ERβ相互作用蛋白HPIP的分离及其在ERβ信号途径中的作用

目的以雌激素受体β(ERβ)AF2结构域为诱饵,采用酵母双杂交方法,从人类乳腺cDNA文库筛选的蛋白HPIP,进一步验证其与ERβ相互作用的功能。方法分别用细胞免疫荧光分析和酵母双杂交的方法筛选蛋白的细胞内定位及结合结构域的鉴定,转染293T胚胎肾细胞,利用荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性测定,检测HPIP对ER转录活性的影响。结果 HPIP的编码基因主要分布于细胞质中,HPIP与ERβAF2结构域相互作用,而不与ERβAF1和DBD相互作用,HPIP能降低ER的转录活性,而且这种抑制作用在激素存在时更显著,但是雌激素受体抑制剂存在时,HPIP反而增强ERβ的转录活性。结论 HPIP可能通过影响ERβ信号途径在乳腺癌发生、发展中起重要作用。     

比格犬ERβ1293 基因真核载体构建及在293T细胞中的表达及定位

【摘要】目的：观察比格犬Myc 标签ERβ1293重组真核表达载体在HEK293T细胞中的表达及定位。方法：以pEGFP-N1-ERβ1293重组真核表达载体为模板,PCR保真酶扩增得到ERβ1293基因编码区全长。Myc标签ERβ1293重组真核载体瞬时转染HEK293T细胞,运用蛋白质印迹技术（Western Blotting）和间接免疫荧光技术（Indirect immunofluorescence,IF）鉴定pcDNA3.1-Myc-ERβ1293在HEK293T细胞中的表达和定位情况。结果：成功构建pcDNA3.1-Myc-ERβ1293重组真核表达载体,转染至HEK293T细胞中。Western Blotting检测有蛋白条带表达,共聚焦显微镜下观察IF处理后的转染细胞,荧光定位于细胞质。结论：前期实验得到比格犬ERβ剪切异构体ERβ1293编码区序列,缺失第四外显子,导致其与配体结合能力减弱或消失,因此目的基因编码蛋白定位在细胞中发生变化。     

LRP16反馈增强ERα介导转录激活活性的研究

目的:探讨LRP16对雌激素受体α(ERα)介导转录激活活性的反馈增强作用.方法:ERα模式启动子调控的荧光素酶报告子(3×ERE-Luc)或GC富含的ER反应性LRP16启动子S10(-101bp到-14 bp)调控的荧光素酶报告子(pGL-3-S10)与雌激素受体α(ERα)真核表达载体、LRP16真核表达载体(pcDNA3.1-16)共转染MCF-7细胞,测定3×ERE-Luc和pGL-3-S10的相对荧光素酶活性;3×ERE-Luc或pGL-3-S10与ERα真核表达载体、针对LRP16的小干扰RNA(LRP16-siRNA374、LRP16-siRNA668)或对照小干扰RNA(control-siRNA)共转染MCF-7细胞,测定3×ERE-Luc和pGL-3-S10的相对荧光素酶活性.结果:LRP16增强3×ERE-Luc和pGL-3-S10的相对荧光素活性,抑制LRP16表达显著削弱了3×ERE-Luc和pGL-3-S10的相对荧光素活性,并呈现剂量依赖性,该效应依赖于雌激素对ERα的激活.结论:ERα调控的靶基因LRP16反馈增强ERα介导的转录激活活性,是ERα的一个共激活因子.     

抗血小板膜糖蛋白Ibα胞内段多肽多克隆抗体的制备及初步应用

目的 制备兔抗人血小板膜糖蛋白(GP)Ibα C端557～561氨基酸序列多肽的多克隆抗体,并初步用于人血小板GPIbα C端559位丝氨酸磷酸化状态的检测.方法 应用化学方法合成C-R-G-S-L-P(559位丝氨酸非磷酸化,Ser559)和C-R-G-s(p)-L-P(559位丝氨酸磷酸化,pSer559)多肽.将2种多肽分别与钥孔蜮血蓝蛋白交联后,以皮下注射法分别免疫新西兰大白兔,分离获得2种抗血清(抗Ser559多抗和抗pSer559多抗).应用斑点印迹和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法 对抗血清进行鉴定并检测效价.从人血小板裂解液中分离纯化血小板GPIbα,利用抗Ser559多抗和抗pSer559多抗、采用ELISA方法检测人血小板GPIbαC端559位丝氨酸磷酸化状况.结果 所制备的2种多抗分别特异性识别各自抗原,效价分别为1:32 000和1:64 000.2种多抗均可与纯化的人血小板GPIbα特异结合,表明人血小板GPIbα 559位点丝氨酸存在磷酸化与非磷酸化两种状态.结论 应用人工合成多肽成功制备出2种可特异性识别丝氨酸磷酸化状态的兔抗人血小板GPIbα胞内段多肽多抗,并证明人血小板GPIbαC端559位丝氨酸存在磷酸化状态.     

氧浓度和钙离子对野生型及突变型低氧诱导因子-1α基因真核表达的影响

目的 对已构建的突变型人低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)真核表达载体pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala(单突变)和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala(双突变)进行进一步的功能鉴定.方法 将pcDNA3.1+/HIF-1α、pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala分别用脂质体法短暂转染人胚肾上皮细胞(human embryo kidney 293,HEK293);Western blotting法检测正常氧、低氧无钙离子或有钙离子条件下各组转染细胞HIF-1α蛋白水平:RT-PCR法检测正常氧条件各组转染细胞血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达.结果 正常氧条件下,转染突变体的细胞较转染野生型HIF-1α载体的细胞HIF-1α蛋白和VEGFmRNA水平增高;低氧条件下,转染野生型HIF-1α载体的HEK293细胞HIF-1α蛋白水平增高:Ca~(2+)刺激减少低氧时转染野生型HIF-1α载体细胞HIF-1α蛋白水平,但对转染突变体细胞HIF-1α蛋白水平无明显影响.结论 pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala两种突变体产物在蛋白水平上具耐氧和耐蛋白酶降解的特性.

Abstract：

Objective To study the effects of oxygen and calcium on the expression of eukaryotic vectors harboring wild-type or mutated hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α)in HEK293 cells.Methods HEK293 cells were transiently transfected with pcDNA3.1+/HIF-1α,pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala and pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala via lipofectin.Western blotting were used to detect HIF-1α protein after normoxic or hypoxic exposure of the transfected HEK293 cells in the presence or absence of Ca~(2+).The levels of vascular endothelial growth factor(VEGF)mRNA in the transfected cells in normoxic condition was detected using RT-PCR.Results The levels of HIF-1α protein and VEGF mRNA increased in HEK293 cells transfected with the vectors harboring mutated HIF-1α, but not in the cells transfected with wild-type HIF-1α vectors in normoxia.Hyooxia increased the levels of HIF-1α protein in the cells transfected with wild-type HIF-1α vectors,which was inhibited by the application of Ca~(2+). Ca~(2+) showed no inhibitory effect on HIF-1α levels in HEK293 cells transfected with the vectors containing mutated HIF-1α. Conclusion The protein products of pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala and pcDNA3.1+/HIF-1α-564Ala-803Ala in HEK293 cells enhance the cell tolerance to oxygen and protease.     

RB1-C磷酸化位点突变体与Sedlin的共定位研究

目的研究人视网膜母细胞瘤蛋白1羧基端(RB1-C)磷酸化位点突变体的蛋白表达和细胞定位情况及其与迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白(Sedlin)共定位的变化情况。方法设计RB1-C磷酸化位点突变体的引物,以质粒pcDNA3.1-FLAG-RB1-C为模板,利用PCR技术分别扩增出pcDNA3.1-FLAG-RB1-C-S788A、S795A、S807A、T811A、T821A、T826A共6个突变体,并对各位点进行测序。分别将以上突变体单独转染至HEK 293T、COS7细胞中,利用Western blot和免疫荧光(IF)技术观察其蛋白表达和细胞定位情况;分别将以上突变体及Sedlin共同转染至COS7细胞中,利用IF技术观察二者在细胞内的共定位情况,并与野生型RB1-C的结果进行比较分析。结果测序结果显示RB1-C的6个磷酸化位点均突变成功,并能够在真核细胞内正常表达,且与野生型RB1-C的细胞定位基本一致,即主要定位在细胞核内。与野生型RB1-C相比,RB1-C-S788A、S795A、T821A、T826A与Sedlin的共定位未发生改变,即主要共定位在细胞核内;但RB1-C-S8...     

金雀黄素对子宫内膜癌细胞Erα和ERβmRNA水平的调节

目的:研究金雀黄素对子宫内膜癌细胞ERα,ERβ mRNA的调节作用,探讨植物雌激素对子宫内膜癌的作用机制,为临床应用植物雌激素提供理论依据.方法:体外培养子宫内膜癌细胞系Ishikawa,采用实时荧光定量RT-PCR方法,观察不同剂量金雀黄素对两种雌激素亚型表达的影响,阳性对照为雌二醇、孕酮作用组.结果:(1)低剂量金雀黄素能提高子宫内膜癌细胞ERα mRNA表达,但其作用较雌二醇明显弱;低剂量金雀黄素能降低ERβ mRNA的表达,而雌二醇对ERβ mRNA作用不明显.(2)高剂量金雀黄素的作用与孕酮相似,能下调子宫内膜癌细胞ERα mRNA和ERβ mRNA表达,但较孕酮作用弱.结论:金雀黄素对子宫内膜癌细胞ERα mRNA和ERβ mRNA的表达作用不同,而且与其剂量有一定关系.推测金雀黄素有雌激素受体调节剂的作用.     

异补骨脂素和蜕皮甾酮对人乳腺癌T47D细胞增殖及ER亚型表达的影响

目的利用人乳腺癌T47D细胞观察异补骨脂素和蜕皮甾酮对雌激素受体阳性细胞增殖的作用,并检测其对T47D细胞雌激素受体亚型ERα、ERβ表达的影响。方法采用MTT细胞增殖实验观察中药补骨脂、川牛膝的两种活性成分:异补骨脂素和蜕皮甾酮对ERα、ERβ阳性细胞T47D增殖的影响;通过流式细胞术检测细胞增殖周期的变化;用半定量RT-PCR法检测上述成分对靶细胞ERα、ERβmRNA表达情况的影响。结果10-6mol/L和10-7mol/L异补骨脂素和蜕皮甾酮能够显著促进培养的T47D细胞增殖,提高细胞分裂增殖指数,表现出雌激素样作用;RT-PCR结果显示:10-6mol/L和10-7mol/L异补骨脂素和蜕皮甾酮均可使ERαmRNA表达显著增加,异补骨脂素同时也可提高ERβmRNA表达。结论异补骨脂素和蜕皮甾酮具有植物雌激素作用,并可影响靶细胞ER亚型的mRNA表达水平。     

比格犬ERβ_(1293)基因真核载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达和定位

目的观察比格犬Myc标签ERβ1293重组真核表达载体在HEK293T细胞中的表达及定位。方法以pEGFP-N1-ERβ1293重组真核表达载体为模板,PCR保真酶扩增得到ERβ1293基因编码区全长。Myc标签ERβ1293重组真核载体瞬时转染HEK293T细胞,运用蛋白质印迹技术(Western blotting)和间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescence,IF)鉴定pcDNA3.1-Myc-ERβ1293在HEK293T细胞中的表达和定位情况。结果成功构建pcDNA3.1-Myc-ERβ1293重组真核表达载体,转染至HEK293T细胞中。Western blotting检测有蛋白条带表达,共聚焦显微镜下观察IF处理后的转染细胞,荧光定位于细胞质。结论前期实验得到比格犬ERβ剪切异构体ERβ1293编码区序列,缺失第四外显子,导致其与配体结合能力减弱或消失,因此目的基因编码蛋白定位在细胞中发生变化。     

hERα-LBD原核表达载体的构建及蛋白表达活性鉴定

目的 构建人雌激素受体α 亚型配体结合区（hERα-LBD）的原核表达载体,并进行表达蛋白的活性鉴定。方法 以hERα -LBD质粒为模板,采用PCR方法扩增hERα -LBD基因,PCR扩增产物鉴定后与T载体（pGEM-T-easy）连接,将连接物转化到感受态细胞中,阳性菌落经酶切和测序鉴定,和pET-28a（+）质粒分别进行双酶切,T4 DNA连接酶连接,构建重组表达载体pET-28a（+）-hERα -LBD ,转化到大肠杆菌JM109和BL21感受态细胞中。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导细胞表达hERα-LBD融合蛋白;将雌二醇-牛血清白蛋白（BSA）偶联抗原(E2-BSA) 与融合蛋白混合,通过电泳法鉴定hERα-LBD的雌激素配体结合活性。结果 PCR扩增的hERα -LBD基因片段约为1.9 kb,与预期目的片段大小一致。与T载体连接,形成pGM-T-hERα -LBD重组质粒,转化到感受态细胞,阳性菌落酶切和测序鉴定正确,与pET-28a（+）质粒酶切后连接,成功构建原核重组表达载体pET-28a（+）-hERα -LBD;在大肠杆菌中异源表达人雌激素受体ERα的配体结合区hERα-LBD蛋白。经亲和色谱法纯化后,hERα-LBD蛋白的表达量可达250 mg/L。电泳法证实hERα-LBD具有雌激素结合活性。结论 成功构建原核重组表达载体pET-28a（+）-hERα -LBD,hERα-LBD具有雌激素结合活性。     

SIRT7基因乙酰化活性缺失突变真核表达载体的构建

目的构建SIRT7基因乙酰化活性缺失的定点突变真核表达载体。方法用RT-PCR法从293T细胞中扩增SIRT7基因,并克隆到真核载体pcDNA 3.1/myc-His(-)A上。采用Two-step PCR定点突变技术,构建SIRT7基因的H187Y突变质粒,经测序确证定点突变成功,再将SIRT7及突变载体转染293T细胞,Western blot检测融合蛋白表达。结果克隆出SIRT7基因,构建了真核载体pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7,经Two-step PCR获得突变体pcDNA 3.1/myc-His-SIRT7H187Y。DNA测序结果表明,编码187位氨基酸的560~562位碱基由CAC突变为TAC,其他碱基均无突变。SIRT7和H187Y突变载体转染293T细胞后,可检测出myc-SIRT7融合蛋白表达。结论成功构建了SIRT7以及H187Y突变的真核表达载体。     

针对ERα的RNA干涉对人乳腺癌Bcap-37细胞生长的抑制作用

目的:探讨针对雌激素受体(ERα)分子的RNA干涉对肿瘤细胞生长的影响.方法:人工合成编码siRNA的脱氧寡核苷酸链,经磷酸化后退火连接进pSUPER载体.挑取和扩增序列正确的重组载体,稳定转染Bcap-37细胞后分别以RT-PCR和间接免疫荧光检测mRNA及蛋白质的表达情况, MTT法检测RNAi对细胞生长的影响.结果: siRNA表达载体转染后ERα表达水平明显降低,细胞增殖减慢.结论:针对ERα的RNA干涉可在体外抑制Bcap-37细胞生长.     

丝氨酸526位点在MEKK3介导的IL-1信号途径中的作用

目的：确定MEKK3分子中介导IL-1信号途径的关键性氨基酸。方法：对哺乳动物MEKK3活性环526位点的丝氨酸进行人工诱变后，用瞬时转染的方法分别将526A基因单独及与TRAF6基因同时导入GES-1细胞中；用免疫印迹、NF-κB荧光素酶报告基因测定及免疫沉淀实验检测了526A突变体的表达水平、对IL-1及TRAF6介导的NF-κB基因的表达及MEKK3与TRAF6相互作用的影响。结果：通过与野生型MEKK3的对比，观察到526A不但阻断了IL-1及TRAF6介导的依赖于MEKK3的NF-κB基因的激活，同时阻断了TRAF6与MEKK3的相互作用。结论：526位点的丝氨酸在MEKK3介导的IL-1信号途径中起关键性的作用。是不可缺少的关键性氨基酸。     

人环指蛋白11与核因子κB调控蛋白肿瘤坏死因子α诱导蛋白3相互作用蛋白1相互作用的研究

目的泛素化是机体重要的蛋白质的修饰方式,人环指蛋白(ring finger protein,RNF)11是泛素连接酶家族成员之一,可能在肿瘤形成过程中发挥重要的作用。肿瘤坏死因子α诱导蛋白3相互作用蛋白1(tumor necrosis factorα-induced pro-tein 3-interacting protein 1,TNIP1)是重要的核因子κB(nuclear factor kB,NF-κB)调控蛋白,可通过多种途径调控NF-κB的表达及细胞凋亡。文中研究RNF11下游功能及其与TNIP1之间的相互作用,明确RNF11的亚细胞定位。方法用PCR等方法构建人NFκB调控蛋白TNIP1全长及缺失不同位点的突变体,并观测其在293T细胞中的表达。用免疫共沉淀(co-immunoprecipita-tion,co-IP)方法鉴定其与人RNF11的相互作用,并确定其结合位点,用共聚焦显微镜观测其亚细胞定位。结果成功构建了人TNIP1的全长及其缺失不同位点的突变体并使其在293T细胞中表达。证实RNF11与TNIP1存在相互作用并确定其相互结合位点位于TNIP1的第311至535位氨基酸,。确定RNF11的亚细胞定位于细胞质。结论人RNF11可与TNIP1在细胞内相互结合,其主要的结合位点位于311至535位氨基酸。RNF11主要定位于细胞质,可能参与细胞内蛋白的降解过程。     

选择性雌激素受体调节剂对MC3T3-E1细胞生长分化的调节

目的探讨选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulator,SERM)———雷洛昔芬对小鼠颅顶成骨细胞MC3T3-E1分化的调节及其机制。方法体外培养MC3T3-E1细胞,10-7mol/L的雷洛昔芬和雌激素受体拮抗剂ICI-182780刺激细胞,另设空白对照组,24、48、72 h后检测各指标。MTT法检测细胞增殖;微量酶标法检测细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性;实时荧光定量聚合酶链式反应(real time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测细胞内β-catenin,雌激素受体α、β(estrogen receptorα、β,ERα、ERβ)mRNA的表达。结果 MC3T3-E1细胞分别加入10-7mol/L的雷洛昔芬和ICI-182780后,相对于对照组,雷洛昔芬处理组的促细胞增殖作用较强,在24 h增殖率最高,达(55.93±10.88)%;ALP活性增加,在48 h活性增加率最高,为(30.881±5.614)%;β-catenin、ERα和ERβmRNA的表达均增高,有统计学意义(P<0.05)。ICI-182780组的促细胞增殖率、ALP活性降低;β-catenin、ERα和ERβmRNA的表达均降低,有统计学意义(P<0.05)。结论雷洛昔芬可能通过上调β-catenin、ERα和ERβmRNA的表达促进MC3T3-E1细胞的增殖分化,而ICI-182780则下调β-catenin、ERα和ERβmRNA的表达抑制MC3T3-E1细胞的增殖和分化。     

比格犬卵巢子宫内雌激素受体ERα、ERβ的免疫组织化学定位研究

目的 研究雌激素受体α, β在比格犬卵巢及子宫内的定位。 方法 采用免疫组化SP法DAB显色结合BCIP/NBT及AEC显色检测ERα、ERβ在比格犬子宫及卵巢内的表达。 结果 比格犬ERα主要表达于卵泡颗粒细胞、卵巢间质腺腺上皮细胞及子宫内膜腺体腺上皮细胞胞核内,胞质内仅有少量表达，而在卵泡膜内膜的间质细胞，腺体周围的基质细胞及小动脉血管内皮细胞和平滑肌细胞、小静脉内皮细胞的胞核内有少量表达。而ERβ则以相同的组织特异性主要表达于上述组织细胞的胞质内,在胞核内有微弱表达。ERα 表达于膜黄体细胞的胞核内，而在黄体颗粒细胞胞核与胞质内均有表达。而ERβ则仍特异表达于不同生理阶段黄体细胞的胞质内。BCIP/NBT与AEC双染未见ERα、ERβ在子宫内有明显的共表达现象。结论 比格犬ERα、ERβ 在子宫与卵巢组织内定位不同，ERα主要定位于胞核，在胞质内有微弱表达，而ERβ主要定位于胞质，在胞核内有零星表达。     

晚期糖基化终末产物受体不同突变体真核表达载体的构建和表达

目的 构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体(RAGE)不同突变体的真核细胞表达载体.方法 采用定点突变技术将亚克隆在载体pcDNA3-HA上的野生型RAGE构建成不同突变体pcDNA3-HA-RAGE(S391A)、pcDNA3-HA-RAGE(S399A)、pcDNA3-HA-RAGE(S400A)、pcDNA3-HA-RAGE(T401A),经测序鉴定正确后转染HEK293细胞,利用Western blotting检测各突变体的表达.结果 RAGE不同突变体经测序鉴定正确无误后.在HEK293细胞中得到高量表达.结论 成功构建了RAGE不同突变体的真核表达载体,并在真核细胞中进行了表达,为进一步研究RAGE在细胞信号转导中的作用奠定了基础.     

弓形虫乳酸脱氢酶2结构与功能的生物信息学分析

目的预测在NCBI Protein文库中登录号为AAC46863的弓形虫乳酸脱氢酶2(LDH2)蛋白序列的结构和功能特征及其在免疫诊断和疫苗研究方面的应用前景。方法利用NCBI和ExPaSy等生物信息学网站在线分析工具和MEGA7及Vector NTI等软件包,分析弓形虫LDH2的理化性质、结构与功能特征。结果在线软件ProParam分析该蛋白由326个氨基酸构成,平均亲水系数(GRAVY):0.095,可能为疏水性蛋白。SignalP 4.1 Server预测无信号肽,为非分泌型蛋白。NetPhos 3.1预测该蛋白有21个磷酸化位点,其中丝氨酸磷酸化位点14个,苏氨酸磷酸化位点6个,酪氨酸磷酸化位点1个。经Vector NTI软件包多序列比对,发现弓形虫有一段特异于人、鼠、牛等其他物种的氨基酸序列TGMPEGKALD。分别用ABCpred Prediction Server、SYFPEITHI软件预测该段特异序列很可能为线性B、T细胞表位。结论弓形虫LDH2存在较多的磷酸化位点以及一段特异的氨基酸序列,且该段特异氨基酸序列很可能为线性B、T细胞表位,提示LDH2在弓形虫病的免疫诊断和疫苗研究方面有较好的应用前景。     

ER-α36基因沉默对ER阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的作用及其影响

目的：探讨ER-α36基因与人雌激素受体（ ER）阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的内在联系。观察其对ER阴性乳腺癌细胞的影响。为探索ER阴性乳腺癌的基因治疗提供新的途径。方法利用RNAi技术,构建靶向ER-α36基因的短发夹状RNA（shRNA）重组质粒,脂质体法将pRNAT-U6.1/Neo-ER-α36导入雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231,利用RT-PCR法检测MDA-MB-231细胞ER-α36基因表达的抑制情况;MTT法检测雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖情况。结果①PCR、酶切鉴定、DNA测序证实小干扰质粒构建成功,无碱基突变;②ER-α36-siRNA表达载体转染ER阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231可有效抑制ER-α36 mRNA表达（抑制效率＝86.3％）,P＜0.01;③MTT实验结果表明ER-α36沉默可有效抑制ER阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖,提示ER-α36参与MAPK/ERK信号转导通路调节细胞增殖。结论 ER-α36参与MAPK/ERK信号转导途径,与ER阴性乳腺癌的发生、发展关系密切。RNAi有效沉默ER-α36基因是ER阴性乳腺癌基因治疗的有效手段。ER-α36可能成为ER阴性乳腺癌基因治疗的新靶点。     

青藤碱对PKC⁃α/NF⁃κB⁃p65通路的抑制作用及机制

目的：探讨过表达蛋白激酶C?α（protein kinase C?α,PKC?α）对HEK?293T细胞中核因子?κB?p65（nuclear factor?κB?p65,NF?κB?p65）磷酸化水平的影响,并检查青藤碱（sinomenine,SIN）对PKC?α/NF?κB?p65信号通路的抑制作用。方法：采用PCR技术扩增大鼠PKC?α基因蛋白质编码区（complete sequence coding,CDS）序列,将其插入到pIRES2?EGFP空载质粒中,构建野生型（wide type,WT）PKC?α过表达质粒（pIRES2?PKC?α?WT,PKC?αWT）;在PKC?αWT质粒的基础上,将PKC?α第25位丙氨酸（A）与368位赖氨酸（K）分别突变为谷氨酸（E）和精氨酸（R）,即构建持续活化（constitutively active,CA）突变型PKC?α过表达质粒（pIRES2?PKC?α?A25E,PKC?αCA）和显性负性（dominant negative,DN）突变型PKC?α过表达质粒（pIRES2?PKC?α?K368R,PKC?αDN）。本课题组前期构建的大鼠野生型NF?κB?p65过表达质粒（pIRES2?NF?κB?p65,p65WT）分别与上述各PKC?α过表达质粒共同转染HEK?293T细胞,免疫印迹法检测PKC?α、NF?κB?p65的表达及磷酸化水平。再将上述不同质粒转染HEK?293T细胞,46 h后予50 ng/mL SIN处理细胞2 h,再行免疫印迹实验分析SIN对PKC?α、NF?κB?p65磷酸化的影响。结果：菌液PCR及测序证实,上述PKC?α过表达质粒构建成功。在HEK?293T中过表达PKC?αWT或PKC?αCA可促进NF?κB?p65的磷酸化,且过表达PKC?αCA时尤为显著,而过表达PKC?αDN后NF?κB?p65的磷酸化无明显变化。SIN处理可抑制PKC?αWT、PKC?αCA和PKC?αDN转染组HEK?293T细胞中PKC?α的磷酸化,同时也能抑制过表达PKC?αWT上调的NF?κB?p65磷酸化修饰,但不影响过表达PKC?αCA和PKC?αDN对NF?κB?p65的磷酸化作用。结论：过表达PKC?α可促进HEK?293T细胞中NF?κB?p65的磷酸化,SIN处理HEK?293T细胞后可通过抑制PKC?α的磷酸化下调NF?κB?p65的磷酸化修饰。