水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达

目的:构建水蛭素毕赤酵母表达载体,获得重组蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达. 方法: 通过PCR扩增获得水蛭素HV2, HV2-N47K基因,将序列正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,构建表达质粒pPIC9K-HV2, pPIC9K-HV2-N47K. 重组质粒转化宿主菌GSM1168,G418抗性筛选高拷贝的稳定表达菌株,经甲醇诱导表达并对表达产物进行鉴定. 结果: 成功构建了水蛭素毕赤酵母表达载体,获得水蛭素在毕赤酵母中的分泌型表达,表达产物具有抗凝血酶活性. 结论: 水蛭素在毕赤酵母中获得分泌型表达,为研究新药奠定了基础.     

水蛭素基因毕赤酵母表达载体的构建及高拷贝稳定整合菌株的筛选

目的:构建水蛭素变异体HV1毕赤酵母分泌型表达载体,获得高拷贝稳定整合菌株,为大量获得重组水蛭素蛋白,进行功能研究及其临床应用奠定基础. 方法:根据水蛭素HV1的氨基酸序列及毕赤酵母偏爱的密码子,设计HV1编码基因,分为8条寡核苷酸片段进行DNA合成,经磷酸化、退火、连接和PCR扩增得到优化的HV1全长基因,测序结果正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,得到pPIC9K-HV1,SalI线性化后转化毕赤酵母GSM1168,G418梯度筛选转化菌,PCR鉴定目的基因的整合. 结果:获得了水蛭素毕赤酵母表达载体pPIC9K-HV1,G418抗性筛选得到高拷贝菌株,PCR证实目的基因已整合到毕赤酵母染色体中. 结论:成功构建了水蛭素HV1毕赤酵母表达载体,获得了高拷贝稳定整合菌株,为大规模表达纯化HV1蛋白及其临床应用奠定了基础.     

毕赤酵母高密度发酵生产重组人内皮细胞抑制素

目的:在micro DCU-400发酵罐中探讨表达人血管内皮细胞抑制素(Endostatin)的毕赤酵母(GS115)工程菌株的高密度发酵条件.方法:在发酵过程中,控制溶氧30%以上、温度30℃、pH5.3(生长阶段)或5.0(诱导表达阶段),在无机盐培养基中生长约18～22h后,补加50%甘油继续生长约3～5h,OD600达到450以上,开始进行甘油-甲醇混合物逐渐过渡至甲醇、甲醇浓度由低至高、8h后达到最大诱导浓度(0.08ml/min/L)的诱导方式,维持诱导约60h.离心收集上清液.利用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳、酶标检测试剂盒检测表达产物.结果:在诱导表达阶段,OD600最高达到580以上(细胞湿重达到375g/L),表达产量为27.2mg/L,高于摇瓶表达水平(16.3mg/L).结论:在15L发酵罐中成功表达了人血管内皮细胞抑制素,为进一步大批量生产作了准备.     

重组巴斯德毕赤酵母高密度培养中铵离子浓度的影响

采用Mut^s表型的重组毕赤酵母生产血管生长抑制素，表达阶段流加甘油—甲醇混合碳源以提高菌体密度和血管生长抑制素的表达水平，菌体密度可达174g／L，约是表达阶段采用甲醇为单一碳源的发酵过程的3倍。菌体密度的提高导致表达阶段发酵液中铵离子浓度下降很快，当发酵液中的铵离子浓度低至40mmol／L时，影响了血管生长抑制素的表达。改变pH调节方式并在发酵后期添加25mmol／L(NH4)2SO4使发酵液中铵离子浓度维持在150mmol／L以上，血管生长抑制素的表达产量达到108mg／L。     

巴斯德毕赤酵母表达的人抑瘤素M发酵条件及发酵产物分析

目的：研究巴斯德毕赤酵母表达的人抑瘤素M（hOSM）大规模发酵条件。方法：利用hOSM毕赤酵母高表达菌株,于试管水平进行发酵pH条件的摸索,以补料分批培养方式在 80 L发酵罐中对hOSM工程菌进行3个批次的高密度发酵,控制和优化各种发酵条件,通过SDS-PAGE对发酵产物进行分析。结果：最终确定在pH 5.0的FM21培养基中扩增菌体,待菌体密度达190 g/L 时添加甲醇诱导,在发酵液pH 5.5的条件下,发酵温度稳定在28℃,通入空气的流量为2 vvm, 转速为650 r/min,罐内压力为10 P,溶解氧保持在25%左右,甲醇流加速度在9.3 mL/h/L 初始发酵液体积,诱导36 h时结束发酵,hOSM占分泌总蛋白的28%,产量达到280 mg?L-1。结论：应用hOSM工程菌能够进行稳定的发酵,为进行下一步生物学功能测定提供充足的物质基础。     

人抑瘤素M在毕赤酵母中的高效分泌表达

目的：在毕赤酵母中高效分泌表达重组人抑瘤素M（rhOSM）。方法：以人胚胎组织DNA为模板通过PCR技术获得hOSM基因,构建毕赤酵母真核表达载体pPICZαC-hOSM,电转化毕赤酵母菌株X-33,PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE和Western blotting方法筛选能够稳定、高效分泌表达rhOSM的酵母工程菌。结果：经PCR法获得了hOSM基因,培养液上清经SDS-PAGE和Western blotting证实获得了相对分子质量约为28 000的rhOSM,表达量为45　mg•L^-1。结论：毕赤酵母表达系统能够稳定、高效分泌表达rhOSM,摇瓶规模表达量为45 mg•L^-1。     

重组水蛭素药理学研究进展

1955年Markwardt从医用水蛭咽周腺体中成功地分离出水蛭素纯品。水蛭素是一种高效、特异的凝血酶抑制剂,具有强大的抗凝、抗栓活性。但因水蛭来源匮乏,使水蛭素的研究与临床应用受到限制。随着分子生物学和基因工程技术的发展,使其人工合成成为可能。自1986年以来,国外已有几个实验室成功地应用基因工程方法获得相当量的结构与药理活性     

毕赤酵母菌分泌表达重组抑肽酶的高密度发酵工艺研究

目的:对毕赤酵母高密度表达重组抑肽酶的发酵工艺进行探讨。方法:先通过摇瓶培养方法,确定表达抑肽酶的毕赤酵母在BSM培养基中生长所需的最佳配方。在此基础上,采用分批补料培养方法,对毕赤酵母pSA/GS115进行高密度发酵。紫外吸收法测定重组抑肽酶竞争性抑制胰蛋白酶对底物BAEE的水解活性。结果:BSM培养基中毕赤酵母生长必需的最佳配方为甘油40 g.L-1、氨水单次补加量0.1%、甲醇流加量1%。经过毕赤酵母高密度发酵,发酵液上清中蛋白的表达量为37.08 mg.L-1,目的蛋白活性达到4 450 BAEEU.ml-1,比摇瓶培养表达提高了8倍。结论:本发酵工艺可实现酵母工程菌的高密度表达发酵,其发酵产物具有较高的生物活性,为下一步大规模化制备抑肽酶奠定了基础。     

重组毕赤酵母表达reteplase发酵过程中的降解现象

研究了pH和温度对重组毕赤酵母表达retep lase(rPA)发酵过程中的降解现象。在低pH(4.5)诱导条件下,由于蛋白酶活性高,rPA降解严重,表达量几乎为0,提高诱导pH至6.5,蛋白酶活性降低,rPA的表达量最高达到122 m g/L。通过将诱导温度从30°C降低到20°C,rPA的表达量从153.2 m g/L提高到207.9 m g/L。降低温度能减少细胞死亡率,从而减少了发酵液中蛋白酶的释放,降低了蛋白酶的活性,抑制了对目的蛋白rPA的降解。另外,低温使胞内AOX酶活性提高,从而增强了rPA的表达。     

培养条件对重组毕赤酵母高密度表达猪胰岛素前体的影响

研究了基因工程菌P ich ia p astotis高密度、高表达的培养条件。在全合成摇瓶培养基的基础上,考察了诱导过程中甲醇浓度、温度、pH、(NH4)2SO4及磷酸盐浓度等因素对猪胰岛素前体(P IP)表达的影响。研究表明:甲醇的最佳诱导浓度为6 g/L,过高或过低的甲醇浓度都不利于菌体生长和蛋白表达;在菌体生长和蛋白表达阶段,pH应分别控制在5.5和4.0;诱导阶段,培养温度下降到28°C,可以提高重组蛋白质的表达量。上述结果用于15 L全自动发酵罐实验,P IP表达水平达到了1.69 g/L,是摇瓶结果的17倍。     

重组水蛭素对恒河猴长期毒性研究

目的:观察连续静注重组水蛭素 30 d对恒河猴的长期毒性.方法:健康雌雄恒河猴分别按体质量随机分为低、中、高剂量组(1.0、3.0和6.0 mg/kg)和空白对照组.连续30 d静注给药.末次给药后处死一半动物做病理解剖,另一半停药后继续观察15 d.观察和检测项目包括:(1)一般症状; (2)心电图; (3)凝血时间(CT)等血液学指标; (4) 凝血酶时间(TT)、部分凝血活酶时间(aPTT)等血液生化指标; (5)尿液检查; (6) 抗体测定; (7) 骨髓检查; (8)病理检查.结果:动物连续给药后,d15及d30给药后30 min采集的血样中,与d0或空白对照组相比,高、中、低剂量组的CT、TT、aPTT明显延长,且有量效关系.d15及d30给药后24 h及d45采集的血样中,上述指标恢复正常.d30及d45病理组织学检查发现每组均有部分动物出现肝、肾淤血,轻度细胞水肿,可能系动物的隐性感染而非药物所致.d30各组均可见部分动物注射部位皮肤出现小灶性出血和局部炎症反应,d45注射部位病理变化消失.其余观察指标未见明显异常.结论:重组水蛭素对猴血液系统有一定的药理毒理作用,主要表现为使高、中、低剂量组猴CT、TT、aPTT时间延长,且有量效关系.因此,重组水蛭素对猴药理毒理作用的靶器官为血液系统,其作用均是可逆的.重组水蛭素对猴的安全剂量为1.0 mg/kg.临床使用时应密切注意重组水蛭素对血液系统的影响.     

重组水蛭素临床应用的研究进展

重组水蛭素是一种特异的凝血酶抑制剂,它能与血浆中游离的和与纤维蛋白结合的凝血酶结合,以防止血栓形成。本文综述了重组水蛭素的临床应用,包括急性心肌梗死溶栓后的辅助治疗、治疗不稳定型心绞痛、深静脉血栓、Ⅱ型肝素相关的血小板减少症和弥漫性血管内凝血,并在血液透析和体外循环时预防血栓形成。     

大鼠谷氨酸脱羧酶(GAD)毕赤酵母表达重组子的构建

目的 :构建大鼠谷氨酸脱羧酶(glutamicaciddecarboxylase,GAD)巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达重组子 ,探索一条真核细胞高效表达rGAD的新途径。方法 :以 pUC18_GAD质粒为模板PCR扩增出大鼠GAD65基因 ,将其克隆入PGEM_Teasy载体 ,继而将其克隆到毕赤酵母分泌型质粒表达载体 pPIC9K中 ,重组质粒线性化后PEG法转染入毕赤酵母菌株GS115,PCR筛选转化子。结果 :DNA序列分析和PCR鉴定表明成功构建了大鼠谷氨酸脱羧酶 (GAD)毕赤酵母表达重组子。结论 :为今后基因工程大量生产GAD抗原打下了基础     

发酵液中重组水蛭素的分离纯化

目的：建立毕赤酵母(pichia)高密度表达的重组水蛭素(recombinant hirudin-2,rHV2)分离纯化工艺。方法：高密度培养重组毕赤酵母并诱导表达水蛭素至胞外,发酵液经超滤、透析、离子交换层析。分离纯化rHV2目的蛋白;采用SDS-PAGE和抗凝血酶活力分别检测目的蛋白纯度和活性。结果：纯化样品经SDS-PAGE电泳检测为单一条带,重组水蛭素比活性为6000ATU／mg,纯化收率达38．6％。结论：超滤、透析和离子交换层析可用于发酵液中大规模分离纯化重组水蛭素。     

重组水蛭素Ⅲ的抗凝与抗血栓作用研究

目的　研究了自行研制的重组水蛭素Ⅲ在大肠杆菌中的分泌表达产物的抗凝与抗血栓作用。方法　采用大鼠下腔静脉血栓模型和大鼠体外A V循环模型进行水蛭素Ⅲ (HV3)的抗凝及抗血栓作用研究。结果　给予重组水蛭素 2 5 ,5 0 μg/kg两剂量的大鼠下腔静脉血栓重量分别为 2 1.30± 7.35mg和 10 .4 0± 16 .2 0mg ,生理盐水对照组为 5 9.5 0± 4 .95mg ;重组水蛭素 5 0、2 5 μg/kg的血栓湿重为 15 .3± 3.6mg和 2 1.5± 5 .3mg ,生理盐水对照组为 4 8.6± 4 .9mg。结论　重组水蛭素Ⅲ可显著减少静脉血栓重量 ,能显著地降低体外循环的血栓湿重 ,与生理盐水组比较具有很显著的差异 ,结合体外抗凝实验等结果表明 ,重组水蛭素Ⅲ具有很强的体外和体内抗凝抗栓作用 ,应用前景良好     

山蛭素Hs基因在甲醇毕赤酵母中表达

[目的]山蛭素基因在甲醇毕赤酵母中表达。[方法]利用PCR点突变方法改造山蛭素基因，将山蛭素基因克隆到pGEM-Teasy载体中，对重组质粒测序，构建了毕赤酵母表达载体pPIZB-Hs，然后转化有活性的GS115酵母菌株，筛选表达酵母菌株GS115，摇瓶发酵。[结果]改造的山蛭素基因在重组酵母中表达，重组蛋白质具有对凝血酶抑制活性。[结论]利用PCR点突变方法能改造山蛭素基因，并能在毕赤酵母中表达。     

重组小鼠凝血因子Ⅶ毕赤酵母表达载体的构建及整合体的筛选

目的构建无凝血活性的重组小鼠凝血因子Ⅶ(rmFⅦ)毕赤酵母分泌型表达载体,获得高拷贝稳定整合菌株,为大量获得rmFⅦ蛋白,进行功能研究及其临床应用奠定基础。方法PCR扩增得到mFⅦ基因片段,插入酵母表达载体pPIC9K的α分泌信号开放阅读框的下游,再经定点突变(K341A)得到pPIC9KrmFⅦ,测序正确的质粒用SacⅠ线性化后电穿孔转化毕赤酵母GS115,G418梯度筛选转化菌,PCR鉴定目的基因的整合。结果获得了rmFⅦ毕赤酵母表达载体pPIC9KrmFⅦ,G418抗性筛选得到高拷贝菌株,PCR证实目的基因已整合到毕赤酵母染色体中。结论成功构建了rmFⅦ毕赤酵母表达载体,获得了高拷贝稳定整合菌株,为大规模表达纯化rmFⅦ蛋白及后续研究奠定了基础。     

基因工程菌Pichia pastoris高密度发酵表达重组人血清白蛋白

在摇瓶条件下对基因工程菌Pichia pastoris的发酵条件进行了实验，并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料分批高密度发酵。在分批发酵时，接种量为10%且种子细胞光密度（OD600）为20左右时，细胞生长的延迟期约为2.11h，细胞生长光密度与培养时间的关系模型为：y=0.7841e^0.2319t（线性相关系数r=0.9936）；在补料发酵时细胞浓度可达115g/L-160g/L（干重），在120h重组人血清白蛋白表达量达3.6g/L。     

大肠杆菌分泌表达重组水蛭素Ⅲ的新方法研究

目的:在已有的分泌表达载体pTASH基础之上构建一种更为高效的新型大肠杆菌分泌表达载体,并检验其分泌表达水平是否提高。方法:提取原始质粒pTASH作为模板,用PCR扩增重组水蛭素基因表达盒片段以后,再插入到原表达载体pTASH的BamHⅠ位点上,从而产生含有两个串联的水蛭素基因表达盒单元的质粒p(TASH)2,转入大肠杆菌进行摇瓶表达。结果:双表达盒菌种p(TASH)2进行摇瓶水平的培养,其上清液抗凝血酶活性可达3 500 ATU.ml-1。结论:与单表达盒质粒pTASH的表达水平(2 000 ATU.ml-1)相比,双表达盒质粒p(TASH)2的摇瓶表达水平显著提高。