汉防己甲素等5种抗纤维化药物对离体兔角膜基质细胞的抑制作用

目的比较汉防己甲素等5种抗纤维化药物对离体兔角膜基质细胞的抑制作用,为减轻角膜创伤愈合反应提供一种新药。方法选用原代及传代兔角膜基质细胞,实验组分别加入含不同浓度汉防己甲素、TGF-β抗体、α-2b干扰素、维拉帕米、氟美童的培养液,对照组加入含等量PBS的培养液,分别培养24h、48h、72h后,采用MTT法检测其对细胞增殖的抑制作用,计算出抑制率和IC50,并对其进行比较。结果汉防己甲素在各时间段各浓度组,均能明显抑制角膜基质细胞的增殖,其24h、48h、72h的IC50分别为4·407mg·L-1、3.758mg·L-1和3.524mg·L-1,并具有明显的时间剂量-效应依赖关系。TGF-β抗体在各时间段各浓度组均有较强抑制作用,其IC50分别为6.550mg·L-1、4.060mg·L-1和3.860mg·L-1。α-2b干扰素在各时间段各浓度组均有抑制作用,但作用都较弱。维拉帕米的抑制作用不确切。氟美童在各时间段各浓度组均有确切的抑制作用,其IC50分别为36.190mg·L-1、43.742mg·L-1和47.052mg·L-1。结论在5种药物中,汉防己甲素对离体兔角膜基质细胞增殖的抑制作用最强,且明显强于激素类药物氟美童,因此在减轻角膜创伤愈合方面具有潜在的运用前景。     

汉防己甲素对实验性葡萄膜炎的治疗作用及机制

用牛血清白蛋白诱发了家兔实验性葡萄膜炎。汉防己甲素(Tet 50 mg/kg/d ip)和地塞米松（Dex 5 mg/kg/d ip）治疗8天，能显著降低眼部炎症反应、房水蛋白含量、血清免疫复合物和外周T淋巴细胞转化率。停止给药后4天,Dex组房水蛋白和血清免疫复合物再度升高。Tet组虽有升高，但比Dex组明显为低。病理学检查发现Tet组脉络膜炎症比对照组明显为轻。结果表明，Tet抑制实验性葡萄膜炎，除了其抗炎作用外，还与其抑制体液和细胞免疫反应有关。 （中华眼底病杂志，1994，10：149-152）     

汉防己甲素抑制自由基眼损伤的实验研究

目的 搪塞汉防己甲素对自由基眼损伤的影响。方法 将２４只实验兔随机分为汉防己甲素组及对照组。术后动态测定房水中丙醛含量。结果 汉防己甲素丙二醛含量明显低于对照组。结论 汉防己甲素能够显著抑制自由基引起的眼损伤。     

汉防己甲素对体外培养的兔结膜成纤维细胞抑制作用的实验研究

目的：观察汉防己甲素（Tet)对体外培养的兔结膜成纤维细胞（RCF）生长的抑制作用，探讨其作用的可能机制，为防治与成纤维细胞增殖相关的多种眼病提供一种有效的药物。方法：应用MTT法测定不同浓度的Tet对RCF的抑制作用；用细胞计数法观察不同浓度的Tet在不同时间下对RCF的生长抑制作用；用流式细胞仪检测Tet对RCF细胞周期的影响。结果：给药48小时后，终浓度为0．16、0．8、4、20、100μg/ml的Tet对RCF的生长均明显抑制作用；且在上述不同浓度的Tet作用下，于1、3、5、7天计数细胞，发现Tet对RCF的抑制具有时间、剂量关系。流式细胞仪显示，RCF经2μ/mlTet处理48h后，G1期细胞增加了13．3％，S期细胞下降了9．55％，G2期细胞下降了4．23％。结论：汉防己甲素可抑制RCF生长，有时间剂量效应。Tet影响RCF细胞周期各时相群体，抑制G1期向S期的过渡，进而阻止细胞向G2期的过渡，从而抑制细胞增殖。     

血竭素高氯酸盐促进离体兔角膜基质细胞凋亡的作用

目的 观察天然药物血竭素高氯酸盐(Dp)对离体兔角膜基质细胞增生的抑制作用,探讨其对细胞凋亡的影响,为临床上角膜瘢痕的防治提供新思路.方法 新西兰白兔18只,采用组织块培养法,在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养兔角膜基质细胞,通过含有EDTA的胰蛋白酶消化进行传代.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测不同质量浓度Dp(10～80 μg/mL)对细胞生长的抑制率,电镜观察Dp作用后角膜细胞的凋亡情况,流式细胞术(FCM)检测Dp作用后细胞凋亡率.结果 第3代角膜基质细胞呈现对波形蛋白单克隆抗体阳性反应和对角蛋白12多克隆抗体的阴性反应.角膜上皮细胞对角蛋白12抗体呈现绿色的荧光反应.Dp作用24、48、72 h后,其IC50分别为47.721、41.40、32.01 μg/mL.MTT比色法显示Dp对角膜基质细胞的抑制率呈现明显的质量浓度依赖性;电镜可观察到角膜细胞的凋亡;FCM检测Dp作用24 h的细胞凋亡率呈剂量依赖性升高(P<0.01).在Dp作用后24、48、72 h,Dp质量浓度与抑制率呈正相关(r=0.984,P<0.01;r=0.947,P=0.007;r=0.920,P=0.03).结论 Dp对兔角膜基质细胞的增生具有显著的抑制作用,且呈量效关系促进角膜基质细胞发生凋亡.     

汉防己甲素对翼状胬肉成纤维细胞基质金属蛋白酶的影响

目的:观察汉防己甲素(Tet)对翼状胬肉成纤维细胞基质金属蛋白酶(MMP)分泌及表达的影响.方法:收集正常球结膜与初发翼状胬肉成纤维细胞培养的上清液,ELISA法检测两种细胞培养上清液中MMP-1,MMP-3,MMP-9的含量及10-5mol/L的Tet作用48h翼状胬肉成纤维细胞培养的上清液中含量的变化.荧光定量PCR检测10-5mol/L的Tet对翼状胬肉成纤维细胞MMP-3mRNA表达的影响.结果:培养的初发翼状胬肉成纤维细胞上清中MMP-1,MMP-3含量较正常成纤维细胞上清中含量高[MMP-1:26928±1135→3148±74(ng/L),MMP-3:52593±1031→12490±3126(ng/L),P＜O.01],加入10-5 mol/LTet作用48h后明显下降[MMP-1:26928±1135→15064±533(ng/L),MMP-3:52593±1031→29943±561(ng/L),P＜O.01].培养的正常结膜及初发翼状胬肉成纤维细胞上清中未检测到MMP-9.初发翼状胬肉成纤维细胞MMP-3 mRNA是正常结膜组织成纤维细胞的3倍,10-5mol/L的Tet作用24h后表达量下降了27.1%.结论:Tet对翼状胬肉成纤维细胞MMP-1,MMP-3的分泌有明显的抑制作用,并能抑制其细胞MMP-3 mRNA表达量.     

汉防己甲素抑制兔晶状体后囊膜混浊

目的 探讨汉防己甲素对白内障摘除术后晶状体后囊膜混浊形成的影响及其作用机制。方法 对48只实验兔行单眼囊外晶状体摘除及人工晶状体植入术。术前随机分为A组对照、B组术后结膜下注射地塞米松、C组术后结下注射汉防己甲素和D组术中植入汉防己甲素镀膜人工晶状体。术后不同时间检测各组术眼的房水细胞数、蛋白质和丙二醛含量,记录晶状体后囊膜混浊程度和湿重。结果 除术后14d房水丙二醛含量外,囊外晶状体摘除术后不同时间4个组的房水细胞数、蛋白质和丙二醛含量,以及晶状体后囊膜混浊的程度和湿重差异均有显著意义（P＜0．05）。其中B和C组术后不同时间房水细胞数、蛋白质和丙二醛含量均低于A组,差异有显著意义（P＜0．05）;B、C和D组术后不同时间晶状体后囊膜混混的程度和湿重均低于A组,差异有显著意义（P＜0．05）。结论 防汉己甲素可有效抑制兔眼晶状体摘除术后晶状体后囊膜混浊的形成;其最佳用药剂量和途径尚需深入探讨。     

汉防己甲素对翼状胬肉成纤维细胞抑制作用的实验研究

目的观察汉防己甲素对体外培养的翼状胬肉成纤维细胞的抑制作用，寻找治疗翼状胬肉和预防其复发的有效药物。方法用MTT比色法测定不同浓度的汉防己甲素对体外培养的翼状胬肉成纤维细胞增生的抑制作用，并与丝裂霉素C（MMC）进行比较；用荧光定量PCR检测10^-5mol／L的汉防己甲素对翼状胬肉成纤维细胞基质金属蛋白酶（MMP）MMP-3 mRNA的表达的影响。结果不同浓度的汉防己甲素对体外培养的翼状胬肉成纤维细胞的增生均有明显的抑制作用（P〈0．01）；10^-5mol／L的汉防己甲素作用24h其MMP-3 mRNA的表达量下降了27．12％。结论汉防己甲素对翼状胬肉成纤维细胞具有明显的抑制作用，可望用于对翼状胬肉的治疗。     

汉防己甲素抑制兔人工晶状体前膜形成的研究

人工晶状体前膜形成是囊外白内障摘除人工晶状体植入术后影响术眼复明效果的主要并发症之一。本研究采用动物实验方法 ,动态观察汉防己甲素对人工晶状体前膜形成的影响。一、材料和方法1 材料 :选择兔龄 4～ 6个月、平均体重 (2 76± 0 43)ｋｇ的大耳白兔 36只 (72只眼 ) ,制成双眼外伤性白内障模型 ,3ｄ后行囊外白内障摘除及后房型人工晶状体植入术。2 方法 :手术后将 36只兔随机分为 3个组 ,第 1组 :结膜下注射生理盐水 0 5ｍｌ,作为空白对照组 ;第 2组 :结膜下注射地塞米松 2 5ｍｇ;第 3组 :结膜下注射汉防己甲素注射液 (河南医科大…     

汉防己甲素对PRK术后纤维连接蛋白的影响

目的探讨汉防己甲素(tetrandrine,Tet)对兔准分子激光屈光性角膜切削术(photorefractive keratectomy,PRK)术后纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的抑制作用,并初步探讨其机制。方法健康新西兰大耳白兔60只,雌雄不限。随机分为实验组Tet0.5g·L-1组、1g·L-1组、2g·L-1组,艾氟龙(FML,1g·L-1)阳性对照组及生理盐水阴性对照组。于PRK术后1周、2周、1个月、2个月用裂隙灯显微镜进行Haze的分级并记录,用免疫组织化学法检测角膜基质FN的表达,并应用计算机图像分析系统进行定量分析。结果不同浓度Tet、FML滴眼,术后各时间点Haze形成明显减轻,与生理盐水相比差异有显著统计学意义(P<0.01)。正常兔角膜基质FN为阴性表达;PRK术后1个月生理盐水组角膜基质细胞FN呈强阳性表达;Tet各浓度组FN呈弱阳性表达;FML组FN呈阳性表达。Tet各浓度组与FML组、生理盐水组相比差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论Tet可能是通过减少细胞外基质——FN的生成而发挥其对Haze的抑制作用。     

汉防己甲素诱导人眼Tenon囊成纤维细胞的凋亡效应

目的 研究汉防己甲素(Tet)抑制人眼Tenon囊成纤维细胞(TCFs)的凋亡效应.方法 用组织块混合消化液培养法体外培养人眼TCFs,并对培养的传代细胞进行形态学鉴定.通过透射电镜、TUNEL法和流式细胞仪观察Tet抑制人眼TCFs的凋亡作用.结果 人眼TCFs体外生长良好.透射电镜下见Tet处理后的人眼TCFs细胞质固缩,呈现凋亡表现;TUNEL法可见Tet组出现大量的阳性凋亡细胞;流式细胞仪检测TCFs经Tet作用后G_0/G_1期细胞减少22.2%,S期细胞增加20.53%,G_2/M期细胞增加1.6%,Tet抑制TCFs细胞周期于G1期,Tet组凋亡率明显高于对照组(P=0.000).结论 Tet可以诱导人眼TCFs发生凋亡,进而发挥其抑制增生的作用.     

兔角膜内皮、上皮及基质细胞体外培养扩增的研究

目的 建立角膜上皮、基质及内皮细胞体外培养扩增的简单稳定的方法，为组织工程化角膜的构建提供种子细胞。方法 内皮细胞与后弹力层在培养基中孵育后消化法获原代细胞，胰酶消化去除表层上皮后取角膜缘，组织块法培养角膜缘上皮细胞，基质细胞应用胶原酶消化法获原代培养，各细胞融合后胰酶消化依次传代培养。结果 原代内皮细胞4—5d融合成单层细胞，可连续传6—7代。上皮细胞1周左右生长融合，连续传3—4代后细胞形态改变。基质细胞接种6—7d后近融合，传代后增殖明显，可连续传10代。结论依据角膜组织特征选择合适的方法体外分离、培养角膜3种细胞成分，可获连续传代扩增的角膜细胞。     

Early keratocyte apoptosis after epithelial scrape injury in the human cornea

Animal studies in mice, rats, rabbits, pigs and hens demonstrated that anterior keratocytes undergo programmed cell death or apoptosis after corneal epithelial injury. Many other wound healing changes subsequently follow the keratocyte apoptosis response. This study evaluated early keratocyte apoptosis after corneal epithelial scrape injury in human eyes scheduled for enucleation for malignancy. Two eyes had corneal epithelial scrape 1 h prior to the enucleation and another eye served as a control and had no corneal scrape prior to enucleation. One additional eye was enucleated, washed with balanced salt solution, and then had the corneal epithelium scraped 1 h prior to processing for analysis. Apoptosis was identified by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) assay and confirmed by transmission electron microscopy (TEM). Anterior keratocyte apoptosis was detected in the three corneas that had epithelial scrape injury, but not in the control unwounded cornea. This study confirmed that keratocyte apoptosis is also an early response to corneal epithelial injury in humans and showed that tears are not essential for keratocyte apoptosis to occur in response to epithelial injury.     

准分子激光角膜切削术与磨镶术后兔角膜基质细胞凋亡的研究

目的研究准分子激光角膜切削术(photorefractive keratectomy,PRK)和准分子激光原位角膜磨镶术(laser in situ keratomileusis,LASIK)后不同时间点角膜基质细胞凋亡的特点并探索不同手术方式、不同的矫正度数对角膜基质细胞凋亡水平的影响。方法50只新西兰纯种白兔随机分为A、B两大组,每组25只;A组兔子为PRK组,B组兔子为LASIK组;每组兔子左眼进行-4.0D激光切削,右眼进行-8.0D激光切削。分别在术后4h、24h、1w、4w和3m五个时间点处死兔子,每个时间点每组随即处死5只兔子,取兔角膜制作病理切片,行透射电镜检查,用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)原位显示凋亡细胞,激光扫描共聚焦显微镜观察凋亡细胞形态,定量统计比较凋亡水平的差别。结果在术后4h、24hPRK组角膜基质中凋亡细胞较多,其中PRK-8.0D组的凋亡细胞数较PRK-4.0D组多,其差异有显著性意义(P<0.05);在术后4h、24h两个时间点,PRK-8.0D组与LASIK-8.0D组的角膜基质中的凋亡细胞数进行比较,两者差异有显著性意义(P<0.05);在不同的时间点,LASIK-4.0D组与LASIK-8.0D组TUNEL阳性细胞计数的比较,两者之间差异无显著性意义(P>0.05)。结论LASIK术后角膜基质细胞的凋亡水平较PRK低,凋亡程度与制瓣中的角膜损伤有关,与切削深度无明显相关;PRK术后角膜基质细胞的凋亡水平随切削深度增加而增高。     

LASIK术后远期角膜基质细胞及内皮细胞的共焦显微镜观察

目的应用共焦显微镜在细胞水平观察术后远期角膜基质细胞及内皮细胞变化。方法选择我院门诊行LASIK手术患者68例68眼,根据术前球镜度数,分为高度近视眼组(36例36眼)和低、中度近视眼组(32例32眼),术后随访6～44月,同时选择门诊行屈光检查的近视患者61例122眼作为对照组,对所有患者行共焦显微镜检查,并对结果进行统计学分析,比较LASIK手术对角膜基质及内皮细胞的影响。结果LASIK术后,高度近视眼组角膜前、后基质角膜细胞密度均减少,内皮细胞密度下降,内皮细胞多形性百分比增加,异型性百分比下降,与对照组之间差异有统计学意义(t=0.4077,P=0.000)。LASIK术后界面下基质角膜细胞密度明显减少(562个·mm-2±86个·mm-2),“无细胞区”长期存在;含“无细胞区”的基质深度与激光能量、削切深度、手术时间、年龄均无相关性。结论术后远期,适量激光切削对低、中度近视眼的角膜深层组织影响较小,对高度近视眼影响较大,所以高度近视眼应慎行LASIK手术。     

脂质体介导Bcl-xL基因体外转染人角膜基质细胞的动态表达

目的:观察脂质体LipofectamineTM(LF)2000介导Bcl-xL基因在人角膜基质细胞中表达的时间规律。方法:Bcl-xL/LF2000载体复合物转染人角膜基质细胞,转染后1～15d,采用定量RT-PCR及流式细胞计数法检测目的基因Bcl-xL表达阳性细胞率,观察目的基因在角膜基质细胞中表达的时间变化规律。结果:RT-PCR及流式细胞计数法均显示:在转染后1d开始检测到Bcl-xL表达阳性细胞,阳性率在转染后3d最高(48.3%),此后逐渐降低,转染后15d有少量细胞仍表达Bcl-xL基因。结论:LF2000能有效介导外源基因Bcl-xL转染人角膜基质细胞。     

汉防己甲素抑制翼状胬肉成纤维细胞增殖的研究

目的:观察汉防己甲素对体外培养的翼状胬肉成纤维细胞增殖抑制作用并探讨其机制,寻找治疗翼状胬肉和预防其复发的有效药物.方法:(1)倒置相差显微镜下观察不同浓度的Tet作用下,体外培养的翼状胬肉成纤维细胞形态的变化,并与丝裂霉素(Mitomycin,MMC)进行比较.(2)MTT比色法测定不同浓度的Tet作用48h对体外培养的翼状胬肉成纤维细胞增殖的抑制作用,并与MMC进行比较.(3)流式细胞仪检测不同浓度的Tet作用48h,体外培养的翼状胬肉成纤维细胞细胞周期的变化.结果:(1) Tet作用下,细胞胞体收缩,变圆,间隙增宽,药物浓度高时,细胞碎裂,浮起.0.1,0.2g/L MMC作用下大量细胞碎裂,溶解.(2)不同浓度的Tet作用48h对体外培养的翼状胬肉成纤维细胞的增殖均有明显的抑制作用(P＜0.01);0.1g/L与0.2g/L MMC、4×10-5 mol/L Tet与0.2g/L MMC对翼状胬肉成纤维细胞活性的影响无显著性差异(P＞0.05).Tet的IC50接近10-5mol/L(为0.848×10-5mol/L).(3)Tet作用下,翼状胬肉成纤维细胞周期中S期细胞增多,浓度越高,作用越明显.结论:汉防己甲素对翼状胬肉成纤维细胞的增殖具有明显的抑制作用,呈剂量依赖性,细胞分裂被阻止在S期(DNA合成期).可望用于对翼状胬肉的治疗.     

汉防己甲素滴眼液抑制角膜移植术后排斥反应及植片细胞学改变

目的 探讨0．5％汉防己甲素（Tet）滴眼液抑制角膜移植排斥反应及植片病理细胞学变化。方法 建立大鼠角膜移植排斥反应模型，随机分2组，A组为对照组、B组为0．5％Tet滴眼液组。术后比较各组植片排斥指数（RI）及植片排斥发生时间，并对植片内细胞进行分类并记数、分析。结果 术后各组RI及植片排斥时间，A组与B组相比差异均有显著统计学意义（P〈0．01）。A组和B组炎性细胞数比较差异均有显著统计学意义（P〈0．01）。结论 0．5％Tet滴眼液可有效抑制角膜移植排斥反应。     

Characterization of corneal keratocyte morphology and mechanical activity within 3-D collagen matrices

The purpose of this study was to assess quantitatively the differences in morphology, cytoskeletal organization and mechanical behavior between quiescent corneal keratocytes and activated fibroblasts in a 3-D culture model. Primary cultures of rabbit corneal keratocytes and fibroblasts were plated inside type I collagen matrices in serum-free media or 10% FBS, and allowed to spread for 1-5 days. Following F-actin labeling using phalloidin, and immunolabeling of tubulin, α-smooth muscle actin or connexin 43, fluorescent and reflected light (for collagen fibrils) 3-D optical section images were acquired using laser confocal microscopy. In other experiments, dynamic imaging was performed using differential interference contrast microscopy, and finite element modeling was used to map ECM deformations. Corneal keratocytes developed a stellate morphology with numerous cell processes that ran a tortuous path between and along collagen fibrils without any apparent impact on their alignment. Fibroblasts on the other hand, had a more bipolar morphology with pseudopodial processes (P ≤ 0.001). Time-lapse imaging of keratocytes revealed occasional extension and retraction of dendritic processes with only transient displacements of collagen fibrils, whereas fibroblasts exerted stronger myosin II-dependent contractile forces (P < 0.01), causing increased compaction and alignment of collagen at the ends of the pseudopodia (P < 0.001). At high cell density, both keratocytes and fibroblasts appeared to form a 3-D network connected via gap junctions. Overall, this experimental model provides a unique platform for quantitative investigation of the morphological, cytoskeletal and contractile behavior of corneal keratocytes (i.e. their mechanical phenotype) in a 3-D microenvironment.