FRNK抑制体外肝星状细胞增殖

目的用FRNK表达质粒瞬时转染FN诱导的HSCs,探讨FRNK对HSCs增殖的影响。方法在脂质体介导下用FRNK表达质粒瞬时转染HSCs,用改良的MTT技术测定细胞增殖,用Western blot及RT-PCR技术检测各指标蛋白及mRNA表达。结果与nFRNK组相比,FRNK在FN诱导的HSCs中大量表达后,于12、24和48h的增殖抑制率分别为20.07%、26.16%和29.77%（P〈0.01）;FRNK抑制FAK磷酸化和ERK1、p-ERK的表达,而FN则促进FAK、ERK1和p-ERK表达。结论在脂质体介导下瞬时转染FRNK表达质粒,可时间依赖性的抑制HSCs增殖;FAK-ERK信号传导通路可能参与了该过程。     

黏着斑激酶相关非激酶质粒转染对肝星状细胞凋亡的影响

目的：应用黏着斑激酶相关非激酶（FRNK）表达质粒瞬时转染肝星状细胞（HSCs），探讨FRNK选择性抑制黏着斑激酶(FAK)磷酸化对FN刺激的HSCs凋亡的影响。方法:在体外培养HSCs，以FN刺激HSCs增殖，采用脂质体介导的方法进行FRNK表达质粒转染。应用膜联蛋白（Annexin-V）/碘化丙啶（PI）双标记流式细胞术、DNA凝胶电泳技术和透射电镜技术检测细胞的凋亡，Western blotting及RT-PCR方法检测FRNK、FAK、p-FAK（Tyr397）、caspase-3蛋白及其mRNA表达。结果:FRNK表达质粒成功转染HSCs，在翻译后水平抑制FAK磷酸化；FRNK表达质粒转染HSCs 48 h后，细胞凋亡率增加，与空质粒组之间有显著差异［（25.37±1.92）% vs（9.28±1.05）%］，P<0.01，伴随caspase-3在翻译和转录水平的增高［（264.17±12.60 vs 185.82±9.69），P<0.01；（4.19±0.48 vs 1.07±0.27），P<0.01］。结论:在脂质体介导下瞬时转染FRNK表达质粒，可使外源性的FRNK在HSCs内大量表达，在翻译后水平抑制FAK磷酸化；可以诱导FN刺激的HSCs发生凋亡。     

FRNK质粒转染抑制肝星状细胞胶原合成

目的：探讨黏着斑激酶相关非激酶（FRNK）对纤维连接蛋白（FN）刺激的肝星状细胞（HSCs）胶原合成的影响。方法:应用体外细胞培养技术,脂质体介导法进行FRNK质粒瞬时转染;采用Western blotting方法测定FRNK蛋白在HSCs的表达,鉴定转染效果;［3H］-Pro掺入法检测HSCs总胶原和Ⅰ型胶原的合成能力。结果:FRNK质粒成功转染HSCs,于转染48 h时FRNK蛋白表达最强（P<0.05）;在FRNK转染HSCs 48 h后总胶原合成能力（498.17±73.20）较空质粒组（748.33±61.30）显著下降（P<0.01）;在FRNK转染HSCs 48 h后 Ⅰ型 胶原合成能力（163.17±23.80）较空质粒组（371.58±15.44）亦显著下降（P<0.01）。结论:FRNK可以使HSCs总胶原和Ⅰ型胶原合成能力降低,提示其对肝星状细胞胶原合成功能具有负调控作用。     

OPN促进大鼠肝星状细胞黏附、迁移及黏着斑激酶活性

目的探讨细胞外间质(ECM)成分骨桥蛋白(OPN)和精-甘-天冬-丝氨酸(Arg-G ly-Asp-Ser,RGDS)四肽对大鼠肝星状细胞(HSCs)黏附、迁移与黏着斑激酶(FAK)活性的影响。方法应用体外细胞培养技术,MTT法检测HSCs增殖,甲苯胺蓝法检测HSCs黏附情况,并观察HSCs迁移;采用免疫沉淀和W estern b lot技术测定黏着斑激酶活性变化。结果①不同浓度OPN和RGDS四肽作用于HSCs 2 h后,8、16、32 mg/L OPN组细胞黏附促进率均高于对照组(P<0.05);25 mg/L~100 mg/L RGDS四肽不同浓度组细胞黏附率明显下降(P<0.05)。②不同浓度OPN干预细胞48 h后,促进HSCs增殖,而RGDS四肽组抑制HSCs增殖。③16 mg/L OPN作用12、24和36 h,细胞迁移距离显著高于对照组(P<0.05);而100 mg/L RGDS四肽组则显著性低于对照组(P<0.05)。④经OPN作用后各浓度组HSCs中磷酸化FAK均有显著表达;RGDS四肽干预后,磷酸化FAK表达量降低。结论①OPN促进HSCs增殖、黏附和迁移;RGDS四肽对HSCs增殖、黏附和迁移具有抑制作用。②OPN可以诱导FAK活化,RGDS四肽可抑制磷酸化FAK的表达。     

大鼠肝纤维化过程中肝组织黏着斑激酶表达增加

本研究采用胆总管结扎 (BDL)方法建立大鼠肝纤维化模型 ,应用免疫组织化学、Westernblotting技术及逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)方法 ,研究了FAK及其mRNA在肝纤维化不同时期肝组织中的分布及含量的动态变化 ;用免疫组织化学方法测定α 平滑肌肌动蛋白 (α SMA)表达。结果显示 :正常肝组织有少量α SMA、FAK分布 ,随着肝纤维化发展 ,α SMA、FAK阳性细胞明显增多 ;正常大鼠肝组织中亦有FAK蛋白、FAKmRNA表达 ,造模 4周表达最多。FAK与α SMA呈显著正相关 (r=0.96 3,P <0.0 5 )。提示肝纤维化形成过程中FAK及其mRNA表达明显增加 ,FAK在HSCs增殖及肝纤维化形成过程中发挥作用     

FAK基因沉默诱导白血病细胞凋亡

目的:本研究靶向黏着斑激酶(FAK)基因,构建FAK-shRNA慢病毒载体,并研究FAK基因沉默对白血病细胞生长的影响。方法:化学合成人FAK基因的shRNA序列,应用分子生物学方法将该FAK shRNA序列插入含荧光素GFP慢病毒质粒。该FAK shRNA慢病毒载体在体外包装、浓缩,然后转染至人白血病细胞株。应用逆转录聚合酶链反应及蛋白质印迹方法检测FAK基因表达水平,予Annexin V标记检测细胞凋亡的情况。结果:经核苷酸序列分析提示FAK shRNA正确插入慢病毒质粒,该病毒载体在白血病细胞株的转染率为10%-25%。与对照组相比(无FAK shRNA的慢病毒载体),FAK shRNA慢病毒载体在细胞FAK mRNA及蛋白水平的抑制率分别为40%和70%。凋亡实验表明,对照组与FAK shRNA慢病毒载体组的Annexin V阳性率分别为(4.19±0.36)%和(8.48±0.58)%,两者差异明显(P0.05)。结论:我们成功构建FAK shRNA慢病毒载体,该载体能抑制FAK基因表达并诱导白血病细胞凋亡。     

膜型基质金属蛋白酶-1在黏着斑激酶相关非激酶调控肝星状细胞胶原代谢中的作用

目的： 探讨黏着斑激酶相关非激酶（FRNK）对纤维连接蛋白（FN）刺激的肝星状细胞（HSC）膜型基质金属蛋白酶-1（MT1-MMP）表达的影响并探讨MT1-MMP在FRNK调控HSC胶原代谢中的作用。方法：应用体外细胞培养技术,脂质体介导法进行FRNK质粒瞬时转染;采用Western blotting法测定FRNK蛋白在瞬时转染时相应的表达,鉴定转染效果;分别应用Western blotting和RT-PCR方法测定MT1-MMP在HSC中的相应表达。结果：FRNK质粒成功转染HSC,于转染48 h时,FRNK蛋白表达最强,P<0.05;FRNK转染后在基因水平上：MT1-MMP mRNA表达明显增加;翻译蛋白水平上：FRNK质粒转染HSC 48 h后,MT1-MMP蛋白表达量显著升高。结论：脂质体介导下FRNK质粒转染,可使外源性FRNK在HSC内大量表达,FRNK可能通过上调MT1-MMP值来抑制HSC胶原合成。     

RNA干扰抑制肝星状细胞CTGF表达对细胞外基质分泌的影响

目的：利用pEGFP质粒载体构建介导结缔组织生长因子(CTGF)短发夹RNA表达的质粒，筛选有效的抑制序列后，研究其对HSC-T6中TGF-β₁、CTGF及细胞外基质表达的影响。方法:1.分别设计3对针对CTGF的有小发夹结构的两条DNA序列及1对非特异对照序列，构建重组体成功后转染HSC-T6，24 h后通过RT-PCR及Western blotting分析HSC-T6 CTGFmRNA及蛋白表达水平，筛选出有效抑制CTGF表达的序列。2.将已构建并筛选出有最高抑制效率的pEGFP-CTGFshRNA转染HSC-T6 ，培养24、48 h后用RT-PCR和/或Western blotting检测各组细胞中TGF-β₁、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因的表达;放免法分析细胞上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量。结果:将构建成功的3组pEGFP-CTGFshRNA转染肝星状细胞后，筛选出两组能高效抑制CTGF表达的序列; pEGFP-CTGFshRNA能明显抑制HSC-T6 CTGF、Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA及蛋白的表达，降低上清液中Ⅲ型前胶原、IV型胶原、透明质酸和层黏连蛋白的含量(P<0.01或P<0.05)，而对TGF-β₁的基因表达则无影响。结论:pEGFP-CTGFshRNA能高效抑制肝星状细胞中CTGF及细胞外基质的表达;CTGFshRNA介导的RNA干扰有望对慢性肝病所致肝纤维化具有治疗潜力。     

FAK基因沉默增强白血病细胞对化疗药物敏感性

目的: 本实验研究黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)基因沉默对白血病细胞化疗药物敏感性的影响。方法: 构建FAK shRNA慢病毒载体,转染至BCR/ABL-BaF3白血病细胞株,通过蛋白质印迹方法检测FAK蛋白表达情况。 体外应用不同浓度的化疗药物伊马替尼处理BCR/ABL-BaF3细胞,予Annexin V标记检测细胞凋亡情况。建立白血病动物模型,联合应用FAK shRNA及伊马替尼进行处理,观察小鼠生存情况,分析白血病细胞在小鼠骨髓及脾脏的分布情况。结果: 成功建立FAK shRNA慢病毒载体,该载体能有效沉默FAK基因表达。体外实验发现5 μmol/L 伊马替尼处理时,空白对照组与FAK基因沉默组中Annexin V阳性细胞百分比分别为(9.76±1.97%和(21.90±3.20%,差异显著(P<0.05);予50 μmol/L 伊马替尼处理时,2组中Annexin V阳性细胞百分比分别为(56.10±6.00)%和(82.10±5.70)％,差异显著(P<0.05)。白血病动物实验中,与空白对照组相比,生存分析结果显示FAK基因沉默组小鼠的生存时间明显延长。白血病细胞输注后第60 d,与空白对照组相比,白血病细胞在FAK基因沉默组小鼠骨髓和脾脏的分布明显减少。结论: FAK基因沉默能明显增强白血病细胞对化疗药物敏感性,提示FAK基因沉默有望成为白血病治疗的新策略。     

腺病毒介导的shRNA下调PTEN表达对活化肝星状细胞骨架蛋白F-actin的影响

目的:探讨腺病毒介导的shRNA下调第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN)基因表达对体外培养的活化肝星状细胞(HSC)纤丝状肌动蛋白(F-actin)的影响。方法:体外培养大鼠活化HSC(HSCT6),将携带靶向PTEN的RNA干扰序列[短发夹RNA(shRNA)]并表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒AdshRNA/PTEN及仅表达GFP的对照空病毒Ad-GFP转染HSC,实时荧光定量PCR及Western blotting实验检测HSC的PTEN mRNA及蛋白表达;利用激光扫描共聚焦显微镜检测HSC的形态、F-actin的分布及荧光强度、伪足以及应力纤维的变化,并采用钙荧光探针Rhod-2/AM负载检测HSC内Ca~(2+)浓度的变化。实验分为对照(control)组(在腺病毒转染步骤以DMEM代替腺病毒液)、Ad-GFP组(转染表达GFP的空病毒Ad-GFP)和Ad-shRNA/PTEN组(转染重组腺病毒Ad-shRNA/PTEN)。结果:靶向PTEN的shRNA成功转染体外活化HSC,显著下调HSC的PTEN mRNA及蛋白表达(P0.05);PTEN表达下调使活化HSC呈星形向四周伸展,F-actin排列紧密规则,数量增多,伪足充分向外伸展,应力纤维丝增长增粗;Ad-shRNA/PTEN组F-actin的荧光强度较control组及Ad-GFP组显著增强(P0.05),而control组与Ad-GFP组间差异无统计学显著性;Ad-shRNA/PTEN组HSC内Ca~(2+)浓度较control组及Ad-GFP组明显升高(P0.05),而control组与Ad-GFP组间差异无统计学显著性。结论:PTEN表达下调使体外活化肝星状细胞骨架蛋白F-actin的形成及细胞骨架的重构增强,并增加了HSC内的Ca~2浓度。     

腺病毒介导的shRNA下调PTEN表达对体外活化肝星状细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨腺病毒介导的shRNA下调第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)表达对体外培养的大鼠活化肝星状细胞(HSCs)增殖和凋亡的影响及其信号转导机制。方法:体外培养活化HSCs,以腺病毒为载体将靶向PTEN的shRNA干扰重组体转染至体外活化的大鼠HSCs;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HSCs增殖;末端转移酶标记技术(TUNEL)及流式细胞术测定HSCs凋亡;Western blotting方法检测PTEN、Bax、Bcl-2、Akt、p-Akt、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表达情况;实时荧光定量PCR方法检测PTEN、Akt及ERK1 mRNA表达情况。结果:(1)靶向PTEN的RNA干扰重组腺病毒成功感染体外活化HSCs,并在一定范围内呈时间依赖性地促进HSCs增殖,腺病毒感染HSCs后72 h,HSCs凋亡率显著下降(P<0.05);(2)Bax表达降低,Bcl-2表达增加(P<0.05);(3)p-Akt和p-ERK1/2蛋白表达显著增加(P<0.05);而Akt蛋白及其mRNA、ERK1蛋白及其mRNA表达均无显著改变(P>0.05)。结论:RNA干扰下调PTEN基因表达可能通过Bcl-2/Bax途径促进体外活化HSCs增殖并抑制其凋亡,此外,RNA干扰下调PTEN基因表达促进p-Akt和p-ERK1/2表达增多,提示PTEN可能通过影响PI3K/Akt和ERK1/2信号通路而在调控HSCs增殖和凋亡中发挥重要作用。     

罗格列酮对肝星状细胞的生物学特性及PDGF表达的影响

目的 观察罗格列酮对体外培养的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)增殖、凋亡、细胞周期、超微结构及表达α-SMA、PDGF-B的影响.方法 MTT法检测罗格列酮对HSC增殖的影响;流式细胞仪(FCM)检测罗格列酮对HSC细胞周期和凋亡率的影响;免疫组化SABC法检测罗格列酮对HSC表达α-SMA、PDGF-B的影响;电镜观察罗格列酮对HSC超微结构的影响.结果 MTT法检测显示罗格列酮对HSC的增殖具有抑制作用,抑制率随着罗格列酮浓度的增加而增加;FCM检测:罗格列酮作用后,HSC的凋亡率、G0/G1期细胞比例均随着浓度的增加而增加,各浓度组凋亡率的增加均具有显著性意义(P<0.01);免疫组化染色显示HSC中α-SMA、PDGF-B的表达水平随着罗格列酮浓度的增加而减少,且两者的表达具有紧密相关性(r=0.971);电镜观察显示HSC的生长状态受到抑制,部分细胞呈现凋亡相关的超微结构改变.结论 罗格列酮能抑制HSC的增殖、活化,其作用机制可能与阻滞HSC于G0/G1期、诱导HSC凋亡及降低HSC的PDGF表达有关.     

Hepatic angiomyolipoma and hepatic stellate cells share a similar gene expression profile

BACKGROUND AND AIMS: Angiomyolipomas (AMLs) of the liver are rare neoplasms composed of large epithelioid cells with intermixed fat and blood vessels. Hepatic AMLs have no clear normal-cell counterpart in the liver. However, AMLs and stellate cells both are positive for neural crest-derived markers including HMB-45 antigen. METHODS: To further explore the similarities between hepatic AMLs and stellate cells, gene expression of a hepatic AML was studied by cDNA microarray. Real-time polymerase chain reaction was used to confirm gene expression. Hepatic stellate cells can be quiescent, activated, or have a myofibroblastic phenotype depending on their state of activation. Expression of known markers of activated stellate cells was compared between the AML, activated primary mouse stellate cells, and stellate cell lines with activated and myofibroblastic phenotypes. Next, 5 novel genes from the AML were selected because they were not previously known to be markers of stellate cells and mRNA expression measured in the activated mouse stellate cells and in myofibroblastic stellate cell lines. Finally, expression levels of 10 novel genes were determined in 5 cirrhotic and 5 noncirrhotic human livers. RESULTS: Overexpression of known markers of activated stellate cells including transforming growth factor beta (TGF- beta ), smooth muscle actin, and collagen was found in the hepatic AML. Three of 5 novel markers that were identified in the AML, RRAD (Ras-related associated with diabetes), CTSK (cathepsin K), and NIBAN were also found to be overexpressed in activated stellate cells compared with quiescent or myofibroblastic stellate cells. In addition, 9 of 10 novel genes overexpressed in AML were also overexpressed in cirrhotic human livers versus noncirrhotic livers. CONCLUSIONS: Hepatic AMLs share a similar gene expression profile and may differentiate toward activated stellate cells.     

肝星状细胞活化增殖和凋亡及奥曲肽的影响

背景：肝星状细胞的活化增殖在肝硬化的发生发展中起关键作用,临床广泛应用的生长抑素衍生物奥曲肽有多种生物学效应,但它对肝星状细胞的活化增殖及凋亡有何影响尚不清楚。 目的：观察奥曲肽对大鼠肝星状细胞增殖和凋亡的影响。 方法：实验选用肝星状细胞株HSC-T6的传代细胞。MTT法检测不同浓度(1×10^-2,1×10^-3,1×10^-4,1×10^-5,1×10^-6,0 mmol/L)奥曲肽干预24,48,72 h对肝星状细胞增殖的影响;TUNEL凋亡检测试剂盒荧光显微镜方法检测不同浓度(0,1×10^-5,1×10^-2 mmol/L)奥曲肽干预24 h对肝星状细胞凋亡的影响。 结果与结论：奥曲肽浓度越高、作用时间越长对培养的肝星状细胞增殖抑制越明显,呈现浓度和时间依赖性;奥曲肽对培养的肝星状细胞凋亡随奥曲肽浓度的增加而增加。结果可见奥曲肽对培养的肝星状细胞增殖抑制呈浓度 (0~10^-2 mmol/L)和时间(24,48,72 h)依赖性,并能诱发其凋亡。     

前梯度蛋白2干扰质粒的构建及其对鼻咽癌细胞生物学功能的影响

目的:构建前梯度蛋白2(AGR2)基因干扰重组质粒及建立AGR2基因沉默的鼻咽癌细胞及动物模型,检测AGR2对鼻咽癌细胞的生物学功能的影响。方法:首先以real-time PCR和Western blot验证AGR2在鼻咽癌细胞系5-8F和6-10B中的表达,以高表达AGR2的5-8F细胞作为干扰转染的目标细胞;设计及构建shRNA表达载体pSR-GFP/Neo-AGR2-shRNA,将其转染至5-8F鼻咽癌细胞系中,通过Transwell小室迁移及侵袭实验来检测其迁移和侵袭功能的变化。结果:与6-10B细胞比较,AGR2在5-8F中的表达显著上调(P0.05);干扰鼻咽癌细胞5-8F中的AGR2可使细胞迁移和侵袭功能明显减弱(P0.05),使其体外成瘤能力显著降低(P0.05)。结论:AGR2在鼻咽癌细胞系5-8F中明显高表达;pSR-GFP/Neo-AGR2-shRNA可成功干扰5-8F中AGR2的表达;AGR2可抑制5-8F细胞的迁移、侵袭及体内成瘤能力。     

靶向着丝粒蛋白A的小RNA干扰对肝癌细胞株HepG2细胞生物学行为的影响

目的 研究靶向着丝粒蛋白A(CENP-A)的siRNA对肝癌细胞株HepG2细胞生物学行为的影响.方法 设计并合成三对CENP-A编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,通过定向克隆至载体pSilencerTM 2.1-U6 neo,构建siRNA真核表达质粒,经稳定转染HepG2细胞后检测肝癌细胞中CENP-A基因mRNA及蛋白质表达的抑制情况;通过观察HepG2细胞生长、凋亡、细胞周期和平板克隆形成能力评价CENP-A基因干扰对细胞生物学行为的影响;通过检测bcl-2、Bax、p21waf1、mdm2、p53蛋白表达水平初步探讨CENP-A生物学作用的可能机制.结果 三对靶向CENP-A的siRNA干扰片段中有二对抑制效果明显.与未转染组及空载体组相比,转染CENP-A干扰片段的细胞生长减慢,平板克隆形成率下降.细胞周期检测显示,G1期阻滞(P＜0.01),S期细胞比例减少(P＜0.001).细胞凋亡比例增加(P=0.003),并伴随bcl-2蛋白表达明显下降(P=0.000),Bax蛋白表达明显增高(P=0.001).还可致p21waf1表达增高,mdm2表达下降,但对野生型p53表达未显示明显影响.结论 CENP-A通过参与细胞周期调控而密切相关于细胞恶性增殖和凋亡抑制,其机制可能涉及野生型p53非依赖性通路和凋亡相关基因bcl-2Bax的表达异常.     

逆转录病毒介导的反义c-myb对肝星状细胞增殖及Ⅰ型胶原基因表达的影响

目的:探讨反义c-mybRNA对体外培养的肝星状细胞(HSC)增殖及Ⅰ型胶原mRNA表达的影响。方法:构建含有反向c-myb基因片段的重组逆转录病毒载体pDOR-myb, 将其导入包装细胞PA317中, 收获含病毒的培养上清, 进一步感染体外培养的大鼠HSC, 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞增殖反应, 采用半定量RT-PCR检测c-myb、α₁-Ⅰ型胶原mRNA表达。结果:成功分离培养大鼠HSC, 感染pDOR-myb病毒的HSC自身c-myb表达、细胞增殖及α-Ⅰ型胶原mRNA表达显著受抑。结论:c-myb在HSC激活增殖过程中起重要作用, 反义c-myb基因能抑制HSC增殖及Ⅰ型胶原基因表达, 这提示抑制c-myb表达可能是防治肝纤维化的有效途径。