成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌样细胞及其鉴定

背景：体外诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为胰岛样细胞，目前尚无成熟的鉴定方案。转基因诱导要求条件高，程序复杂，化学诱导剂诱导为现阶段较多采用的一类方法。 目的：探讨成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞的条件。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007-01/10在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。 材料：骨髓来源于青岛大学医学院附属医院内分泌科行自体干细胞移植治疗的糖尿病患者，对治疗及实验均签署知情同意书。表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子为Peprotech Asia公司产品，B27添加剂为Gibco公司产品，尼克酰胺、2-巯基乙醇、谷氨酰胺、双硫踪为Sigma公司产品。 方法：采用Percoll法分离成人骨髓间充质干细胞，加入含体积分数为0.1胎牛血清的LG-DMEM进行培养，胰蛋白酶消化传代。取第3~5代细胞，按1×108 L-1密度接种，分3阶段诱导：第1阶段加入含2-巯基乙醇、谷氨酰胺的HG-DMEM，培养2 d；第2阶段加入含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B27添加剂、谷氨酰胺的HG-DMEM，培养6 d；第3阶段加入含尼克酰胺、2-巯基乙醇的HG-DMEM，培养6 d。对照组采用单纯的HG-DMEM进行培养。 主要观察指标：相差显微镜下观察细胞形态变化，诱导第2阶段行免疫荧光鉴定PDX-1基因的表达，诱导第3阶段行双硫腙染色鉴定胰岛β样细胞团，电化学发光法测定低糖/高糖刺激下胰岛素的分泌情况。 结果：未经诱导的骨髓间充质干细胞呈长梭形贴壁生长，诱导后胞逐渐变圆，并聚集成团。诱导8 d细胞PDX-1基因呈阳性表达，诱导14 d细胞团双硫腙染色呈棕红色。经低糖、高糖刺激后，对照组无胰岛素释放，诱导14 d细胞团培养基中胰岛素含量显著升高（t=3.638~9.387，P均 < 0.01）。 结论：2-巯基乙醇、谷氨酰胺、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及尼克酰胺等可在体外诱导成人骨髓间充质干细胞分化为具有分泌胰岛素功能的胰岛样细胞。     

脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞

背景：自杀基因独有的旁观者效应,可显著提供肿瘤细胞杀伤效果,同时还与放射治疗、免疫基因治疗联合应用,并克服了基因转导效率低的缺陷。胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD）即可产生强大的旁观者效应。 目的：观察脂质体介导真核表达载体CD基因转染鼠骨髓间充质干细胞的效果及其基因表达。 设计、时间及地点：细胞学基因水平实验,于2007-05/12在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。 材料：SPF级C57BL纯系小鼠6只,由大连医科大学实验动物中心提供。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α由大连理工大学干细胞与组织工程研发中心提供。LipofectamineTM 2000脂质体为Invitrogen产品。 方法：取连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,提取质粒DNA,对质粒pIRES2-AcGFP1-CD进行XhoI和BamHI双酶切,用于转染。取小鼠双侧下肢股骨和胫骨,贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代制成单细胞悬液,加入荧光标记的CD44,CD45,CD90,CD105抗体后,采用Lipofectamine 2000介导法转染第3代骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：重组质粒的鉴定,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记表达,细胞转染后CD基因的表达。 结果：质粒pIRES2-AcGFP1-CD酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,于1.0~1.5 kb处有一条带出现,符合CD基因长度。细胞表面标记CD45呈阴性,CD44,CD90,CD105呈阳性。pIRES2-AcGFP1-CD基因转染36 h后,荧光倒置相差显微镜下可见小鼠骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白的表达,48 h后细胞仍有荧光表达,且强度明显增强。 结论：脂质体介导的CD基因在鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,于转染48 h后达峰值。     

成人骨髓间充质干细胞向甲状腺细胞的诱导分化

背景：促甲状腺素、胰岛素或类胰岛素生长因子等对甲状腺细胞的发育分化、特异基因的表达及功能的产生等起着重要作用,故实验模拟甲状腺的体内胚胎发生过程逐步加入以上刺激因子对骨髓间充质干细胞进一步诱导。 目的：探讨在特定环境下体外定向诱导成人骨髓间充质干细胞分化为甲状腺细胞的可行性。 方法：采用密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞,应用促甲状腺素、胰岛素等试剂进行诱导。利用倒置光学显微镜、透射电镜观察细胞分化过程的形态学变化,免疫荧光等检测方法研究成人骨髓间充质干细胞的分化情况。 结果与结论：诱导组培养第3天可见骨髓间充质干细胞由长梭形变为圆形、椭圆形或三角形,不规则形生长,边界欠清晰。从第8天开始可见贴壁的胚胎体逐渐呈扁平状。诱导培养第7天可见分化细胞中有甲状腺细胞的特有基因如TSHr的表达;第9天检测到分化细胞中甲状腺细胞标记物TTF-1的表达。结果初步表明骨髓间充质干细胞可以在体外诱导分化为甲状腺细胞,是研究甲状腺疾病组织工程治疗的理想种子细胞。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染兔骨髓间充质干细胞*☆

背景：碱性成纤维细胞生长因子对于创伤修复具有明显的促进作用,但局部应用难以持久地发挥作用。 目的：观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞后的表达情况。 设计、时间及地点：细胞基因学体外观察,于2009-03/08在云南大学生命科学院完成。 材料：日本大耳白兔1只,购于昆明医学院动物科。pCDNA3.1质粒为美国Invitrogen产品。 方法：抽取兔髂前上棘骨髓,采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,待细胞融合至培养瓶底80%时消化传代。参考GeneBank碱性成纤维细胞生长因子cDNA序列设计合成基因,电泳纯化后xholⅠ、BamHⅠ双酶切回收凝胶,以限制性核酸内切酶对PcDNA Vector质粒进行酶切、电泳和凝胶回收,连接碱性成纤维细胞生长因子DNA与PcDNA Vector质粒,构建pCDNA-碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体,运用脂质体转染法将重组体转染至兔骨髓间充质干细胞中,并筛选稳定转染株。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞表面抗原的表达,Western blot法检测目的蛋白的表达。 结果：流式细胞仪检测结果示所培养细胞表面抗原呈CD90,CD44阳性,CD45呈阴性;免疫组化检测结果示骨髓间充质干细胞血管源性细胞表面抗原CD34呈阴性,而相对特异性标记物CD44呈阳性。转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞提取的细胞裂解液中,在Mr 23 000处有一条明显阳性杂交带;而转染pCDNA3.1(-)空载体的骨髓间充质干细胞提取蛋白未见阳性条带。 结论：实验成功地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞,该目的基因可稳定表达。     

Lipofectamine介导胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞*☆

背景：自杀基因独有的旁观者效应,可显著提供肿瘤细胞杀伤效果,同时还与放射治疗、免疫基因治疗联合应用,并克服了基因转导效率低的缺陷。胞嘧啶脱氨酶即可产生强大的旁观者效应。 目的：观察脂质体介导真核表达载体胞嘧啶脱氨酶基因转染鼠骨髓间充质干细胞的效果及其基因表达。 设计、时间及地点：细胞学基因水平体外实验,于2007-05/12在大连理工大学干细胞与组织工程研发中心完成。 材料：SPF级C57BL纯系小鼠6只,体质量18~20 g,用于骨髓间充质干细胞的分离培养。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a由大连理工大学干细胞与组织工程研发中心提供。LipofectamineTM 2000脂质体为Invitrogen产品。 方法：取连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a,提取质粒DNA,对质粒plRES2-cGFP1-CD进行XhoI和BamHI双酶切,用于转染。取小鼠双侧下肢股骨和胫骨,贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞,传至第3代制成单细胞悬液,加入荧光标记的CD44,CD45,CD90,CD105抗体后,采用LipofectamineTM 2000介导法转染第3代鼠骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：重组质粒的鉴定,流式细胞仪检测鼠骨髓间充质干细胞表面标记表达,荧光倒置显微镜观察细胞转染36,48 h后胞嘧啶脱氨酶基因的表达。 结果：质粒plRES2-AcGFP1-CD酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后,于1.0~1.5 kb处有1条带出现,符合胞嘧啶脱氨酶基因长度。流式细胞仪检测显示细胞表面标记CD45呈阴性,CD44,CD90,CD105呈阳性。plRES2-AcGFP1-CD基因转染36 h后,荧光倒置相差显微镜下可见小鼠骨髓间充质干细胞有绿色荧光蛋白表达,48 h后细胞仍有荧光表达,且强度明显增强。 结论：脂质体介导的胞嘧啶脱氨酶基因在鼠骨髓间充质干细胞中成功表达,于转染48 h后达峰值。     

胰腺十二指肠同源框蛋白1基因转染人骨髓间充质干细胞及向胰岛样细胞的分化

背景：随着人胰岛素基因及某些血糖调节酶基因的克隆,以及重组载体为基础的基因克隆技术的建立,使骨髓间充质干细胞更容易向胰岛素分泌细胞分化,且具有体外扩增明显而无致瘤性的优点。 目的：利用胰腺十二指肠同源框蛋白1(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)基因转染人骨髓间充质干细胞,观察基因修饰向胰岛样细胞的分化情况。 设计、时间及地点：细胞-基因学体外实验,于2008-01/07在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。 材料：骨髓来源于糖尿病患者,由青岛大学医学院附属医院干细胞中心提供。 方法：利用反转录聚合酶链技术构建PDX-1基因的cDNA,酶切后插入经相同酶切处理的含绿色荧光蛋白的空白载体PEGFP-N1,构成重组质粒,再进行Bgl Ⅱ、HindⅢ双酶切筛选、鉴定并测序。Percoll法分离培养人骨髓间充质干细胞,当细胞汇合至90%时胰蛋白酶消化传代。转染前1 d加入无抗生素培养基,将第3代细胞按5×105接种于6孔培养板,适量重组载体及脂质体溶解后混合形成DNA-脂质体混合物,培养5 h后更换普通培养液。同时设立对照组,在6孔板中进行空白质粒转染。 主要观察指标：脂质体介导转染后,荧光显微镜观察细胞转染情况;免疫荧光染色检测PDX-1蛋白的表达;双硫腙染色鉴定细胞分化情况。 结果：通过测序、凝胶电泳、酶切等确定PDX-1基因已正确插入重组质粒。荧光显微镜下,成功转染的骨髓间充质干细胞发出绿色荧光,质粒转染效率约70%。转染8 d的细胞PDX-1呈阳性表达,对照组细胞PDX-1呈阴性。转染后14 d可见半悬浮的胰岛样细胞团,双硫腙染色呈棕红色,而未转染的对照组细胞双硫腙染色不着色。 结论：PDX-1基因重组载体能够导入人骨髓间充质干细胞且稳定表达,并可以转化为胰岛样细胞。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的实验研究

目的　探索骨髓间充质干细胞 (MSCs)能否在体外诱导分化成神经样细胞 ,并初步探讨其分化机制。方法　培养大鼠MSCs,用二甲亚砜 (DMSO)和丁羟茴醚 (BHA)诱导分化 ,鉴定诱导分化前后的细胞是否表达神经细胞及神经干细胞的特异性标记蛋白 ,并研究其超微结构的变化。结果　诱导分化后 ,大部分MSCs变成双极、多极和锥形 ,并相互交织成网络结构 ,出现神经元特异性核蛋白 (NeuN)和巢蛋白 (Nestin)表达 ,无胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和 2 3 环核苷酸磷酸二脂酶 (CNP)表达。部分MSCs转变为典型的神经元超微结构。结论　MSCs可以在体外诱导分化为神经元样细胞。     

神经生长因子体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的探讨神经生长因子对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)分化成神经元样细胞的影响。方法从正常成人髂骨中获取MSCs,用碱性成纤维生长因子对MSCs进行预诱导24h后,再用浓度为50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL、200ng/mL神经生长因子培养基诱导分化,通过形态学观察诱导后的细胞形态变化,并用免疫组织化学法观察不同浓度神经生长因子诱导hMSCs分化为神经元样细胞的阳性率。结果各种浓度的神经生长因子促进了hMSCs分化为神经元样细胞,但分化率有差别,浓度为50ng/mL、100ng/mL、150ng/mL及200ng/mL时的分化率分别为(35.6±4.4)%、(61.9±3.4)%、(57.3±5.7)%和(57.2±4.8)%,比较有显著性差异(F=338.71,P<0.05)。不同浓度的神经生长因子之间有显著性差异,其中50ng/mL组诱导的神经元样细胞数最低(P<0.01),而其他三组间比较差异无显著性意义。结论神经生长因子可以促进hMSC向神经元样细胞分化,而100ng/mL的浓度是较合适的浓度。     

腺病毒介导人转化生长因子β2基因转染诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化

背景：前人的工作已证实转化生长因子β1能促进骨髓间充质细胞的增殖,诱导其向软骨细胞分化。 目的：进一步验证人转化生长因子β2(human transforming growth factor-β2,hTGFβ2)基因转染诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化作用。 方法：取清洁级3周龄雄性Lewis大鼠16只,用于分离培养骨髓间充质干细胞。通过腺病毒重组载体Ad-hTGFβ2将外源性hTGFβ2基因转染到体外培养的第2代大鼠骨髓间充质干细胞中,48 h后采用免疫组织化学染色、RT-PCR和Western blotting的方法检测转染细胞中目的基因与软骨特异性蛋白——Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达的情况。 结果与结论：从成体大鼠骨髓组织中培养出骨髓间充质干细胞,体外培养呈成纤维细胞样,能大量稳定增殖传代。Ad-hTGFβ2转染骨髓间充质干细胞获得稳定表达,免疫组织化学染色和Western blotting检测到基因转染细胞中Ⅱ型胶原蛋白的合成表达,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原和蛋白多糖aggrecan mRNA的表达。结果提示,从骨髓组织中可获得具有多分化潜能的间充质干细胞,并能在体外稳定增殖传代;Ad-hTGFβ2成功转染骨髓间充质干细胞,诱导其向软骨细胞分化。     

体外培养骨髓间充质干细胞诱导分化为神经样细胞的研究

目的探讨DMSO+BHA体外培养骨髓间充质干细胞诱导分化为神经样细胞的可行性。方法 DMSO+BHA诱导BMSCs向神经样细胞分化,免疫组织细胞化学染色法检测相关蛋白表达。结果神经方向诱导后细胞形态学发生变化,且NSE、Nestin及GFAP染色均为阳性。结论 DMSO+BHA可成功诱导BMSCs向神经样细胞方向分化。     

骨髓干细胞向肝细胞分化方式的研究进展*★

学术背景：骨髓中的某个细胞群具有转化为卵圆细胞，并进一步分化为肝细胞和胆管上皮细胞的潜能，为修复肝脏不可逆性损伤带来了新希望。 目的：对近年来骨髓干细胞向肝细胞分化的研究进行综述。 检索策略：应用计算机检索PubMed 及HighWire l999-01/2007-06 期间骨髓干细胞治疗肝病文章，检索词为“bone marrow stem cells，mesenchymal stem cells，hemopoietic stem cells， hepatocytes, hepatic fibrosis， hepatic cirrhosis”等，限定语言种类为英文。同时检索维普数据库1999-01/2007-06期间骨髓干细胞治疗肝硬化及肝纤维化文章，检索词为“骨髓干细胞，间充质干细胞，造血干细胞，肝细胞，肝纤维化，肝硬化”，限定语言种类为中文。对资料进行初审，并查看每篇文献后的引文。纳入标准：文章所述内容应与骨髓干细胞移植治疗肝纤维化、肝硬化的研究进展相关。排除标准：重复研究或Meta分析类文章。共收集到49篇外文文献和42篇中文文献，34篇文献符合纳入标准，排除的57篇为内容陈旧或重复文献。 文献评价：符合纳入标准的34篇文献中，18篇涉及骨髓干细胞通过移植在体内转化为肝细胞，12篇涉及骨髓干细胞通过体外培养、诱导分化为肝细胞，4篇涉及存在的问题与展望。 资料综合：骨髓干细胞主要包括造血干细胞和间充质干细胞, 其具有可塑性特性。体外通过生长因子，体内利用特定的微环境均可诱导骨髓干细胞分化为肝前体细胞和成熟肝细胞，并明显改善肝功能。从动物实验到临床研究都表明，骨髓干细胞具有的来源丰富、费用低廉、损伤小、自体移植不栓塞、无排斥反应等优点为治疗肝病提供了新思路，有望成为生物人工肝的细胞来源。 结论：骨髓干细胞治疗肝炎、肝硬化和肝癌等难治性肝病的临床应用前景非常突出。     

骨髓间充质干细胞向甲状腺细胞的分化☆

背景：特定环境下体外可定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向甲状腺细胞分化。 目的：建立大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导为甲状腺细胞的实验方法。 方法：采用密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,应用促甲状腺素和胰岛素诱导,以未诱导组为平行对照。利用倒置光学显微镜、透射电镜观察细胞分化过程的形态学变化,免疫荧光等检测方法研究成人骨髓间充质干细胞的分化情况。 结果与结论：诱导培养第7天可见分化细胞中有甲状腺细胞的特有基因如TSHr的表达,第9天检测到分化细胞中甲状腺细胞标记物TTF-1的表达;对照组未见变化。形态学与生物学证实了骨髓间充质干细胞可诱导培养为甲状腺细胞。     

全骨髓贴壁法获纯化骨髓间充质干细胞向神经干细胞的诱导分化*★

目的：来源于骨髓间充质干细胞的神经干细胞是最近研究的一个热点。实验拟进一步验证通过全骨髓贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞并诱导分化为神经干细胞的效率，并对其的体内外标记进行了观察。 方法：实验于2006-11/2007-05在青岛大学医学院附属医院脑血管病研究所完成。①实验材料：选取出生4周左右Wistar大鼠，雌雄不拘，SPF级，体质量200 g左右，由青岛市实验动物和动物实验中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：选用出生4周左右Wistar大鼠，由其股骨和胫骨分离纯化骨髓间充质干细胞，加碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子诱导其分化为神经干细胞，并进行免疫组织化学鉴定。以5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记神经干细胞，在24孔板中进行细胞免疫组织化学和免疫荧光鉴定。将标记的神经干细胞定位注入大鼠基底节区, 1周后取脑作石蜡切片, 进行免疫组织化学和免疫荧光染色。 结果：获得了较纯化的骨髓间充质干细胞，经诱导72 h后，部分细胞增殖分裂成小圆形,呈团簇状半悬浮状态。继续培养 72 h可见细胞呈现典型神经元样改变，细胞伸出两个或多个突起, 胞体呈多角形或不规则形, 折光性较强, 细胞突起之间相互连接成网状,可见细胞核及核仁，经诱导后有巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达。采用BrdU掺入DNA合成期的神经干细胞，1周后体内外标记阳性率> 85%。 结论：采用全骨髓贴壁法可获得较纯化的骨髓间充质干细胞，其在适宜的诱导分化条件下可诱导分化神经干细胞。BrdU可作为神经干细胞体内示踪的理想标记物。     

骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞的定向分化☆

目的：神经反射通路的重建和再髓鞘化是影响脊髓损伤后恢复的一个关键性因素，而少突胶质细胞存活的多少直接影响轴突再生后髓鞘化。探讨骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞定向分化的可行性。 方法：实验于2006-09/2007-06在同济医院骨科实验室完成。①动物：2~4周龄清洁级SD大鼠5只，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：大鼠颈脱臼法处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，去除两端骨骺，暴露骨髓腔，用DMEM培养液反复冲洗，收集冲洗液，重悬细胞种植于25 cm2培养瓶中，培养体系中含DMEM、体积分数为0.1的胎牛血清、终浓度为2 mmol/L谷氨酰胺及100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素，采用贴壁法+胰蛋白酶消化法进行纯化。取培养至第4代的骨髓间充质干细胞，加入含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、N2添加剂的无血清培养基进行诱导分化。③实验评估：观察诱导过程中骨髓间充质干细胞的形态学变化。半定量RT-PCR检测少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达。应用抗微管相关蛋白、抗神经纤维酸性蛋白、抗半乳糖脑苷脂、抗磷脂碱性蛋白抗体进行免疫细胞化学染色，检测骨髓间充质干细胞定向分化为少突胶质细胞的阳性率。 结果：①骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞诱导分化过程中的形态学变化：经诱导分化后，大部分骨髓间充质干细胞表现出少突胶质细胞的形态学特征，胞质向细胞核回缩，细胞突起向外延伸，折光性增强，随时间延长多个细胞突起相互连接形成典型的网状结构。②少突胶质细胞特异性标志物mRNA的表达：细胞诱导分化后可检测到磷脂碱性蛋白mRNA、半乳糖脑苷脂mRNA的特异性条带。③少突胶质细胞阳性率：在诱导分化条件下，半乳糖脑苷脂阳性率为65%，磷脂碱性蛋白阳性率为45%，微管相关蛋白2阳性率为10%。 结论：碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子与胰岛素样生长因子联合应用，能够有效促进骨髓间充质干细胞向少突胶质细胞分化。     

骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型的诱导分化

背景：半月板损伤后自行修复能力有限，组织工程技术为半月板损伤后修复开辟了一条新的途径。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，有可能成为半月板组织工程理想的种子细胞。 目的：观察体外培养的猪骨髓间充质干细胞在诱导培养液作用下向纤维软骨细胞表型分化的可行性。 方法：采用全骨髓培养法分离培养猪骨髓间充质干细胞。取第3代的骨髓间充质干细胞，实验组以2.0×104/cm2细胞密度接种于24孔板，在含有转化生长因子β1、胰岛素样生长因子Ⅰ、地塞米松及抗坏血酸的DMEM-LG完全培养液中诱导分化，对照组以2.0×104/cm2细胞密度接种于24孔板，加入不含诱导因子的DMEM-LG完全培养液。在诱导第7，14，21天分别行甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学染色检测其分化结果。 结果与结论：①第2代骨髓间充质干细胞的群体倍增时间最短约为2 d，第4代以后相对延长，为5~9 d。②诱导后的骨髓间充质干细胞由梭形向多角形、多边形转变。③实验组可见胞浆呈明显的紫蓝色，尤其细胞密集生长的区域蓝染较深，染色强度随诱导时间延长而增强。对照组的骨髓间充质干细胞只有核蓝染。④实验组和对照组Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色均阳性，各期染色无明显差异。对照组未见Ⅱ型胶原表达，实验组诱导14 d后可见Ⅱ型胶原能稳定的表达。提示骨髓间充质干细胞在体外诱导培养下可分泌纤维软骨细胞特征性细胞外基质，作为半月板组织工程种子细胞来源可行。     

三种因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化**

背景：间充质干细胞的生物学特性及影响分化调控因子的研究认为,体外原代培养的间充质干细胞自然分化为肝细胞的比例较低,选择一种合适的诱导剂提高其分化为肝细胞的比例尤为必要。 目的：以肝细胞生长因子、表皮生长因子及成纤维生长因子体外联合,验证其诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的可行性。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-08在潍坊医学院实验中心完成。 材料：Sprague-Dawley大鼠40只,由潍坊医学院实验动物中心提供。 方法：采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,取传至第3代细胞,设立2组：空白对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养基;联合诱导组在此基础上,另加入10 µg/L成纤维生长因子、8 µg/L肝细胞生长因子、8 µg/L表皮生长因子。 主要观察指标：倒置显微镜观察诱导后细胞形态变化,免疫荧光染色观察甲胎蛋白及白蛋白的表达,PAS检测糖原的表达,靛青绿摄入情况,酶学检测谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的水平。 结果：联合诱导组细胞呈多角形、卵圆形或圆形细胞的特征性改变,空白对照组骨髓间充质干细胞仍保持梭形或纺锤形。联合诱导组培养14 d可见白蛋白和甲胎蛋白免疫反应阳性细胞;诱导7 d时偶见PAS阳性细胞与靛青绿阳性细胞,随诱导时间延长,阳性细胞逐渐增多;诱导14 d时开始检测到谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶的合成,21 d达高峰,之后下降。上述各指标空白对照组细胞均呈阴性。 结论：成纤维生长因子、肝细胞生长因子与表皮生长因子体外联合应用,能够成功诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化。     

Differentiation of adult bone marrow stem cells into neuroprogenitor cells in vitro

We found the expression of neurofilament was very low in undifferentiated human adult bone marrow mesenchymal stem cells (hMSCs), but its expression could be significantly induced after treatment with combination of growth factors. Approximately 16% of hMSCs differentiated into cells expressing neurofilament after treatment with a combination of FGF and RA, retinoic acid. We also examined the effect of five different cell culture substrates on the expression of neurofilament. One specific combination that was particularly effective in provoking pre-neuronal differentiation was culturing hMSCs on fibronectin-coated dishes and stimulating them with FGF and RA; 40% of cells expressed neurofilament. These results suggest that growth factors and substrates, in combination, can effectively initiate differentiation of hMSCs along a neuronal pathway.     

大鼠骨髓基质细胞体外培养向神经干细胞的诱导分化

目的：已证实骨髓基质细胞可分化为中胚层组织细胞，实验予进一步探讨体外分离培养的骨髓基质细胞向神经干细胞分化的可能性，以及是否能继续定向分化为神经细胞及神经胶质细胞，为神经系统疾病细胞移植治疗提供种子细胞。 方法：实验于2007-02/09在泸州医学院神经生物学研究室进行。①动物：选择5只普通级SD大鼠，由泸州医学院实验动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉，取双侧胫骨和股骨，磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔，采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞，胰蛋白酶与EDTA联合消化，传至第4代，用含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子、N2辅助因子的DMEM/F12培养液向神经干细胞诱导分化。③实验评估：观察原代、传代培养及诱导分化后的骨髓基质细胞生长情况和形态变化，采用SABC法进行免疫细胞化学检测神经细胞特异性标志的表达。 结果：①骨髓基质细胞形态观察：原代细胞接种1 d后开始贴壁增殖，3 d后多数贴壁，贴壁细胞呈梭形或扁平形；10 d后90%细胞融合，以长梭形为主，突起粗大，形成网状、片状；传代后细胞贴壁速度加快，增殖能力更强，7 d左右达到融合。②诱导分化后细胞生长情况和形态变化：第4代骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化7 d，成球的细胞脱离瓶底，悬浮在细胞液中。将细胞离心弃上清，换成血清分化液后，细胞球逐渐贴壁，球周围很快发出突起，分化为星形胶质细胞样细胞、神经元样细胞及少突胶质细胞样细胞。③神经细胞特异性标志的表达：骨髓源性细胞球表达巢蛋白，呈棕黄色，为神经干细胞；从细胞球分化的细胞抗胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及半乳糖脑苷脂均呈阳性。 结论：骨髓基质细胞能在体外诱导分化出神经干细胞，且骨髓源性神经干细胞可进一步定向分化为神经细胞及神经胶质细胞。     

成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞的研究进展★

学术背景：近几年采用胰岛细胞或胰腺移植治疗糖尿病取得一些疗效，但仍存在供体匮乏和免疫排斥两大难题。骨髓间充质干细胞在体外可诱导成为胰岛样细胞。 目的：分析总结骨髓间充质细胞体外向胰岛样细胞的诱导分化研究进展。 检索策略：由该论文的研究人员应用计算机检索Pubmed数据库1997-08/2007-08的相关文献，检索词“mesenchymal stem cells，insulin secreting cell”，并限定文章语言种类为English。同时计算机检索中国期刊全文数据库1997-08/2007-08的相关文献，检索词“骨髓间充质干细胞， 胰岛素分泌细胞”，并限定文章语言种类为中文。共检索到108篇文献，对资料进行初审，纳入标准：①文章所述内容应与骨髓间充质细胞体外诱导分化为胰岛样细胞密切相关。②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章。排除标准：①重复性研究。②Meta分析。 文献评价：文献的来源主要是通过对骨髓间充质细胞体外向胰岛样细胞的诱导分化方面内容进行汇总分析。所选用的30篇文献中，2篇为综述，其余均为临床或基础实验研究。 资料综合：①由于胰腺和神经系统具有相似的发育控制机制，目前认为神经生长因子可能是胰腺发育的关键信号。利用人骨髓间充质干细胞多向分化能力，用表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子将其诱导成为nestin阳性细胞，该细胞在添加含有胰岛细胞赖以生存的条件培养液中为适宜微环境，将被进一步诱导为胰腺样细胞。②目前针对胰岛素样细胞的鉴定与功能学研究有以下几方面：细胞形态学观察是否有类似胰岛样细胞团的聚集；免疫组织化学检测诱导后细胞胰岛素、胰高血糖素和生长抑素的表达；用RT-PCR法对诱导后细胞的胰岛素及胰高血糖素基因表达测定；葡萄糖刺激的胰岛素释放试验来研究诱导后胰腺细胞的功能。 结论：随着骨髓间充质干细胞在体外可诱导成胰岛样细胞技术的不断发展，为解决糖尿病细胞治疗所面临的问题提供一个新的方案。经过诱导分化所得到的胰岛样细胞，其胰岛素分泌量远小于正常胰岛细胞，因此目前急需解决在体外高效诱导且符合人生理的胰岛细胞，并将其安全移植入人体等问题。