc)组,人参皂苷Re( Re)组,Re+rPAc组和生理盐水( NS)组,分别用rPAc、Re、Re+rPAc、生理盐水经鼻黏膜免疫.2 周后加强免疫1 次.用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清和唾液中特异性抗体的水平.脾细胞刺激实验检测细胞因子分泌水平.将24只定植了变形链球菌的Wistar大鼠随机分为4组:rPAc组,Re组,Re+rPAc组和NS组,分别用rPAc、Re、Re+rPAc、生理盐水经鼻黏膜免疫.2周后加强免疫1 次.龋齿记分评价防龋保护效能.结果 Re+rPAc组血清特异性抗PAc IgG、IgG1、IgG2a水平及唾液中特异性抗PAc IgA抗体水平均明显高于其他组( P＜0. 01). Re+rPAc组较其他组脾淋巴细胞白细胞介素4和γ干扰素表达增强(P＜0. 05).大鼠龋齿保护实验显示Re+rPAc组定菌鼠釉质龋(E)、牙本质浅龋(Ds)和牙本质中龋(Dm)均显著低于其他组( P＜0. 05).结论 Re作为防龋亚单位疫苗rPAc的佐剂可提高防龋疫苗的血清和唾液中特异性抗体的水平及防龋保护效能,具有作为防龋疫苗rPAc免疫佐剂的可行性.     

DNA防龋疫苗经TSG途径免疫BALB／c小鼠实验研究

目的 观察编码PAc结构基因A—P片段的重组质粒pCIA—P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB／c小鼠后的特异性免疫反应，并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法 将25只BALB／c小鼠随机分为4组，分别以重组质粒pCIA—P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠，ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA—P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc。结果 颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高，并持续数周。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高，但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论 重组质粒pCIA—P是一种有效的免疫原，该DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期粘膜免疫的有效途径。     

DNA防龋疫苗诱导长期免疫反应及机制初探

目的:观察编码pac结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法:将20只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc的表达。结果:颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续24周以上。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论:DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期黏膜免疫的有效途径。     

DNA防龋疫苗经TSG途径免疫BALB/c小鼠实验研究

目的观察编码PAc结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射(TSG)两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法将25只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc。结果颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续数周。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论重组质粒pCIA-P是一种有效的免疫原,该DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期粘膜免疫的有效途径。     

尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛重组质粒pcDNA3.0-fimH的免疫保护作用

目的研究尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛重组质粒pcDNA3.0-fimH产生的免疫反应及其对小鼠的免疫保护作用。方法选取BALB/c小鼠60只,随机分为3组(PBS对照组、空质粒对照组、疫苗免疫组),3组分别用构建成功的重组质粒pcDNA3.0-fimH(为疫苗免疫组),载体质粒(pcDNA3.0)(为空质粒对照组)和PBS液(为PBS对照组),经股四头肌注射免疫小鼠,于第21天和第35天加强免疫。于免疫第0、14、28及42天收集小鼠膀胱冲洗液,检测各组SIgA水平。于免疫第42天采血,检测各组特异性IgG、IgG1、IgG2a水平。结果免疫后,疫苗免疫组小鼠膀胱灌洗液中sIgA水平随时间延长呈上升趋势,且明显高于PBS对照组及空质粒组(F=10.08,P<0.05);疫苗免疫组小鼠血清特异性IgG、IgG1、IgG2a抗体均明显高于对照组及空质粒组(P<0.05);结论 pcDNA3.0-fimH基因疫苗可诱导BALB/c小鼠产生特异性体液免疫,对小鼠尿道具有一定的免疫保护作用。     

转基因番茄可食防龋疫苗免疫大鼠的实验研究?

目的用表达变异链球菌表面蛋白PAcP和霍乱毒素B亚单位融合蛋白的转基因番茄免疫SD大鼠,检测其免疫原性,探索研制安全、有效的可食用防龋疫苗的可能性。方法选择雌性 SD 大鼠18只,建立龋齿模型,随机分成3组(n=6),分别为转基因番茄组(实验组)、变异链球菌灭活全菌免疫组(阳性对照组)、非转基因番茄组(阴性对照组),免疫方式为灌胃免疫,每周免疫1次,连续免疫4周。分别于首次免疫前1 d 和每次免疫1周后采集血液、唾液样品,用酶联免疫吸附实验法检测血清中免疫球蛋白 G(IgG)、唾液中分泌型免疫球蛋白 A(SIgA)抗体水平;鼠龄70 d 时处死动物,并取上下颌骨进行龋齿计分。结果免疫后,实验组和阳性对照组大鼠血清中 IgG、唾液中 SIgA 抗体水平与阴性对照组比较差异有统计学意义(P <0.05);实验组和阴性对照组在 Dx 级外的各级差异有统计学意义(P <0.05)。结论转基因番茄防龋疫苗具有免疫原性,能够诱导实验动物产生有效的免疫应答,降低龋齿的发生。     

DNA防龋疫苗诱导长期免疫反应及机制初探

目的：观察编码pac结构基因A-P片段的重组质粒pCIA-P以经肌肉和颌下腺周围区域皮下注射（TSG）两种途径免疫BALB/c小鼠后的特异性免疫反应,并观察表面蛋白抗原PAc在小鼠颌下腺中的表达。方法：将20只BALB/c小鼠随机分为4组,分别以重组质粒pCIA-P经肌肉、颌下腺区周围区域皮下注射两种途径免疫小鼠及pCI质粒和生理盐水肌肉免疫小鼠,ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平动态变化。将pCIA-P经颌下腺区周围区域皮下注射以免疫组化技术观察表面蛋白抗原PAc的表达。结果：颌下腺区皮下注射法免疫后唾液IgA型特异性抗体和血清IgG型特异性抗体均明显升高,并持续24周以上。肌肉注射法后血清IgG型特异性抗体明显升高,但未有效诱导产生唾液IgA型特异性抗体。在小鼠颌下腺中检测到PAc蛋白的表达。结论：DNA防龋疫苗经颌下腺周围区域皮下注射免疫是可诱导长期黏膜免疫的有效途径。     

纳米基因防龋疫苗的构建及其免疫大鼠的实验研究

目的:制备pcDNA3.1(+)gbpB壳聚糖纳米基因防龋疫苗,并检测其经鼻免疫大鼠的效果。方法:制备两种pcDNA3.1(+)gbpB壳聚糖纳米颗粒载体系统,经鼻粘膜免疫SD大鼠,用ELISA法检测血清中针对葡聚糖结合蛋白B的特异IgG抗体滴度及唾液中针对葡聚糖结合蛋白B的特异SIgA抗体滴度。与阳性对照组霍乱毒素pcDNA3.1(+)gbpB及未免疫组、空白壳聚糖纳米颗粒组作比较。结果:该载体系统经鼻免疫SD大鼠所产生的血清及唾液中针对GbpB的IgG和SIgA抗体滴度远大于未免疫组和空白壳聚糖纳米颗粒组,而与阳性对照组霍乱毒素pcDNA3.1(+)gbpB组抗体滴度相当。且维持的抗体滴度更稳定和持久。结论:成功构建了以葡聚糖结合蛋白B基因为免疫原的纳米基因防龋疫苗,并获得较好的免疫效果。     

遍在蛋白质-结核MPT64融合基因DNA疫苗的构建及免疫效应

目的:用遍在蛋白质调节结核杆菌单一抗原DNA疫苗,以期获得更强的免疫保护.方法:构建结核杆菌MPT64抗原DNA疫苗(pM)和遍在蛋白质基因与MPT64抗原基因融合的DNA疫苗(pUM).分别将构建的两种DNA疫苗肌内注射免疫BALB/c雌性小鼠,检测小鼠的血清抗体(IgG、IgG1、IgG2a)、细胞因子(IFN-γ、IL-4)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,比较融合基因DNA疫苗和单基因DNA疫苗诱导的免疫应答强度.结果:pM组小鼠血清IgG水平高于pUM组(P＜0.01),但IgG2a/IgG1比值低于pUM组(P＜0.05).与pM组相比,pUM组小鼠IFN-γ分泌水平增高(P＜0.01),IL-4分泌水平下降(P＜0.01);pUM组的CTL活性高于pM组.提示融合基因DNA疫苗诱导的抗原特异性体液免疫应答不及单基因DNA疫苗,但其能诱导更强的细胞免疫应答.结论:遍在蛋白质-MPT64融合基因DNA疫苗对于防治结核病可能比单基因DNA疫苗更为有效.     

解毒通络生津法对干燥综合征自发性模型小鼠唾腺泪腺的影响

目的:探讨解毒通络生津法对干燥综合征自发性模型小鼠唾腺泪腺的影响。方法:将9周龄SPF级雌性非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠随机分为解毒通络生津治疗组、养阴生津对照组和空白组。分别予灌胃解毒通络生津方、养阴生津方、生理盐水干预,共5周。观察小鼠饮水量等一般情况;实验结束检测血清免疫球蛋白G(IgG)、血清免疫球蛋白A(IgA)、补体3(C3)浓度,HE染色法观察小鼠唾腺泪腺病理。结果:与空白组比较,治疗组和对照组NOD小鼠饮水量的增加得到明显控制;对照组小鼠血清IgG、IgA、C3浓度升高,而治疗组仅有C3浓度上升,IgG、IgA无显著变化;各组小鼠唾腺泪腺组织病理学积分均无显著差异。结论:解毒通络生津法与传统养阴生津法均能改善NOD小鼠口干症状,升高C3,但均未能对该模型鼠唾腺泪腺病理学改变造成显著影响;而解毒通络生津法对NOD小鼠的IgG、IgA无显著影响。     

一种精子蛋白嵌合肽的实验研究

目的：探讨可供两性使用的免疫避孕疫苗的可能性。方法：设计含有小鼠精子／睾丸特异性抗原SP17,Cyritestin中特异性氨基酸序列的新抗原35肽,经合成,鉴定及纯化后,免疫雌性Balb/C小鼠,并了解其免疫原性,同时观察其抗生育效应。结果：获得的新抗原35肽经质谱鉴定证实其合成正确,经高压液相色谱（KPLC）纯化后纯度达95％以上,嵌合肽与钥孔血蓝蛋白（KLH）偶联后免疫小鼠获得的特异性抗血清可识别小鼠,大鼠及人睾丸组织蛋白提取物中相对分子质量的蛋白质,与等量弗氏佐剂混悬后免疫小鼠,其血清中特异性IgG抗体滴度最高达1：6000,阴道粘膜冲洗液中特异性IgA抗体滴度最高达1：300,免疫后小鼠受孕率降至61．11％,平均每胎产仔量也减至4．3只,结论：新抗原35肽可在雌性Balb/C小鼠体内激发出较强的特异怀体液和粘膜免疫,使小鼠受孕率和每胎产仔数明显下降。     

益气养阴祛瘀中药对干燥综合征自发性模型非肥胖糖尿病小鼠的治疗作用及机制

[目的]探讨益气养阴祛瘀中药对非肥胖糖尿病(NOD)自发性干燥综合征(SS)样小鼠的疗效及作用机制。[方法]将45只8周龄NOD自发性SS样小鼠随机分为对照组、中药组和西药组灌胃治疗12周,分别检测各组治疗前、后小鼠不同时间点(9、15和20wk)的唾液分泌量,检测各组小鼠血清的IgG、IgA、C3,比较各组小鼠颌下腺、胸腺和脾脏指数情况,并观察各组颌下腺组织病理学改变;同时采用RT-PCR法检测各组颌下腺组织BAFF和NF-κB mRNA表达水平。[结果]中药组对NOD小鼠的唾液分泌量、颌下腺指数和颌下腺炎性浸润较对照组均有不同程度地改善(P0.05或P0.01);其疗效也更优于单用羟氯喹的西药组(P0.05)。中药组能明显下调NOD小鼠颌下腺BAFF mRNA的表达水平,能使NOD实验小鼠在治疗后外周血IgG和C3水平改善(P0.05或P0.01)。[结论]益气养阴祛瘀中药对NOD小鼠SS具有有效的治疗作用,将为治疗SS提供一种新的治疗方法,而其作用机制与下调BAFF分子表达密切相关。     

Local and systemic antibody response in Balb/c mice immunized with Entamoeba histolytica trophozoites.

Several immunization schedules with E. histolytica trophozoites were tested on Balb/c mice in order to induce antibody responses, both in intestinal secretions and in serum. Mice were immunized either orally, systemically, or using one of two combined schedules: the oral route followed by the systemic route (footpad), or vice versa. Each of the immunization schedules used in this project induced an anti-E. histolytica antibody response and there appears to be a correlation between the immunization route employed and the immunoglobulin isotype induced in the gut. Secretory IgA production is favored by the oral administration of trophozoites, whereas mucosal IgG appears to be enhanced by the systemic immunization route. Both schedules are effective in the induction of secretory IgA in the gut, yet higher and earlier levels of IgA appear in orally immunized mice. When systemic immunization is employed, the increase in antibody levels in the intestinal fluid is slower, and IgG is the predominant class. The combined oral/systemic routes of immunization appear to be comparably effective for the induction of local and systemic IgA and IgM antibody production. However, mice immunized first systemically and then locally produce more IgG in both compartments. Combined schedules modify the isotype pattern of antibody responses in serum and in intestinal secretions when compared with single (i.e., oral or systemic) schedules, but they do not appear to favor a secretory IgA immune response.     

麻疹疫苗及加佐剂经滴鼻免疫小鼠的抗体应答

目的：观察麻疹减毒活疫苗和灭活疫苗经滴鼻免疫小鼠后的抗体应答。方法：用活的或灭活麻疹疫苗及分别加明胶、植物血凝素(PHA)的疫苗滴鼻免疫小鼠，于末次免疫后10d取血清、唾液、呼吸道分泌物，用间接ELISA法检测特异性IgG，IgA抗体水平，并与皮下注射组及对照组进行比较。结果：各滴鼻组小鼠血清及呼吸道分泌物中均产生一定水平的特异性IgG及In抗体，皮下注射组小鼠呼吸道分泌物中未产生特异性IgA抗体；加明胶后的免疫效果优于加PHA的。结论：麻疹疫苗滴鼻免疫小鼠后可诱导全身及局部抗体应答，明胶可增强其免疫效果，而麻疹疫苗皮下注射免疫小鼠未能诱导局部抗体应答。     

Effect of immunization in mice with recombinant DNA encoding the hepatitis C virus structural protein

OBJECTIVE: To explore the possibility and the efficacy of immune responses in mice inoculated with recombinant plasmid pCD-HCV1 and to lay a foundation for HCV nucleic acid vaccine development in the future. METHODS: The gene fragment coding C and E regions of HCV-II (type I b) was inserted into pCD-SR alpha 1 expression vector and formed pCD-HCV1 and then was injected into quadriceps muscles of Balb/c mouse. Serum anti-HCV level of mice was tested by ELISA (A value). Spleen cells proliferation responses to HCV antigens were detected by 3H-TdR incorporation (cpm). RESULTS: Balb/c mice immunized with recombinant plasmid pCD-HCV1 three or four times can generate specific antibody responses to HCV antigens and the antibody levels gradually ascend to the plateaus and did not have the trend of descending in 18 weeks detected. The serum antibodies in mice immunized by recombinant plasmid pCD-HCV1 were 100 percent positive when the serum were diluted 40 times and the positive rate of antibody still were 16.6 percent positive when the serum were diluted 320 times. Balb/c mice immunized with recombinant plasmid pCD-HCV1 (100 micrograms, 50 micrograms 10 micrograms/mouse three times respectively) can elicit antibody responses to HCV antigens and the antibody levels of three groups were 0.70 +/- 0.07, 0.33 +/- 0.04 and 0.11 +/- 0.09 respectively. Spleen cells of Blab/c mice injected with pCD-HCV1 three times were induced to produce proliferation responses to HCVc + e specific antigens. CONCLUSIONS: These results demonstrated that constructs expressioning HCV core and envelope proteins can generate anti-HCVc + e specific antibody responses and lymphoproliferation responses in mice, which suggested it to be possible to elicit immune responses to viral epitopes from HCV via DNA immunization with HCV-DNA recombinant and to warrant further investigation as a potential vaccine against HCV infections.