质粒介导的RNAi抑制端粒酶活性

为了探讨靶向人端粒酶反转录酶（hTERT）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体是否具有抑制HeLa细胞端粒酶活性的能力，人工合成2条64个核苷酸（nt）的片段，其中19nt与hTERT基因1789-1807位碱基同源，将其退火、连接到质粒psUPER中，构建psUP—hTE。在psUP—hTE基础上，把该质粒的启动子和64nt插入片段酶切、克隆到质粒pEGFP—C1中生成pEGFP—hTE。从而获得新霉素抗性筛选质粒。将pEGFP—hTE用脂质体转染HeLa细胞，G418筛选后获得抗性克隆并将其收获、传代，用不同方法检测hTERT的mRNA和蛋白表达水平、HeLa细胞的端粒酶活性以及细胞的增殖能力。结果显示，pEGFP—hTE转染的HeLa细胞与对照组比较，hTERT的mRNA水平下降及蛋白表达减少、细胞端粒酶活性降低38％，但细胞增殖能力没有明显改变。以上结果表明，pEGFP—hTE能通过RNA干扰（RNAi）途径特异性抑制HeLa细胞hTERT基因的表达，从而有效抑制细胞端粒酶话性，这可能将为肿瘤生物治疗提供一条新的途径。     

hTERT基因反义核酸对Raji细胞端粒酶活性的影响

目的:观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASODN)对Raji细胞端粒酶活性的影响。方法: 端粒酶聚合酶链反应-酶联免疫测定法检测Raji细胞的端粒酶活性；采用逆转录-聚合酶链反应方法检测hTERT基因mRNA的表达水平；以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达含量的变化。结果:hTERTASODN作用于Raji细胞后，hTERTmRNA表达水平明显降低，ASODN与Raji细胞共同孵育48h，hTERT蛋白表达阳性率降为50.15%±3.49%，72hhTERT蛋白表达阳性率降为33.35%±2.75%。而hTERT正义核酸作用24、48、72h对hTERT蛋白表达阳性率(65%)无显著影响(P＞0.05)。hTERT基因ASODN作用于Raji细胞48h，其端粒酶活性明显降低，作用72h，端粒酶活性明显受到抑制，分别与正义寡核苷酸组、空白对照组相比有显著差异(P＜0.05)。结论:hTERT基因反义寡核苷酸特异性地抑制Raji细胞的端粒酶活性。     

端粒酶逆转录酶及c-myc基因反义寡核苷酸对HL-60细胞端粒酶活性的影响

目的研究端粒酶逆转录酶（hTERT）与c-myc基因反义寡核苷酸（ASODN）对HL-60细胞端粒酶活性的影响,探讨HL-60细胞端粒酶活性与hTERT和c-myc基因表达的关系。方法应用反义寡核苷酸（ASODN）分别封闭HL-60细胞hTRET与c-myc基因,RT-PCR方法检测基因表达;分别使用TRAP-ELISA法、PAGE-银染法检测细胞端粒酶活性。结果ASODN作用细胞72h后。hTERT、c-mycmRNA的表达受到不同程度抑制。以30μmol／L作用组表达量最低。TRAP-ELISA检测：hTERT ASODN10、20、30μmol／L作用组,c-myc ASODN20、30μmol／L作用组与未作用组比较,端粒酶活性明显降低（P〈0．05）;c-myc ASODN 10μmol／L作用组及c-myc、hTERTSODN作用组与未作用组比较无显著差异（P〉0．05）。PCR-PAGE检测：hTERT与c-myc ASODN作用组较SODN作用组端粒酶条带明显减少,以30μmol／L作用组条带最少,而同浓度hTERT ASODN作用组较c-mycASODN作用组条带减少。结论hTERT与c-myc基因ASODN能够分别抑制该基因mRNA的表达,同时具有下调端粒酶活性作用。     

冬凌草甲素对急性白血病HL-60细胞的增殖抑制作用及其作用机制

目的探讨冬凌草甲素对急性白血病HL-60细胞的增殖抑制作用及其作用机制。方法以不同浓度的冬凌草甲素作用于体外培养的HL-60细胞，MTr法检测细胞生长抑制率，应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，瑞氏染色法观察细胞凋亡时的形态学变化。应用PCR．ELISA及RT—PCR法检测细胞凋亡前后端粒酶活性及端粒酶hTERT mRNA表达水平的变化。结果冬凌草甲素可显著的抑制HL-60细胞的生长，诱导细胞发生凋亡，并呈现出明显的量-与时-效关系。冬凌草甲素作用48—60h后在瑞氏染色图片上可见核浓缩及核碎裂等典型的细胞凋亡特征，同时端粒酶hTERT mRNA的表达水平及端粒酶活性均明显降低。结论冬凌草甲素能抑制HL-60细胞的生长及诱导细胞发生凋亡：降低端粒酶hTERT mRNA的表达水平及端粒酶活性可能是其重要作用机制之一。     

互补于hTERT关键区段的反义RNA抑制肝癌细胞

目的研究针对人类端粒酶催化亚单位(hTERT)调控区C-MYC结合位点的反义RNA抑制肝癌细胞生长。方法细菌内同源重组构建反义RNA腺病毒(rAd-asmycb),转染HepG2.2.15肝癌细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,透射电镜下观察凋亡细胞形态,聚合酶链反应-酶联免疫分析(PCR-ELISA)、逆转录-PCR(RT-PCR)分别检测细胞端粒酶活性及mRNA水平上hTERT表达。结果反义RNA抑制肝癌细胞生长,细胞凋亡率为40.7%,显示特征性凋亡细胞形态,能够显著降低细胞端粒酶活性,在mRNA水平上抑制hTERT表达。结论hTERT调控区C-MYC结合位点可能是肝癌基因治疗的有效靶位。     

hTERT基因反义核酸对Jurkat细胞端粒酶活性影响

目的:检测hTERT基因反义核酸对Jurkat细胞端粒酶活性的影响及其机制。方法:TRAP法检测端粒酶活性,流式细胞仪检测hTERT蛋白表达,逆转录-多聚酶链式反应检测hTERTmRNA表达。结果:检测端粒酶活性,Jurkat细胞吸光度A值为0.492±0.051,hTERT反义核酸作用48hA值降为0.351±0.051,hTERT反义核酸作用72hA值降为0.238±0.024;检测hTERT蛋白表达,Jurkat细胞hTERT蛋白阳性率89.513%±3.389%,hTERT反义核酸作用48hhTERT蛋白阳性率低至77.237%±2.872%,hTERT反义核酸作用72hhTERT蛋白阳性率低至47.767%±1.326%。而hTERT正义核酸无上述作用。hTERT反义核酸作用Jurkat细胞48h、72h对hTERTmRNA表达无影响。结论:hTERT反义核酸降低Jurkat细胞端粒酶活性,机制可能是降低hTERT蛋白表达量,对hTERTmRNA无影响。     

hTR-siRNA腺病毒的构建及其体外抗肿瘤的初步研究

目的:构建RNA干扰(RNAi)腺病毒,通过体外实验观察其抑制肿瘤细胞中人端粒酶RNA(hTR)基因表达、降低瘤细胞中的端粒酶活性、以及促进肿瘤细胞凋亡等作用.方法:首先用一种新的体外连接法构建腺病毒Ad-hTR-siR-NA,表达靶向hTR的小干扰RNA分子(siRNA),用100 MOI的重组腺病毒感染不同的肿瘤细胞系,再用TRAP-ELISA法测定细胞端粒酶活性、Real-time PCR测定hTR的mRNA水平、流式细胞术(FCM)测定肿瘤细胞凋亡率及人端粒酶反转录酶(hTERT)的蛋白变化.结果:感染了Ad-hTR-siRNA的肿瘤细胞的端粒酶活性明显降低,其中以HeLa细胞降低最明显,其端粒酶活性抑制率达到58.87%,hTR的mRNA表达下调70.21%,细胞凋亡率为29.7%,但hTERT的蛋白表达并不被阻断.结论:Ad-hTR-siRNA可以有效、特异地抑制hTR基因表达,诱导体外培养的肿瘤细胞凋亡,具有抗肿瘤活性;此结果提示Ad-hTR-siRNA在肿瘤基因治疗方面具有潜在的应用价值.     

口虾蛄提取物对人鼻咽癌细胞端粒酶活性的影响

目的:研究口虾蛄提取物(EOS)对人低分化鼻咽癌细胞系(CNE-2Z)端粒酶活性的抑制作用及其可能机制。方法:MTT法检测不同浓度的EOS对CNE-2Z细胞增殖能力的影响;端粒酶重复序列扩增-酶联免疫吸附法(TRAP-ELISA)检测各组细胞端粒酶活性,RT-PCR法检测端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达,Western blotting检测c-Myc蛋白表达。结果:EOS对CNE-2Z细胞增殖具有抑制作用,且呈剂量依赖性(P0.01);EOS处理组CNE-2Z细胞端粒酶的活性、hTERT mRNA和c-Myc蛋白的表达水平均低于对照组(P0.01),也呈剂量依赖性,并且hTERT mRNA的下调与c-Myc的抑制存在相关性(P0.05)。结论:EOS可能通过下调细胞c-Myc表达而抑制了hTERT mRNA的转录,以致端粒酶的活性降低而抑制CNE-2Z细胞增殖。     

端粒酶在流感病毒诱导HeLa细胞凋亡中的作用

目的探讨端粒酶活性变化与流感病毒诱导HeLa细胞凋亡之间的关系。方法用A1亚型、B型及紫外线照射后的流感病毒分别感染HeLa细胞,在电镜下观察细胞形态,并用Annexin V-FITC染色流式细胞仪及PCR-ELISA法分别检测细胞凋亡诱导率与HeLa细胞端粒酶活性。结果B型、A1亚型流感病毒的凋亡诱导率最高达38.65%、23.94%(P<0.01),经紫外线照射后的流感病毒仍然具有一定的凋亡诱导能力;同时,HeLa细胞端粒酶活性均有所下降,其中B型流感病毒诱导后的HeLa细胞端粒酶活性下降比A1亚型更明显(P<0.01)。结论流感病毒降低肿瘤细胞的端粒酶活性,可能是其诱导肿瘤细胞凋亡的又一重要机制。     

LMP1促鼻咽癌细胞生长与端粒酶活性

为探讨EB病毒潜伏膜蛋白 1(LMP1)促鼻咽癌细胞生长作用与端粒酶活性的关系 ,用LMP1基因真核表达质粒转染鼻咽癌CNE1细胞 ;脂质体介导端粒酶反义核酸处理转染细胞 ;MTT法检测细胞增殖能力 ;原位杂交法检测端粒酶逆转录酶 (hTERT)mRNA表达 ;免疫组化法检测LMP1蛋白表达。结果显示 :转染LMP1基因的细胞增殖能力和hTERTmRNA表达水平均显著高于未转染和转染空载质粒的细胞 (均P <0 0 1)。经端粒酶反义核酸作用 4 8h ,LMP1基因转染细胞的细胞增殖能力、hTERTmRNA和LMP1蛋白表达水平均显著低于空白对照组 (均P <0 0 1) ,反义核酸和脂质体处理组上述各指标无显著变化 ;反义核酸组LMP1基因转染细胞的增殖能力和hTERTmRNA表达水平仍均显著高于未转染细胞和转染空载质粒的细胞 (均P <0 0 1)。以上结果提示 :EB病毒LMP1的促鼻咽癌细胞生长作用与端粒酶活性密切相关。     

hTERT-逆转录病毒载体构建及其介导的脐血间质干细胞基因转移研究

目的：构建hTERT-逆转录病毒载体，向脐血间质干细胞（MSCs）中导入hTERT基因，观察该基因对细胞端粒酶活性的影响，能否延长细胞的寿命以及转基因细胞的分化能力。方法: PCR法扩增出hTERT全部片段，定向克隆入pLNCX2载体。将病毒质粒导入包装细胞内，筛选阳性产毒细胞，测定病毒滴度。取病毒上清感染脐血MSCs，筛选转基因细胞。检测转染前后hTERT在mRNA水平的表达，端粒酶活性的变化，hTERT转入后对细胞增殖的影响。用5-氮杂胞苷将转基因细胞向心肌方向诱导，检测心肌特异抗体的表达。结果:用BglⅡ和NotⅠ双酶切构建质粒，证明PLNCX2-hTERT构建成功，转基因细胞的hTERT基因在mRNA水平得到表达，细胞端粒酶阳性。生长曲线显示转基因细胞增殖速度快于未转染细胞。向心肌细胞诱导后，心肌特异性抗体 α-sarcomeric actin和connexin-43均有表达。结论:在逆转录病毒介导下，外源性hTERT基因转入脐血MSCs后得到表达，激活细胞端粒酶的活性，有效延长了细胞的寿命，不影响其分化功能。