成人骨髓源性神经干细胞的致瘤性研究

目的研究体外培养的成人骨髓源性神经干细胞的致瘤性。方法对骨髓源性神经干细胞分别进行细胞形态学观察、刀豆球蛋白A凝集试验和双层软琼脂培养以探明其是否具有恶性转化细胞的形态特征、表面结构及生长特性的变化：利用免疫细胞化学的方法检测骨髓源性神经干细胞的端粒酶和肿瘤相关基因的表达：将骨髓源性神经干细胞接种到裸鼠体内观察其成瘤性。结果骨髓源性神经干细胞不具有恶性转化细胞的形态特征，在不同刀豆球蛋白A浓度下均未见明显的凝集反应，在双层软琼脂不能形成细胞克隆；骨髓源性神经干细胞的c-myc、c-fos和p53基因均呈阴性表达，而端粒酶逆转录酶呈弱阳性表达：将骨髓源性神经干细胞接种于裸鼠皮下6个月未见肿瘤形成，亦未见其它组织形成。结论骨髓源性神经干细胞保持了正常细胞的生物学特征．体内和体外的各项指标均未提示其具有致瘤性．体外的培养条件没有使其发生恶性转化．从致瘤性方面证实了骨髓源性神经干细胞临床移植的安全性。     

人类神经干细胞系来源的肿瘤细胞系染色体G-显带比较分析

目的比较人类神经干细胞源肿瘤细胞系和人类神经干细胞系染色体G-显带的差异,探讨神经干细胞成瘤性机制.方法制备人类神经干细胞系和其来源的肿瘤细胞系(T1和T2)细胞分裂中期染色体,胰酶处理后,经吉姆萨染色,用cytoscan-karyotyping FISH＆CGH软件进行G-显带分析.结果人类神经干细胞源肿瘤细胞系染色体发生缺失、易位、双着丝粒等结构改变以及染色体数目改变,核型从46,XX到69,XX不等.结论人类神经干细胞来源的肿瘤细胞系染色体发生异常改变,表现为数量变化和结构重排.     

骨髓源性神经干细胞体外培养体系的安全性评价

目的评价成人骨髓源性神经干细胞体外培养体系的安全性。方法对骨髓源性神经干细胞的培养上清分别进行无菌试验、支原体检测、热原质检测和异常毒性试验。结果骨髓源性神经干细胞的培养上清经培养无细菌和真菌生长，PCR检测未扩增出支原体的特异性片断，培养上清的热原质含量符合规定的限度，进行异常毒性试验的动物在观察期内未出现局部和全身异常反应，结论骨髓源性神经干细胞的培养体系中不含有对人体移植具有潜在危害的因素，整个培养流程和培养体系是安全可靠的。     

人脐血间充质干细胞向成心肌细胞诱导扩增后的生物安全性评价

背景：人脐血间充质干细胞在体外分离培养并向心肌细胞诱导分化的条件下，能否仍然维持原有的正常生理性状态，即是否达到种子细胞的生物安全性标准，目前尚少见研究。 目的：分析人脐血间充质干细胞在体外分离培养及向心肌细胞诱导分化的条件下，其染色体核型及端粒酶活性是否发生异常的改变及细胞是否产生致肿瘤性。 方法：采用染色体G显带处理方法体外分离、培养的第3代以后的人脐血间充质干细胞和向心肌细胞诱导培养至第7代后的样本进行核型分析，分析细胞的端粒酶活性，细胞周期相关基因cyclinA、cdk2、C-fos、h-TERT、c-myc和p53的表达，并通过裸鼠皮下致肿瘤试验对细胞的致肿瘤性进行分析。 结果与结论：人脐血间充质干细胞和向心肌细胞诱导体外培养至第7代，未发现染色体核型异常改变，相应的端粒酶活性也未出现异常增高。c-myc、p53、h-TERT、C-fos无表达。致肿瘤试验，实验裸鼠在观察期内均未见结节形成或可疑病灶产生，符合国家医疗产品生物学评价标准的要求。     

人骨髓基质细胞作为核移植供体细胞的相关生物学特性研究

目的研究作为核移植供体细胞的人骨髓基质细胞相关生物学特性。方法应用密度梯度离心法分离培养人骨髓基质细胞，并对其进行形态观察、免疫荧光分析细胞骨架结构、端粒酶活性测定、核型及细胞周期分析。结果培养的细胞具有正常的大小、形态、细胞骨架结构：在融合密度达80%-90%时，G0＋G1期细胞所占的比例较高，约占92．58％；检测传至第7代的人骨髓基质细胞具有正常染色体数目（46，XY），端粒酶活性为0．567。结论形态良好、染色体数目正常的人骨髓基质细胞可以作为核移植的供体细胞。     

无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞

背景：传统的胚胎来源和脑来源的神经干细胞由于取材困难,并受伦理道德的约束,应用受到极大限制。 目的：拟利用无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞。 方法：抽取大鼠股骨和胫骨的骨髓,采用全骨髓培养及贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞周期及细胞免疫表型,油红O染色及茜素红染色鉴定其成骨、成脂能力。取传至4~6代的大鼠骨髓间充质干细胞,加入含表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、B27的DMEM/F12无血清神经培养基进行诱导,采用免疫荧光染色及流式细胞仪予以鉴定。 结果与结论：P5骨髓间充质干细胞(91.5±3.1)%处于G1期,高表达CD90及CD29,不表达CD45及CD34,成脂诱导后在胞质中可见桔红色脂滴,成骨诱导后可见黑色矿化结节。骨髓源性神经干细胞巢蛋白免疫荧光染色呈阳性,流式细胞仪检测其阳性率为(97.2±1.1)%,NSE,β-Tubulin,GFAP及MAP-2抗原免疫荧光染色均呈阳性表达。表明在无血清神经培养基中加入特定生长因子,骨髓间充质干细胞可诱导为神经干细胞;在体外适当条件下,骨髓源性神经干细胞具有增殖和分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力。     

国际动态

体内和体外调控成人骨髓源性神经干细胞的增殖和分化近期研究表明神经干细胞(neural stem cells,NSCs)可以通过许多途径培养获得,包括胚胎、胎儿、成人骨髓以及脑组织等。美国希达西奈医学中心Maxine DunitZ神经外科研究所的研究人员之前曾报道了成体大鼠骨髓源性NSCs球的形成,它们在形态和表型上类似于源于脑NSCs的神经细胞球。目前,该研究小组利用成人骨髓源性NSCs,成功地在体外诱导培养出类似于脑源性NSCs的球型细胞团。研究人员掌握了几个加速骨髓源性NSCs生长的基因,可以在体外诱导干细胞的生长与分化。非增殖型重组腺病毒编码cDNA序列类高血糖素免疫反应物(Gli)、重组腺病毒-类高血糖素免疫反应物-1(rADV-Gli-1)、音猬因子(sonic     

非病毒载体介导脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞：脂质体及电穿孔转染法的比较

背景：基因转染细胞有病毒及非病毒载体法，因病毒载体面临安全性、免疫排斥等问题，实验探讨脂质体及电穿孔转染法。 目的：比较脂质体及电穿孔法介导人脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞的细胞转染特性和体外表达情况，建立基因工程细胞。 方法：①脂质体法：取体外分离、培养的第3代豚鼠骨髓间充质干细胞，将质粒-脂质体混合物加入含细胞的培养基中培养6 h，再加入胎牛血清的培养基，孵育48 h 后行免疫组织化学检测，即为瞬时表达。48 h后加入含G418培养基筛选。②电穿孔法：取骨髓间充质干细胞，胰酶消化，用无血清培养基重悬细胞，将细胞悬液加入电转化池中，加入质粒，将电转化池移至电极间放电转导。转染48 h后，检测目的基因瞬时表达。48 h后加入含G418培养基筛选。用免疫组织化学及RT-PCR检测两种方法脑源性神经营养因子基因表达情况。 结果与结论：免疫组织化学显示脂质体介导转染的脑源性神经营养因子瞬时表达率约为5.80%，电穿孔法约为24.29%。脂质体法转染筛选14 d后细胞几乎全部死亡；电穿孔法转染后筛选并扩大培养建立工程细胞，免疫组织化学显示工程细胞脑源性神经营养因子阳性表达率达90%以上，RT-PCR扩增产物电泳证实目的基因阳性条带。结果表明，用电穿孔法可成功建立脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间充质干细胞的工程细胞，并用免疫组织化学和RT-PCR方法证实细胞体外表达目的基因。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养和定向神经分化

目的 探讨成人骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养和定向神经诱导分化的条件.方法 从正常成人志愿者髂骨中分离获取MSCs,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,以含有脑源性生长因子(BDNF)联合维A酸(RA)的培养液对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学法对诱导后的细胞鉴定.结果 诱导1h有部分细胞表达神经干细胞标志巢蛋白nestin,6h后大部分细胞具有典型神经元形态.表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞占细胞总数的(46.45±2.54)%.结论 MSCs可通过体外培养并纯化,应用BDNF联合RA可以在体外诱导MSCs成为神经元样细胞.     

pEGFP-C2基因因转染恒河猴骨髓源神经干细胞的实验研究

目的 探讨恒河猴骨髓基质源神经干细胞进行基因修饰的可行性。方法 分离恒河猴骨髓基质细胞(BMSCs)，体外培养，bFGF诱导增殖，细胞生长至神经干细胞期时以Nucleofector^TM核转染仪行pEGFP—C2转染，倒置荧光显微镜观察基因表达情况，并检测细胞的活力。另外，对同期培养的未转染细胞进行神经干细胞特异性抗原-nestin和CD133抗原的免疫细胞化学检测。结果 分离得到的BMSCs能在体外培养液中进行增殖和分化．而在bFGF诱导的情况下．细胞的增殖更为明显；转染pEGFP—C2的细胞于转染后24h后即表达强绿色荧光蛋白，转染率达30％以上，且细胞的活力基本不受影响；免疫细胞化学检测可见有nestin和CD133抗原在同期培养的未转染细胞内表达。结论 灵长类骨髓基质细胞具有向神经干细胞分化、增殖的能力，bFGF能促进细胞的增殖，在神经干细胞培养条件下，可发育分化成神经干细胞；在神经干细胞阶段，应用电转染技术进行神经干细胞基因修饰是可行的，可应用于骨髓基质源神经干细胞的基因治疗领域。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及分化为神经干细胞的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,MSCs)体外分化为神经干细胞(neural stemcells,NSCs)的可能性。方法取4～6周SD大鼠双侧股骨和胫骨骨髓细胞进行体外培养,通过传代得到纯化的MSCs后换用分化液诱导,通过形态学观察诱导后细胞形态变化,并用免疫荧光检测不同天数细胞nestin的表达率;NSCs分化实验对所诱导的NSC的分化潜能进行检测。结果MSCs诱导后的细胞nestin表达率随天数增加逐渐升高,1周后形成高表达nestin的神经干细胞球形细胞团;在含血清培养基中可自然分化为神经元和神经胶质样细胞。结论MSCs能于体外分化出神经干细胞,且具有进一步的分化能力,骨髓来源的神经干细胞将可能作为种子细胞用于神经系统疾病的治疗。     

miR-124 and miR-128 differential expression in bone marrow stromal cells and spinal cord-derived neural stem cells

BACKGROUND: MicroRNA (miRNA) expression in stem cells provides important clues for the molecular mechanisms of stem cell proliferation and differentiation. Bone marrow stromal cells and spinal cord-derived neural stem cells exhibit potential for neural regeneration. However, miRNA expression in these cells has been rarely reported. OBJECTIVE: To explore differential expression of two nervous system-specific miRNAs, miR-124 and miR-128, in bone marrow stromal cells and spinal cord-derived neural stem cells.DESIGN, TIME AND SETTING: An In vitro, cell biology experiment was performed at the Department of Biotechnology, Shanxi Medical University from June 2008 to June 2009.MATERIALS: TaqMan miRNA assays were purchased from Applied Biosystems. METHODS: Rat bone marrow stromal cells were isolated and cultured using the whole-bone marrow method, and rat spinal cord-derived neural stem cells were obtained through neurosphere formation. TaqMan miRNA assays were used to measure miR-124 and miR-128 expression in bone marrow stromal cells and spinal cord-derived neural stem cells.MAIN OUTCOME MEASURES: Morphology of bone marrow stromal cells and spinal cord-derived neural stem cells were observed by inverted microscopy. Expression of the neural stem cell-specific marker, nestin, the bone marrow stromal cell surface marker, CD71, and expression of miR-124 and miR-128, were detected by real-time polymerase chain reaction. RESULTS: Cultured bone marrow stromal cells displayed a short fusiform shape. Flow cytometry revealed a large number of CD71-positive cells (> 95%). Cultured spinal cord-derived neural stem cells formed nestin-positive neurospheres, and quantitative detection of miRNA demonstrated that less miR-124 and miR-128 was expressed in bone marrow stromal cells compared to spinal cord-derived neural stem cells (P < 0.05). CONCLUSION: Bone marrow stromal cells and spinal cord-derived neural stem cells exhibited differential expression of miR-124 and miR-128, which suggested different characteristics in miRNA expression.     

大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖与多向分化的能力

背景：生理条件下机体内多数骨髓间充质干细胞增殖并不明显,然而在一定刺激下可表现出旺盛的有丝分裂活动,具有很强的增殖倍增能力,且体外实验表明其具有多向分化潜能。 目的：进一步验证体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖与多向分化潜能。 方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,MTT法绘制细胞生长曲线,免疫组化法对细胞表面干细胞标志CD44进行鉴定。取传至第4代细胞,分别用成骨、成软骨、成脂肪和成神经诱导剂予以培养,通过碱性磷酸酶染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、油红O染色、NeuN抗体免疫组化染色进行分化能力鉴定。 结果与结论：分离培养的细胞呈长梭形或多边形,细胞生长曲线呈S形,群体倍增时间约为31 h,免疫细胞化学染色后CD44呈阳性表达,CD34呈阴性。第4代骨髓间充质干细胞成骨诱导2周后出现钙盐沉积,成软骨诱导培养2周后Ⅱ型胶原检测呈阳性,成脂肪诱导培养2周后在细胞的胞浆内充满大量红色脂肪滴,成神经诱导6 h后细胞出现突起,类似神经元的轴突和树突纤维,NeuN免疫组化染色呈阳性。表明体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖能力旺盛,可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞方向分化。     

猫骨髓基质细胞诱导为神经干细胞的实验研究

目的观察猫骨髓基质细胞体外培养及诱导分化情况。方法从猫的骨髓中分离得到骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal cells．BMSC），在体外给予神经干细胞培养基培养，增殖后用分化诱导因子(维甲酸，Retinoic acid，RA)进行诱导分化．倒置相差显微镜下观察活细胞及免疫细胞化学染色情况。结果猫骨髓基质细胞在体外培养中胞体增大，镜下可见丰富的胞浆颗粒，继之出芽，贴壁生长，可形成克隆团，同时可传代培养。这些具有克隆能力的骨髓基质细胞能表达神经干细胞特异性抗原nestin，而且能分化出胶质细胞样细胞和神经元样细胞。结论猫骨髓基质细胞具有干细胞特征，在合适的条件下可扩增、形成克隆并诱导分化出神经胶质细胞和神经元特征细胞，它们可考虑作为神经系统功能缺失细胞移植治疗的种子细胞来源。     

Generation of neural progenitor cells from whole adult bone marrow

The efficient and large-scale generation of neural progenitor cells for neural grafting in the treatment of neurological diseases has been a challenge. Here we describe the isolation and successful propagation of neural progenitor cells from adult rat bone marrow. Unfractionated bone marrow cultured in vitro with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor gave rise to cellular spheres which differentiated into neurons and glia. The cellular spheres expressed nestin, a neural stem cell marker as well as CD90, a marker of hematopoietic stem cells. This methodology addresses the ethical and tissue rejection problems associated with fetal neural stem cells and would circumvent the difficulty associated with generating neural progenitors from the adult brain. We demonstrate that bone marrow may offer a renewable autologous extracranial source of neural progenitor cells.     

猫骨髓源性神经干细胞诱导分化的实验研究

目的探讨猫骨髓分离培养、诱导分化神经干细胞的可行性。方法无菌条件下行骨穿,梯度密度离心获取猫骨髓基质细胞,以“神经干细胞培养基”培养,用分化诱导因子进行体外培养和诱导分化。结果猫骨髓基质细胞在相应培养条件下能在体外培养中增殖、分化,克隆形成细胞球(或称“神经球”),这些细胞球能表达神经干细胞特异性抗原nestin,而且能进一步诱导分化出胶质样细胞和神经元样细胞,免疫细胞化学检测可见有胶质源性纤维酸性蛋白抗体(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)抗原表达。结论猫骨髓基质细胞在一定条件诱导下可分化成神经胶质样和神经元样细胞。     

菲立磁标记兔BMSCs自体移植脊髓后的核磁共振活体示踪及形态学研究

目的通过观察菲立磁标记兔骨髓源性神经干细胞(BMSCs)自体移植脊髓后的核磁共振活体示踪及形态,期待找到一种应用非侵袭性方法来识别、跟踪BMSCs的存活状态及与宿主组织整合情况的方法。方法无菌条件下股骨取骨髓,梯度密度离心法分离获取兔骨髓基质细胞;使用“Feridex-多聚赖氨酸复合物(FE-PLL)”标记骨髓基质细胞,采用普鲁士兰染色和台盼蓝排除实验等方法鉴定FE-PLL标记兔骨髓基质细胞的效率和细胞的活力;体外标记的细胞自体脊髓移植,磁共振、免疫组织化学染色和透射电镜检查。结果普鲁士蓝染色显示FE-PLL标记骨髓基质细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒;与正常未标记的细胞相比较,FE-PLL标记对骨髓基质细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显的影响;经菲立磁标记的兔BMSCs自体脊髓移植后,可在核磁共振上活体示踪。结论菲立磁与核磁共振联合可无创性活体标记检测移植的神经干细胞基本的存在部位、存在方式及其一些生物学特性,可以用来活体示踪移植的BMSCs。     

40001/间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的组织学研究

背景：大块软骨损伤目前临床上尚无方法治疗,干细胞技术出现后为解决这一难题提供了理论支持。采用新型的支架材料“壳聚糖-胶原蛋白”结合干细胞诱导分化移植给动物模型是一种较新的尝试。 目的：观察壳聚糖-胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的组织学变化。 方法：体外培养扩增兔骨髓间充质干细胞。采用软骨诱导分化培养基对P2代细胞进行成软骨诱导。同时制备“壳聚糖-胶原蛋白”支架和兔关节软骨缺损模型。缺损用含有骨髓间充质干细胞的壳聚糖-胶原凝胶填充,另一条关节用没有细胞的支架或不做处理。其中12个关节作为实验组(接受骨髓间充质干细胞+支架),8个关节作为空白对照组(不做处理),8个关节作为单纯支架组(未植入细胞)。造模后于2,4,8,16周进行组织学评分并处死动物行组织学染色。 结果与结论：造模后16周移植的细胞一致分化为软骨细胞,大部分软骨缺损区被新生软骨修复,组织学评分实验组关节修复良好。提示应用骨髓间充质干细胞结合“壳聚糖-胶原蛋白”复合物可以修复关节软骨缺损。 关键词：壳聚糖-胶原凝胶;兔;骨髓间充质干细胞;软骨缺损;组织学变化 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.25.006