尿嘧啶DNA糖基化酶在PCR防污染中的应用

1.PCR“残留污染” 在PCR操作过程中,最容易出现“污染”问题,原因主要有如下几种情况:①模板的交叉污染:在样品采集或处理中,气溶胶、加样器取样时的泡沫或其他原因引起样品或模板的交叉污染,造成假阳性,属于正常DNA(由A、T、G、C四种碱基组成)引起的污染;②扩增产物的污染:在扩增过程中,将碱基T置换成U,使得扩增产物为U-     

PCR试验污染问题分析与对策

PCR反应具有较大扩增能力与极高的灵敏性的特点 ,但令人头痛的问题是易污染 ,极其微量的污染即可造成假阳性的产生。1　污染原因1.1　标本间交叉污染　标本污染主要有收集标本的容器被污染 ,或标本放置时 ,由于密封不严溢于容器外 ,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染 ;标本核酸模板在提醒过程中 ,由于吸样枪污染导致标本间污染 ;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散 ,导致彼此的污染。1.2　 PCR试剂的污染　主要是由于在 PCR试剂配制过程中 ,由于加样枪、容器、双蒸水及其他溶液被 PCR核酸模板污染。1.3　 PCR…     

不同混合方法比较聚合酶链反应(PCR)效果的研究

目的比较不同方法下的聚合酶链反应对PCR扩增的影响。方法对124例晚期乳腺癌外周血标本的CyclinD1基因进行PCR扩增。在加入DNA模板前分别用离心法和微型旋涡混合器振荡法混合PCR反应液,分装各管后加DNA模板进行扩增、电泳。结果用微型离心机离心PCR反应液后仍扩增不出或极少能扩出PCR产物,其阳性率为11.3%,且易污染;而用微型旋涡混合器振荡法混合PCR反应液后,PCR产物扩增良好(阳性率达99.2%),且不易污染。结论微型旋涡振荡法混合PCR反应液法能在减少污染的同时大大提高PCR阳性率,是一种切实可行的基因扩增方法。     

尿嘧啶DNA糖苷酶防止PCR产物污染及其对核酸杂交的影响

目的 采用PCR微板核酸杂交ELISA技术分析尿嘧啶DNA糖苷酶（UNG/UDG）防止PCR产物污染及其对PCR扩增效率的影响,探讨在不同A/T含量的微生物中含尿嘧啶的PCR产物对核酸杂交的影响。方法 以3组dUTP含量不同的PCR产物作模板,抗污染组用UNG处理,直接进行再次扩增。用微板核酸杂交ELISA检测第二次PCR扩增的结果。 结果 抗污染组中以含dUTP的PCR产物作模板,结果为阴性;而以不含dUTP的PCR产物作模板,结果为阳性。非抗污染组全部为阳性。对3组PCR产物再进行核酸杂交无明显差别,且在一定温度内,3组具有同样的稳定性。 结论 UNG能有效降解含dUTP的PCR产物,使之不能作为模板再次扩增,可以有效地防止PCR产物的污染。含有尿嘧啶的PCR产物对寡核苷酸探针的杂交无影响。     

降落式PCR和SSCP检测淋巴细胞白血病单克隆T细胞受体γ基因重排

目的 以降落式PCR和单链构型多态性(SSCP)方法检测淋巴细胞白血病单克隆T细胞受体(TCR)γ基因重排，探讨其在淋巴细胞白血病诊断中的价值。方法 盐析法提取淋巴细胞白血病患者外周血白细胞DNA，TCR-γ基因重排通用引物和降落式PCR扩增基因重排。分别采用琼脂糖凝胶电泳、SSCP和DNA直接测序方法检测PCR扩增产物。阳性细胞系DNA模板与反应增生性淋巴组织DNA按不同比例混合后扩增，检测降落式PCR的灵敏度。结果 琼脂糖电泳中，18例T淋巴细胞白血病中有15例、4例B淋巴细胞白血病中有2例为阳性。阳性标本经SSCP进一步分析，呈不连续条带。DNA直接测序证实扩增产物为TCR-γ基因重排。阳性对照模板占1％以上时可得到阳性扩增结果。结论 TCR-γ基因重排通用引物结合降落式PCR可有效扩增T淋巴细胞白血病基因重排，可用于T淋巴细胞白血病的辅助诊断。     

降落式PCR和SSCP检测淋巴细胞白血病单克隆T细胞受体γ基因重排

目的 以降落式PCR和单链构型多态性(SSCP)方法检测淋巴细胞白血病单克隆T细胞受体(TCR)γ基因重排,探讨其在淋巴细胞白血病诊断中的价值。方法 盐析法提取淋巴细胞白血病患者外周血白细胞DNA,TCR-γ基因重排通用引物和降落式PCR扩增基因重排。分别采用琼脂糖凝胶电泳、SSCP和DNA直接测序方法检测PCR扩增产物。阳性细胞系DNA模板与反应增生性淋巴组织DNA按不同比例混合后扩增,检测降落式PCR的灵敏度。结果 琼脂糖电泳中,18例T淋巴细胞白血病中有15例、4例B淋巴细胞白血病中有2例为阳性,阳性标本经SSCP进一步分析,呈不连续条带。DNA直接测序证实扩增产物为TCR-γ基因重排。阳性对照模板占1%以上时可得到阳性扩增结果。结论 TCR-γ基因重排通用引物结合降落式PCR可有效扩增T淋巴细胞白血病基因重排,可用于T淋巴细胞白血病的辅助诊断。     

全自动(定量PCR)基因扩增诊断仪配套定量试剂的研制

目的 研究一种能用于仪器操作的灵敏、快速、特异的定量试剂。方法 使用一个生物素标记的上游引物,对HBV DNA及其竞争模板DNA进行不对称PCR扩增,使扩增出的单链带有生物素,并可结合在固定有链亲合素的微孔板的表面,用标有辣根过氧化物酶的待测模板探针和竞争模板探针分别与两个微孔中固定的相应单链PCR产物杂交,而后加底物显色,测定吸光度进行分级定量分析。结果 该定量方法可以检测10拷贝数的模板,而且对简单处理的标本适应性强;以分级定量的形式定量时,具有良好的重复性。结论 该试剂适用于仪器操作,可对临床血清中HBV DNA进行分级定量分析。     

食品和水源微小隐孢子虫18S rRNA鉴定方法研究

目的了解生蔬食品及相关水源微小隐孢子虫污染情况,并研究其卵囊分离及18S rRNA鉴定的方法. 方法采用分步离心富集法从78份生蔬食品和相关水源中分离出微小隐孢子虫卵囊并提取DNA模板,利用微小隐孢子虫18S rRNA 的基因序列设计特异性引物（446bp）进行多聚酶链反应扩增,扩增产物经回收克隆后进行PCR鉴定、酶切鉴定及序列同源性分析. 结果从78 份样品中检出4份特异性条带样品.限性样品的重组克隆经PCR鉴定可重现446bp的特异性条带,其酶切产物亦与目的基因PCR产物位置相同.重组菌液的测序结果与Geabank数据库中微小隐孢子虫18S rRNA基因序列的同源性为99%. 结论建立了一种监测生蔬食品及相关水源中微小隐孢子虫污染的基因检测方法.     

全自动酶免仪加样针携带污染分析与改进

目的:以检测丙肝抗体为例,探讨增加酶免仪加样针洗涤次数减少携带污染,从而避免假阳性结果的可行性。方法:对16例丙肝抗体强阳性标本及28例阴性标本按一阳一阴的先后顺序进行检测,通过改变加样针洗涤次数(由10次增加至15次),观察携带污染发生情况。结果:加样针洗涤10次时,阴性标本有3例出现假阳性,洗涤15次时未出现假阳性结果。结论:合理增加加样针洗涤次数(15次),可降低携带污染造成的假阳性结果的发生。     

全自动酶免仪加样针携带污染分析与改进

目的：以检测丙肝抗体为例,探讨增加酶免仪加样针洗涤次数减少携带污染,从而避免假阳性结果的可行性。方法：对16例丙肝抗体强阳性标本及28例阴性标本按一阳一阴的先后顺序进行检测,通过改变加样针洗涤次数（由10次增加至15次）,观察携带污染发生情况。结果：加样针洗涤10次时,阴性标本有3例出现假阳性,洗涤15次时未出现假阳性结果。结论：合理增加加样针洗涤次数（15次）,可降低携带污染造成的假阳性结果的发生。     

聚合酶链反应微孔酶免疫法检测新型隐球菌

目的 建立一种检测脑膜炎新型隐球菌聚合酶链反应（PCR）产物的微孔酶免疫方法,方法 对PCR所用2条引物进行双标记,使扩增产物一端标记上生物素,另一端标记上地高辛,通过包被在微孔板上的亲和素捕获固定,然后用碱性磷酸酶标记的地高辛抗体反应后显色测定。结果 三种PCR产物检测方法的对照分析表明微孔板酶免疫法敏感性最强,加样量38nL时即可显色,模板DNA经过10^11倍稀释后仍为阳性结果,聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖电泳则分别可检测到0.3125uL,1.25uL及10^7,10^4稀释度,对临床脑脊液标本的检测结果微孔板酶免疫法和聚丙烯酰胺凝胶电泳的符合率为100%,二敏感性均高于琼脂微电泳,结论 建立的方法与常规电泳法相比灵敏准确,结果判断客观,重复性也较好;所测结果可相对反应PCR产物量的多少,此方法可取代电泳法成为常规检测PCR产物的方法。     

用原位RT—PCR技术检测大肠癌组织中相关新基因SNC66的表达

目的：探讨在肿瘤组织石蜡切片标本中原位检测内源性基因表达产物的灵敏方法，研究大肠癌相关新基因SNC66在大肠癌组织中的表达情况以及与大肠癌的相关性。方法：经原位逆转录后进行原位PCR扩增，在扩增过程中掺入地高辛标记的核苷酸（Dig-UTP)并加以检测。比较SNC66在大肠粘膜和大肠癌组织中的表达情况。结果：25个循环时，37例大肠癌组织标本有10例阴性不表达，27例强阳性表达。10个循环时，则14例呈阴性，18例弱阳性，5例强阳性。配对的37例大肠粘膜标本则都呈强阳性表达。结论：原位RT－PCR是一种检测内源性基因低拷贝转录产物mRNA的较灵敏的方法。SNC66基因在大肠癌组织中存在明显的表达降低或缺陷，可作为侯选的抑癌基因加以进一步研究。     

多重二次PCR在微量DNA标本检验中的应用

目的：探讨用多重二次PCR扩增极微量DNA标本供后续SSCP和DNA测序分析。方法：对照组取微量组织提取的DNA为模板，分别用不同的4对引物各自行PCR，同一PCR反应体系里加入4对引物扩增。然后将此扩增产物稀释1000倍为模板，再以相同引物进行第二次PCR。实验组：取微量组织提取的DNA为模板，以与对照组相同的4对引物各自进行PCR。用琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，用DNA测序方法检验二次PCR扩增产物的特异性。结果：微量的DNA标本可同时被多对引物二次扩增。实验组与对照组比较，各自引物扩增的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳显示区带速率相同，测序显示碱基序列相同。结论：因极微量的DNA模板不能满足多引物多次PCR时，可用多重二次PCR扩增，本方法在法医学、考古和组织活检等方面将有广阔的用途。     

聚合酶链反应微孔酶免疫法检测新型隐球菌

目的 建立一种检测脑膜炎新型隐球菌聚合酶链反应(PCR)产物的微孔酶免疫方法。方法 对PCR所用两条引物进行双标记,使扩增产物一端标记上生物素,另一端标记上地高辛,通过包被在微孔板上的亲和素捕获固定,然后用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体反应后显色测定。结果 三种PCR产物检测方法的对照分析表明微孔酶免疫法敏感性最强,加样量0.038μl时即可显色,模板DNA经过10~(11)倍稀释后仍为阳性结果;聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖电泳则分别可检测到0.312 5μl、1.25 μl及10~7、10~4稀释度。对临床脑脊液标本的检测结果微孔酶免疫法和聚丙烯酰胺凝胶电泳的符合率为100％,二者敏感性均高于琼脂糖电泳。结论 微孔酶免疫法与常规电泳法相比灵敏准确,结果判断客观,重复性也较好,所测结果可相对反映PCR产物量的多少,此方法可取代电泳法成为常规检测PCR产物的方法。     

高滴度阳性样本致加样针拖带假阳性分析

全自动酶免分析系统一体机的使用,实现了计算机控制下对标本的自动化、程序化、批量化检测,减少了手工操作中的人为因素给试验结果造成的偏差甚至漏检,但目前我们目家尚不能普及一次件加样吸头,以可重复洗涤利用的钢针加样,当遇到滴度较高的阳性标本时,可敛加样针拖带假阳性现象甚至造成样本污染。作者分析了工作中遇到的32例高滴度阳性样本致加样针拖带假阳性现象,现报道如下。     

提高准确检测PCR的主要因素

聚合酶链反应（PCR）技术是高新基因诊断技术，具有快速、敏感度高、特异性强等优点，现已广泛应用于医学检验中。但PCR样品制备不得当或试剂盒质量不好等原因均可影响PCR检测的准确性，为了给临床医生提供可靠信息，必须加强PCR实验室的管理以确保检测结果快速、准确。1PCR实验室的基础设施PCR技术对操作环境要求十分严格，首先要求具备三个相互隔离的实验室，既标本处理室、PCR产物扩增室及结果观察室．以减少样品转移时的污染机会。2仪器质量的保证主要是扩增仪，要求循环温度与时间必须准确、应定期检查门次／周），并记录扩增…     

解除膜板DNA中杂质对Taq DNA聚合酶抑制作用的方法

在应用常规Kunkel法,提取甲型血友病家系成员外周血白细胞DNA为模板扩增F8C基因,进行RFLP连锁分析时,我们发现,有些DNA样品,不论是提高变性温度还是延长变性时间,都不能通过PCR扩增出恃异性产物。对这些样品,我们采取了如下处理方法:     

Chelex-100法快速提取革兰氏阳性杆菌基因组DNA

目的探索一种快速、高效提取革兰氏阳性杆菌基因组DNA的方法。方法采用Chelex-100法提取14株革兰氏阳性杆菌的基因组DNA,利用PCR技术扩增16SrRNA基因及4个单拷贝管家基因以评价提取核酸的质量。结果 Chelex-100法能够在20min内从革兰氏阳性杆菌中提取出基因组DNA,所提取的DNA可直接用于PCR扩增。所有菌株的16SrRNA基因及棒状乳杆菌的4个单拷贝管家基因均扩增成功,PCR产物经电泳检测目的条带清晰特异,与预期目的片段长度相符。结论 Chelex-100法具有快速、高效、安全、经济的特点,采用这种方法提取的革兰氏阳性杆菌的基因组DNA可直接作为PCR扩增的模板。     

反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒

目的探索SARS冠状病毒早期诊断的有效手段。方法对临床病例样品采用反转录巢式PCR方法鉴定SARS冠状病毒。提取样品RNA,用巢式PCR外侧下游引物进行反转录,以反转录产物为模板,进行巢式第一次、第二次PCR。PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行测序鉴定。结果被检样品扩增出特异片段,经测序验证确实来自SARS相关冠状病毒。Blast比较结果与SARS冠状病毒多伦多株相应片段只有一个碱基的差异。结论反转录巢式PCR方法验证在非典型肺炎患者标本中存在SARS相关冠状病毒的序列,证实该法不失为一种检测SARS冠状病毒的快速、简便、易行的方法。     

呼吸道感染人腺病毒的分离及鉴定

目的进行呼吸道感染人腺病毒的分离以及型别鉴定。方法标本来源于本实验室检测腺病毒阳性的1例呼吸道感染临床患者痰标本,将该例标本经处理后接种肺癌A549细胞进行病毒培养,用空斑实验进行病毒的分离和纯化,以纯化后的病毒核酸提取物为模板用PCR方法扩增腺病毒六邻体蛋白基因,对扩增产物进行序列测定,测序结果进行BLAST序列分析确定其型别。结果分离到一株人腺病毒毒株,对其六邻体蛋白基因PCR产物测序和BLAST分析结果证明该腺病毒株的六邻体序列与人7型腺病毒六邻体基因同源性均为100%。结论从哈尔滨地区呼吸道感染患者痰标本中检测到的1例腺病毒经分离鉴定为人腺病毒7型。