H7N9禽流感病毒血凝素线性B细胞抗原表位单克隆抗体的制备和鉴定

目的研制用于H7N9禽流感病毒诊断的血凝素线性B细胞抗原表位单克隆抗体。方法采用H7N9禽流感病毒血凝素特异性线性B细胞抗原表位免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术和间接ELISA法筛选、鉴定获得稳定分泌抗H7N9禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株;通过SDS-PAGE、间接ELISA和斑点免疫印迹技术鉴定其亚型、效价、纯度等生物学特征。结果共获得2株单克隆抗体(7C8H8和8E9E2),其中7C8H8抗体亚类为IgG2a,腹水抗体效价>1∶512000,且可以特异性结合H7N9禽流感病毒血凝素。8E9E2仅具有较低的H7N9禽流感病毒血凝素蛋白结合力。结论获得1株可分泌高效价、高特异性的抗H7N9禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株7C8H8。     

鳙鱼变应原小清蛋白单克隆抗体制备及鉴定

目的制备、纯化及鉴定抗鳙鱼小清蛋白单克隆抗体。方法以重组鱼主要过敏原小清蛋白(parvalbu-min)为抗原免疫BALB/c小鼠,融合免疫鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤NS-1,半固体培养基法结合有限稀释法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,采用蛋白A亲和层析法获得纯化抗体,间接ELISA方法和w estern blot鉴定抗体效价和特异性以及与其他过敏源的交叉反应性;采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型。结果共获得抗parvalbumin细胞株7株,1G1,1B5,1A5,2B9,1H4,1B7,1G3。1G1、1B7、1A5、1H4和1G3效价均高于1∶400 000,P/N>2.1;1B5效价高于1∶200 000,2B9效价较低;Western blot检测表明所有抗体均能识别parvalbumin;抗体亚类为IgG1型,1G1,1A5,2B9,1H4,1B7特异性结合parvalbumin,与其他种类过敏原无交叉反应,1G3和1B5与虾和大豆过敏原有交叉反应性,P/N>2.1。结论获得高效价抗体5株,发现parvalbumin与虾、大豆过敏原存在交叉反应性,为建立parvalbumin检测体系提供依据。     

抗黄曲霉毒素B1单抗制备及免疫学定量方法建立

目的本研究合成并鉴定了AFB1人工抗原,制备AFB1的单克隆抗体(AFB1mAb)。方法采用NHS法将AFB1分别偶联于载体蛋白BSA和OVA上,分别合成W人工抗原AFB1-BSA和AFB1-OVA,紫外分光光度法和SDS-PAGE进行鉴定;AFB1-BSA免疫BALB/C小鼠,通过间接ELISA和阻断ELISA法选择细胞融合备用鼠;用杂交瘤技术制备AFB1mAb,并对其效价、亲和力、敏感性、特异性、亚型进行鉴定;体内诱生腹水法大量制备单抗。结果 UV图谱和SDS-PAGE图表明结半抗原AFB1和载体BSA及OVA偶联成功;筛选出2H5-F6、2H5-C9、2H9-C3三株杂交瘤细胞;鉴定单抗亚型均为IgG1;细胞上清效价1∶2.0×102～1∶1.28×103,2H5-F6的腹水效价1∶1.28×106,AFB1mAb亲和常数Ka为2.65×1010 L/moL,对AFB1的IC50为2.58 ng/mL;与AFB2的交叉反应率为1.61%,与其他类药物无交叉反应。结论通过试验获得高效价、敏感、特异的AFB1mAb,可用于各种食品中AFB1残留的快速免疫学检测试验。     

2型登革病毒NS1蛋白单克隆抗体的生物学特性研究

目的制备抗2型登革病毒NSl蛋白的单克隆抗体（mAb），并鉴定其特性。方法以重组NS1蛋白免疫Balb／c小鼠，采用杂交瘤技术制备抗M蛋白的mAb，采用间接ELISA方法和Westernblot进行mAb特异性鉴定；同时采用间接ELISA方法鉴定mAb相对亲和力。结果获得9株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞Ⅲ1A6andU13D2；相对亲和力均在10^6以上。Westernblot显示9株mAb能特异识别重组NS1蛋白。结论成功地制备出抗登革病毒2型病毒NS1蛋白的9株mAb，为建立快速特异检测登革病毒的实验方法提供了有力的工具。     

靶向新型冠状病毒棘突蛋白中独特B细胞抗原表位小鼠单克隆抗体的制备与应用

目的制备靶向SARS-CoV-2棘突蛋白中独特B细胞抗原表位的小鼠单克隆抗体, 并用于蛋白质免疫印迹、ELISA和免疫荧光检测(IFA)等多种方法。方法利用传统的杂交瘤单克隆抗体技术, 用间接ELISA法筛选和有限稀释法亚克隆获得稳定的阳性单克隆杂交瘤细胞株并鉴定其亚型。选取其中1株6H8体外培养后注射于SCID裸鼠腹腔产生腹水, 用蛋白A层析柱进行亲合纯化。将纯化抗体用于蛋白质免疫印迹、ELISA和IFA检测SARS-CoV-2棘突蛋白。结果共获得5株单克隆杂交瘤细胞系, 均为IgG2亚型。纯化的小鼠单克隆抗体6H8用于蛋白质免疫印迹仅特异性地识别重组表达的SARS-CoV-2棘突蛋白S1;用于ELISA能检测重组表达的SARS-CoV-2棘突蛋白的NTD区, 实验孔吸光度值为3.824;用于IFA可特异性识别瞬间表达于HEK293细胞内的SARS-CoV-2棘突蛋白, 而对瞬间表达于293T细胞内的SARS-CoV棘突蛋白则无交叉反应。结论成功制备了一株靶向SARS-CoV-2棘突蛋白中独特B细胞抗原表位的小鼠单克隆抗体, 为SARS-CoV-2抗原检测提供了有效工具。     

2型猪链球菌溶血素多克隆和单克隆抗体制备及鉴定

目的制备并鉴定2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)四川分离菌株05ZYH33的溶血素(Suilysin,SLY)多克隆和单克隆抗体。方法利用重组SLY蛋白制备SLY兔多抗,优化间接ELISA体系检测多抗效价,Western blot分析SLY多抗特异性,检测SLY兔多抗对人外周血杀菌作用的影响。利用杂交瘤细胞融合技术制备SLY单抗,筛选杂交瘤细胞株并制备小鼠腹水,间接ELISA和Western blot鉴定SLY单抗的效价和特异性。结果间接ELISA显示SLY多抗效价高达1∶204 800,Western blot显示SLY多抗有较高的特异性和免疫反应性,人外周血杀菌试验显示,SLY多抗能加强人外周血对05ZYH33的杀伤作用。间接ELISA检测杂交瘤细胞2B6和5F7培养上清效价分别是1∶800和1∶3 200,单抗效价都为1∶204 800。间接ELISA和Western blot鉴定显示,单抗2B6和5F7具有很强的特异性和免疫反应性。结论成功制备了效价高、特异性强的S.suis 2 05ZYH33 SLY多克隆和单克隆抗体。     

流感病毒M1单克隆抗体的制备及其生物学特征

目的 制备针对流感病毒基质蛋白M1的单克隆抗体(mAb),为研究流感病毒检测试剂盒提供实验材料.方法 以纯化的M1蛋白为免疫原,免疫Balb/c小鼠,将其脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,筛选出分泌抗M1 mAb的杂交瘤细胞,注射小鼠腹腔获得M1 mAb,并用辣根过氧化物酶(HRP)标记M1 mAb.通过Western印迹法、ELISA、细胞感染免疫染色实验检测所获M1 mAb的作用和特性.结果 获得能稳定分泌抗流感病毒基质蛋白M1的杂交瘤细胞系,纯化腹水得到M1 mAb和HRP-M1 mAb.Western印迹法结果显示,M1 mAb和HRP-M1 mAb能与M1抗原及H1N1、H3N2亚型流感病毒的M1蛋白反应,是针对M1蛋白的mAb;利用ELISA方法研究M1 mAb和HRP-M1 mAb对M1抗原及流感病毒的检测作用,结果显示它们能检测H1N1和H3N2亚型的甲型流感病毒,而HRP-M1 mAb的检测能力比M1 mAb强;细胞免疫染色实验显示,M1 mAb能结合H1N1和H3N2亚型病毒感染的细胞.结论 针对M1蛋白的M1 mAb和HRP-M1 mAb已制备成功.它们能检测H1N1和H3N2亚型甲型流感病毒,有望应用于流感病毒诊断以及鉴别诊断试剂盒的研发.     

甲型肝炎病毒H2株单克隆抗体的制备及鉴定

目的 为甲型肝炎病毒(HAV)的诊断和相关研究提供高效价的抗体来源. 方法 用细胞培养获得的H_2株HAV免疫BALB/C小鼠,经细胞融合技术,ELISA筛选和有限稀释克隆化培养. 结果 获得3株能稳定分泌抗HAV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株,命名为6-A8、6-F2和1-H3.经鉴定,其上清和腹水的抗体效价分别为1∶(2048～16 824)和1∶(65 536～524 288).6-A8和6-F2属IgG2a亚型,1-H3属IgG1亚型.染色体数分布在92～98之间.3株细胞株McAb分别能与HAV不同抗原位点结合. 结论 3株能稳定分泌抗HAV McAb的杂交瘤细胞株成功建立,并获得高效价的抗HAV McAb.     

具备中和中东呼吸综合征冠状病毒活性的单克隆抗体的制备

目的制备并鉴定对中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)具有中和活性的单克隆抗体,为进一步开展MERS-CoV感染与免疫保护机制研究,以及发展诊断与治疗手段奠定基础。方法 MERS-CoV S蛋白受体结合区与人IgG Fc片段融合表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫后小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过ELISA筛选出阳性克隆,随后通过多次亚克隆筛选出稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,制备单抗腹水并进行抗体效价测定及亚类鉴定;通过MERS-CoV假病毒及活病毒中和试验筛选出中和单抗。结果获得了10株能够稳定分泌抗原特异性单抗的杂交瘤细胞株。制备的腹水单抗亚类均为IgG1;其中7株单抗抗体ELISA效价达到10 000以上,并有1株单抗对MERS-CoV具有良好的中和活性。结论本研究获得了1株对MERSCoV具有良好中和活性的单克隆抗体。     

人胰岛素生长因子1的原核表达及其单克隆抗体的制备

目的原核表达、纯化人胰岛素样生长因子1（hIGF-I）,并制备其单克隆抗体（mAb）。方法通过RT-PCR方法从人体肝脏组织中扩增得到hIGF-I基因片段,构建重组原核表达质粒pET-28a（＋）/hIGF-I,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。将表达蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,取其脾脏和小鼠杂交瘤细胞融合制备针对hIGF-I的特异性单克隆抗体。结果成功表达出了hIGF-I蛋白。SDS-PAGE电泳显示所表达蛋白质的相对分子量（Mr）大小约为18 KD。获得了1株能够稳定表达抗hIGF-I抗体的杂交瘤细胞株（8F2）,其分泌的mAb的IgG亚类（型）为IgG2b,ELISA检测,对应腹水mAb的效价分别为1∶7.5×10^5。Western-blot结果显示抗hIGF-I mAb具有良好的特异性。结论成功制备了抗hIGF-I mAb,为进一步研究IGF-I在肿瘤治疗中的作用提供了有力的工具。