自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤对肝星状细胞增殖活化的影响

目的 观察自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)增殖活化的影响,并探讨其作用机制.方法 体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6,设立空白对照组和3-MA低剂量组(2.5 mmol/L)、中剂量组(5 mmol/L)、高剂量组(10 mmol/L).RT-PCR分析不同浓度3-MA对HSC活化标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及Ⅰ型胶原蛋白基因表达的影响,Western blot法检测不同浓度3-MA对HSC中自噬水平标志蛋白LC3Ⅱ、α-SMA以及Ⅰ型胶原蛋白表达水平的影响;MTT法检测3-MA对HSC增殖的影响,流式细胞术分析3-MA对HSC细胞周期的影响.结果 低、中、高剂量3-MA作用于HSC后,HSC-T6细胞自噬水平随3-MA浓度升高逐渐下降,α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白mRNA相对表达量均明显低于对照组(P＜0.05),LC3Ⅱ、α-SMA以及Ⅰ型胶原蛋白相对表达量均明显低于对照组(P＜0.05).与对照组相比,低、中、高剂量时3-MA对HSC增殖的影响均显著下降(P＜0.05),G2期比例与对照组比较均明显增加(P＜0.05).结论 3-MA可下调大鼠HSC-T6细胞LC3Ⅱ的表达,抑制α-SMA及Ⅰ型胶原蛋白mRNA及蛋白的表达,使HSC-T6细胞周期停滞于G2期,抑制HSC增殖活化.     

黏着斑激酶反义寡核苷酸对肝星状细胞增殖及活化的影响

黏着斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)在肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSC)的激活过程中起重要作用.本文旨在研究FAK反义寡核苷酸(FAK antisense oligonucleotides,FAK-ASON)能否抑制体外培养的大鼠肝星状细胞的增殖及活化.用链霉蛋白酶-胶原酶原位灌注、Nycodenz密度梯度离心法分离大鼠HSC,并在体外培养使其激活后,将FAK-ASON转染至活化的HSC.应用MTT法观察HSC细胞增殖的变化,并用RT-PCR、Western blot观察HSC活化的标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达的变化.MTT结果显示FAK-ASON可明显抑制活化HSC的增殖;FAK-ASON处理48 h后,HSC α-SMA mRNA及蛋白的表达亦明显下降.结果进一步提示FAK在HSC激活过程中的作用,而FAK-ASON有可能成为潜在的抗肝纤维化治疗药物.     

CKS2 shRNA慢病毒表达载体的构建及其抑制卵巢癌A2780细胞增殖

目的构建靶向CKS2的shRNA慢病毒表达载体,并探讨CKS2敲除对卵巢癌细胞A2780增殖的影响。方法根据siRNA原理设计两对靶向CKS2的shRNA序列(shRNA1、shRNA2)及阴性对照NC shRNA,并克隆到慢病毒表达载体PLKO.1/puro中;将上述质粒转染到293T细胞并包装出慢病毒,用慢病毒感染卵巢癌细胞A2780,实时定量PCR及Western blot检测CKS2表达;MTT法检测A2780细胞增殖;Western blot检测PARP-1的剪切;流式细胞术检测凋亡。结果成功构建CKS2 shRNA慢病毒表达载体能明显降低A2780细胞中CKS2 mRNA及蛋白表达(P0.05);能显著抑制A2780靶向CKS2的shRNA慢病毒表达载体,并包装出慢病毒;感染A2780细胞后,细胞增殖受抑(P0.05);能诱导PARP-1蛋白的剪切及凋亡(P0.05)。结论成功构建靶向CKS2的shRNA慢病毒表达载体,能显著抑制A2780细胞增殖。     

敲低肝癌细胞STAT3抑制IFN1诱导的HepG2肝癌细胞增殖和迁移

目的筛选并制备信号转导子与转录激活子3短发夹RNA(STAT3 shRNA)慢病毒,感染Hep G2肝癌细胞抑制其STAT3表达,观察对1型干扰素(IFN1)诱导的肝癌细胞增殖和迁移的影响及机制。方法设计并合成4段人STAT3基因的干扰序列(STAT3 shRNA 1~STAT3 shRNA 4)以及对照序列(Ctrl shRNA),与p LKO.1-sp6-pgk-GFP连接构建慢病毒表达载体,随后与骨架质粒ps PAX2、p MD2.G共转染HEK293T细胞制备慢病毒并感染Hep G2细胞。Western blot法检测STAT3的蛋白水平,筛选有效序列。敲低STAT3水平后,CCK-8法检测Hep G2细胞的增殖,TranswellTM迁移和划痕实验检测Hep G2细胞的迁移。同时观察2000 U/m L重组人IFNα2b诱导的肝癌细胞增殖、迁移能力的变化,Western blot法检测IFN相关STAT1信号的磷酸化水平。结果筛选对STAT3敲低效果最显著的STAT3 shRNA1和STAT3 shRNA2,敲低STAT3水平后,肝癌细胞增殖和迁移降低。2000 U/m L IFNα2b对细胞的增殖抑制作用更显著,迁移细胞的数量显著下降。敲低STAT3水平后,肝癌细胞STAT1的磷酸化水平升高,在IFNα2b处理后STAT1磷酸化水平进一步升高。结论敲低肝癌细胞STAT3通过上调STAT1信号通路活化,抑制细胞的迁移、增殖,恢复IFN在肝癌细胞中的应答。     

Nrf2过表达对乙醇刺激下肝星状细胞激活与增殖及合成I型胶原的影响

 目的：探讨核因子E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2）过表达对乙醇诱导下大鼠肝星状细胞系HSC-T6激活与增殖及I型胶原mRNA及蛋白表达水平的影响。方法：采用脂质体介导法对HSC-T6进行pEGFP-Nrf2重组质粒及pEGFP-N1空载质粒瞬时转染,将细胞分为正常对照组、乙醇刺激组、乙醇刺激+pEGFP-Nrf2质粒组和乙醇刺激+ pEGFP-N1空载质粒组。采用RT-PCR及Western blotting方法对HSC-T6中Nrf2、I型胶原及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)mRNA及蛋白表达水平进行检测,采用MTT法对HSC-T6细胞增殖水平进行检测,采用流式细胞术对HSC-T6细胞周期分布进行检测。结果：(1) 荧光显微镜下观察显示pEGFP-Nrf2质粒成功转染HSC-T6,转染后48h Nrf2 mRNA及蛋白表达水平较其余组显著升高（P＜0.05）。(2) 乙醇刺激组与乙醇刺激+ pEGFP-N1空载质粒组之间细胞增殖水平、I型胶原、α-SMA mRNA及蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）,均明显高于正常对照组（P＜0.05）,细胞周期分布G1期比例下降,S期比例升高（P＜0.05）,而乙醇刺激+ pEGFP-Nrf2质粒组细胞增殖水平及I型胶原、α-SMA mRNA及蛋白表达水平与乙醇刺激组及乙醇刺激+ pEGFP-N1空载质粒组相比均显著下降（P＜0.05）,细胞周期分布G1期比例显著上升,S期比例显著下降（P＜0.05）,呈G1/S期阻滞。结论：Nrf2过表达可显著抑制乙醇对HSC-T6 I型胶原及α-SMA mRNA及蛋白表达的促进作用,使HSC-T6细胞周期发生G1/S期阻滞,抑制乙醇诱导的HSC-T6增殖水平的升高,提示其对乙醇诱导的HSC-T6细胞活化具有负性调控作用。     

短发夹状RNA特异性抑制HeLa细胞的Hax-1基因表达

目的:构建靶向Hax-1基因的短发夹状干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体pGenesil-Hax-1,并探讨siRNA靶向抑制Hax-1基因表达的作用。方法:根据shRNA设计的原则,在Hax-1全长序列中选取含19个核苷酸靶序列,设计形成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pGenesil-1中,获得可靶向抑制Hax-1基因的重组shRNA表达载体。采用LipofectamineTM2000转染试剂将pGenesil-Hax-1导入HeLa细胞中;分别采用RT-PCR以及Western blot从mRNA和蛋白水平上检测干扰效果。结果:半定量PCR及Western blot结果表明,siRNA可使Hax-1mRNA的转录水平得到显著抑制(P<0.01),Hax-1蛋白的表达较对照组减少约70%。结论:靶向Hax-1基因的重组shRNA表达载体pGene-sil-Hax-1介导的siRNA可显著抑制Hax-1基因在人宫颈癌HeLa细胞中的表达。     

CIP2A shRNA真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖的抑制作用

目的构建靶向CIP2A的shRNA真核表达质粒并探讨其对胃癌细胞增殖的调节作用。方法根据siRNA原理设计4对靶向CIP2A的siRNA序列,克隆到真核表达载体p GPU6/GFP/Neo中(shRNA-1、2、3和4)。脂质体转染人胃癌细胞系BGC-823,real-time PCR和Western blot法检测并筛选最佳抑制效率的shRNA表达质粒,CCK-8法检测对胃癌细胞增殖的影响。结果 4个靶向CIP2A的shRNA真核表达质粒经限制性酶切和测序证实基因已正确插入,转染效率可达到70%以上。转染后24、48和72 h,4个质粒均明显降低BGC-823细胞内CIP2A mRNA和蛋白的表达。相较于其他3个重组质粒,shRNA-1的抑制作用更为显著,且对胃癌细胞增殖有明显的抑制作用(P0.05)。结论成功构建的靶向CIP2A的shRNA真核表达质粒,可有效抑制胃癌细胞CIP2A的mRNA和蛋白表达,并抑制胃癌细胞的增殖,为今后研究CIP2A在胃癌中的作用机制奠定了基础。     

稳定表达可诱导型CKS2 shRNA的卵巢癌OVCAR3细胞系的建立与鉴定

目的建立稳定表达可诱导型CKS2 shRNA的卵巢癌OVCAR3细胞系并研究CKS2敲除对卵巢癌OVCAR3细胞增殖的影响。方法根据siRNA的原理设计2对靶向CKS2的shRNA序列,构建慢病毒表达质粒(p LVTHM/CKS2 shRNA重组质粒);先用p LV-t TR/KRAB-Red空载体制备慢病毒并感染OVCAR3细胞;在此基础上再用p LVTHM/CKS2 shRNA重组质粒制备慢病毒并感染上述OVCAR3细胞;对上述两次慢病毒感染的OVCAR3细胞,用强力霉素(DOX)处理72 h后,用real time PCR及Western blot检测CKS2 mRNA及蛋白的表达;用MTT法检测细胞增殖。结果构建靶向CKS2的shRNA慢病毒表达质粒,包装出慢病毒并感染OVCAR3细胞;建立稳定表达可诱导型CKS2 shRNA的OVCAR3细胞系,通过DOX诱导,可明显抑制该细胞系中CKS2在mRNA及蛋白水平的表达(P0.05,P0.01);CKS2敲除可明显抑制OVCAR3细胞的增殖。结论建立稳定表达可诱导型CKS2 shRNA的OVCAR3细胞系,DOX诱导的CKS2敲除可明显抑制OVCAR3细胞增殖。     

RGDyK环肽对肝星状细胞增殖和迁移的影响

目的：探讨RGDyK环肽对活化肝星状细胞中整合素αvβ3表达和细胞迁移的影响。方法分离SD大鼠肝星状细胞,体外传代培养诱导细胞活化,用人工合成的整合素αvβ3特异配基RGDyK环肽处理肝星状细胞,MTT法计算其生长抑制率,通过免疫化学和荧光染色,RT-PCR和Western Blot分析,与对照组比较肝星状细胞中整合素αvβ3和α-SMA的表达变化,划痕实验观察RGDyK环肽对活化肝星状细胞迁移的影响。结果与对照组相比,RGDyK环肽抑制肝星状细胞增殖并有明显的量效关系, RGDyK环肽下调肝星状细胞中整合素αvβ3和α-SMA的在mRNA和蛋白质水平的表达（P<0.05）,降低肝星状细胞的迁移率（P<0.01）。结论 RGDyK环肽抑制肝星状细胞增殖、收缩和迁移等生物行为与下调活化肝星状细胞整合素αvβ3表达有关。     

EIF3D shRNA对乳腺癌细胞增殖、凋亡与侵袭能力的影响

目的探讨真核起始因子3D(EIF3D)shRNA对乳腺癌细胞增殖、凋亡与侵袭能力的影响。方法设计靶向EIF3D的shRNA序列,构建稳定沉默EIF3D的慢病毒载体,感染乳腺癌细胞MCF-7,同时设立阴性对照组与未处理组。qPCR和Western blot方法测定沉默效果,MTT方法测定感染后MCF-7细胞增殖能力变化,流式细胞术测定感染后MCF-7细胞凋亡率,Transwell侵袭实验检测感染后MCF-7细胞侵袭能力变化,Western blot方法测定感染后MCF-7细胞中Cyclin B1、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)与Caspase-3的表达变化。结果感染EIF3D shRNA后,MCF-7细胞EIF3D的蛋白与mRNA表达均显著降低,提示稳定沉默EIF3D细胞株模型成功建立。沉默EIF3D能够显著抑制MCF-7细胞的增殖与侵袭能力,诱导细胞凋亡,下调Cyclin B1与MMP-2的蛋白表达,上调Caspase-3的表达(P0.01)。结论下调EIF3D能够抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖与侵袭能力,并诱导细胞凋亡。