2株与霍乱弧菌O139诊断血清发生凝集的麦氏弧菌鉴定

目的对2株疑似O139群霍乱弧菌进一步鉴定,以排除或确诊霍乱。方法以试管凝集和交叉吸收实验复核玻片凝集结果,用生化实验和BIOFOSUN 微生物鉴定系统进行生化鉴定,PCR技术检测O139霍乱弧菌特异性脂多糖基因（LPS）。结果玻片凝集阳性,试管凝集1株菌可达原诊断血清效价的1/4,1株菌达1/2,交叉吸收后均证实为非特异性凝集;未检出LPS基因;系统生化鉴定判定为麦氏弧菌。结论2株菌不是O139霍乱弧菌,而是麦氏弧菌。     

16SrDNA序列测定在采血耗材污染细菌鉴定中的应用

目的 探讨16SrDNA基因测序方法在鉴定采血耗材中未知细菌污染方面的应用价值.方法 对15例采血原辅耗材样本进行采样、分离、纯化培养.可疑阳性标本进一步采用16SrDNA基因测序检测,同时用表皮葡萄球菌标准菌株作为实验阳性对照.结果 15例样本中有3例细菌培养可疑阳性,PCR扩增其16SrDNA片段,测序结果与GenBank比对,分别与Macrococcus caseolyticus strain（巨型球菌）、Klebsiella pneumoniae（肺炎克雷伯菌）与Bacillus thuringiensis（苏云金芽孢杆菌）的同源性为99%.表皮葡萄球菌标准菌株16SrDNA基因测序结果与来源一致.结论 16SrDNA基因测序方法可用于血制品耗材中未知细菌的污染检测,在菌株鉴定方面有快速、特异的优势.     

两株鼻疽诺卡菌临床分离株的鉴定

目的应用基因测序方法对2株疑似非结核分枝杆菌的菌株进行初步菌种鉴定,指导临床用药治疗.方法将2株临床分离菌株1520、4108分别接种于罗氏培养基,观察其菌落生长状况;取生长对数期菌落,抽提菌株DNA;PCR扩增16S rDNA基因序列,对其PCR产物进行测序和NCBI网站Blast同源性比对,以进行菌株的初步鉴定.结果编号为1520、4108两株菌株,在罗氏培养基上生长迅速,均可见淡黄色粗颗粒样小菌落,疑似非结核分枝杆菌;以PCR扩增两株菌的16S rDNA基因序列,结果与鼻疽诺卡菌(Nocardia farcinica)同源性极高,比例均达到99%.结论从肺科急诊患者体内分离到的菌株1520、4108为鼻疽诺卡菌,而不是非结核分枝杆菌,为临床在治疗方案上提供了有力的证据.同时, DNA测序分析能够快速、简便、准确地鉴定到菌种,为实验室疑难菌型鉴定提供了技术保障.     

焦磷酸测序快速检测3种海洋性弧菌的方法学建立及创伤弧菌16S rRNA基因分型的研究

目的建立一种海洋致病性弧菌的快速诊断方法,为海洋性弧菌感染的临床检测构建新的技术平台。方法分别针对创伤弧菌vvh A,副溶血弧菌和溶藻弧菌的toxR基因设计扩增引物和测序引物,并PCR扩增特异性DNA片段,制备单链模板,进行焦磷酸测序,得到的碱基序列经NCBI比对验证;对创伤弧菌16S rRNA基因进行分型。结果创伤弧菌的扩增引物和测序引物均表现出较好的特异性,4株创伤弧菌均扩增出167 bp大小的DNA片段,并且测序结果与NCBI比对达到100%匹配度,而其他菌株未见扩增条带,测序结果为阴性;11株副溶血弧菌和溶藻弧菌均分别扩增出105 bp和134 bp大小的DNA片段,并且经测序得到与预期相符的DNA碱基序列。4株创伤弧菌中1株属于16S rRNA-A型,其余3株均属于16S rRNA-B型。结论本研究建立的PCR-焦磷酸测序方法是一种短核苷酸序列实时测定的新方法,具有高通量、精确、简单易行的优点,适用于海洋性致病菌及陆地感染细菌的快速精准鉴定。     

多重耐药肺炎克雷伯菌中碳青霉烯酶的检测和分析

目的研究多重耐药肺炎克雷伯菌临床分离株的碳青霉烯酶的流行情况。方法收集该院从2007年1月至2012年12月临床分离的151株多重耐药肺炎克雷伯菌,并对其药敏结果进行归纳整理,用碳青霉烯酶表型试验进行检测,再用聚合酶链反应(PCR)检测已知的碳青霉烯酶基因,并对扩增产物进行DNA测序,确定其基因型。结果在151株多重耐药肺炎克雷伯菌中,通过改良Hodge试验筛选出12株可能产碳青霉烯酶的菌株,其中有1株的金属酶试验为阳性,该12株菌经PCR扩增及测序确定产碳青霉烯酶菌株有5株,金属酶阳性株为IMP-4型金属酶,另外4株产碳青霉烯酶菌株为KPC-2型。结论近年来该院多重耐药肺炎克雷伯菌出现了产碳青霉烯酶菌株,临床应根据药敏结果合理选用碳青霉烯类药物,以减少耐药菌株的产生。     

应用MALDI-TOF MS技术快速鉴定布鲁菌

目的利用MicroflexTMLT型MALDI-TOF质谱仪建立布鲁菌蛋白质量指纹图谱数据库,并评估其在布鲁菌临床分离株鉴定中的应用价值。方法 2013年10月该院微生物实验室分离到1株疑似布鲁菌,经VITEK~2 Compact全自动微生物分析系统及16SrDNA基因测序确认为马耳他布鲁菌,按照厂家推荐方法自建了布鲁菌蛋白质量指纹图谱数据库。对2015年4月及2016年6月该实验室分离到的2株疑似布鲁菌进行革兰染色、柯氏染色及氧化酶、触酶、快速尿素酶等生化反应试验。使用Microflex~(TM)LT型质谱仪收集这2株及外院3株布鲁菌疑似菌株的质量图谱,比对分析图谱时在MALDI Biotyper数据库基础上添加自建数据库,同时使用16SrDNA基因测序法鉴定上述细菌。结果按照自建库推荐操作流程成功获得了基于BRUxh1的自建布鲁菌质量指纹图谱数据库。2015年4月及2016年6月分离到的布鲁菌疑似菌株,涂片染色镜检均为革兰阴性短小球杆菌,氧化酶阳性,触酶阳性,尿素酶阳性(5min内)。这5株疑似菌株的质谱鉴定结果均为布鲁菌(质谱评分分别为2.407、2.475、2.436、2.466、2.397),16SrDNA基因测序确认这5株细菌为布鲁菌。其中来自外院的2株细菌于外院VITEK~2 Compact系统鉴定时均错误地鉴定为吉氏玫瑰单胞菌。结论联合MALDI Biotyper数据库与自建布鲁菌数据库对临床分离株进行质量图谱比对分析,可以实现对布鲁菌属细菌的准确鉴定,该方法快速、灵敏,对布鲁菌病的临床快速诊断具有较高的应用价值。     

变性高效液相色谱对CTX-M型超广谱β内酰胺酶基因分型研究

目的 探讨湖南省CTX-M型超广谱B内酰胺酶(ESBLs)基因型分布情况和变性高效液相色谱(DHPLC)方法检测CTX-M型ESBLs基因型的准确性.方法 用多重PCR扩增标准菌株和ESBLs表型阳性的临床菌株blaCTX-M基因,扩增产物经DHPLC分析得到标准菌株和临床菌株色谱峰图,通过比对标准色谱峰图对临床菌株进行基因分型,同时采用单纯随机抽样法选择25株多重PCR扩增阳性菌株进行特异PCR扩增,其产物冉进行基因测序来评估DHPLC法的准确性.结果 142株产ESBLs的肠杆菌科细菌经多重PCR扩增证实109株携带blaCTX-M基因,检出率为76.8%(109/142).109株扩增阳性的菌株经DHPLC分析后检出4种不同的blaCTX-M基因型:33株携带CTX-M-3、19株携带CTX-M-15、5株携带CTX-M-9、52株携带CTX-M-14.25株基因测序结果与DHPLC基因分型结果作比较显示:24株DHPLC的基因分型结果与基因测序结果完全吻合,但有1株DHPLC基因分型为CTX-M-15,而测序为CTX-M-82.结论 DHPLC可对耐药进行基因快速基因分型,具有准确、快速和经济等优点.     

应用16S rRNA宽范围聚合酶链反应快速检测临床无菌体液感染

目的应用16S rRNA宽范围聚合酶链反应（PCR）快速检测临床无菌体液感染,并与传统培养方法进行比较分析。方法收集94份临床无菌体液（血液、脑脊液、胸腹水、关节液）标本,提取细菌基因组DNA,应用16S rRNA宽范围PCR扩增,并将PCR阳性产物测序,然后将测序结果在美国国家生物技术信息中心（NCBI）上进行BLAST比对,从而确定菌种。同时,应用常规培养方法检测94份无菌体液标本,并对2种方法的结果进行比较。结果 16S rRNA宽范围PCR敏感性高,最低扩增浓度为103 CFU/mL,且该技术特异性高,其阳性扩增产物经测序比对后结果和培养结果完全吻合。另外,94例临床标本中应用培养方法培养出阳性例数为9例,阳性率为9.6%,而应用宽范围PCR,除培养阳性的9例均为阳性外,另外扩增出6例阳性标本,阳性率为15.9%,而此6例经测序证实分别为4株铜绿假单胞菌、1株黏质沙雷菌、1株肺炎链球菌。结论 16S rRNA宽范围PCR与培养技术比较起来,敏感性高,特异性强,有望成为临床无菌体液病原体感染快速筛查的方法。     

应用多重聚合酶链反应检测致病性霍乱弧菌

本研究分别针对霍乱弧菌的外膜蛋白基因 (ｏｍｐＷ )和肠毒素Ａ亚单位基因 (ｃｔｘＡ)设计引物 ,建立的多重聚合酶链反应 (ＰＣＲ)方法 ,可准确地将产毒霍乱弧菌与非产毒霍乱弧菌、副溶血性弧菌、河弧菌、志贺菌、沙门菌和致病性大肠埃希菌加以鉴别。1.菌株 :10株Ｏ1群古典型 (标准株 16 0 17) ,14株Ｏ1群埃尔托型 (标准株 180 2 0 ) ,7株Ｏ139,13株非Ｏ1非Ｏ139,12株副溶血性弧菌 ,7株河弧菌 ,7株沙门菌 (标准株 5 12 5 2 ) ,10株志贺菌 (标准株 5 0 0 71) ,5株ＥＴＥＣ ,7株ＥＨＥＣ(1株Ｏ15 7∶Ｈ7) ,由中国药品生物制品检定所、军事医学…     

MALDI-TOF MS在临床常见菌快速鉴定中的应用研究

目的 评价MALDI-TOF MS在临床常见细菌快速鉴定中的应用.方法 选择浙江大学医学院附属第二医院2008年12月至2009年8月分离自血液、痰液、分泌物和尿液的临床常见细菌和浙江省疾病预防与控制中心收集的沙门菌共426株.包括革兰阳性球菌76株和革兰阴性杆菌350株.采用Vitek系统将细菌鉴定到种,血清凝集试验对沙门菌和志贺菌进行血清分型.PCR扩增91株细菌的16S rDNA基因并测序,所得核苷酸序列与GenBank中的数据库进行比对,确定细菌种类.用MALDI-TOF MS对所有细菌进行快速鉴定,比较不同鉴定方法 之间的符合情况.结果 除沙门菌和志贺菌外的所有革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌的Vitek和MALDI-TOF MS两者的鉴定结果 完全符合.23株沙门菌中只有2株肠炎沙门菌鼠伤寒血清型的3种鉴定方法 结果 相符,另有1株伤寒沙门菌、3株甲型副伤寒沙门菌、1株乙型副伤寒沙门菌、1株肠炎沙门菌和1株肠炎沙门菌病牛血清型的血清凝集结果 与16s rDNA基因测序结果 相符.Vitek及血清凝集试验鉴定为福氏志贺菌的4株菌16s rDNA基因测序和MALDI-TOF MS的鉴定结果 均为大肠埃希菌.结论 MALDI-TOF MS可快速、准确地对细菌进行鉴定,具有良好的重复性,但对沙门菌和志贺菌效果不佳.     

山西省从粪便中分离到产霍乱毒素的拟态弧菌

目的从山西省霍乱样粪便中分离到拟态弧菌,并检测其是否携带霍乱毒素基因。方法采集患者粪便、患者家用自来水、金鱼和鱼缸水标本,按照WS289-2008和《霍乱防治手册》(第5版)方法 ,对标本进行增菌和选择性培养基的分离培养,疑似菌落以霍乱弧菌血清凝集试验检测,并用API20E系统鉴定菌种。同时,疑似菌落用PCR检测O1、O139群特异性和是否携带霍乱毒素基因。结果粪便标本经增菌后接种选择性培养基,在庆大琼脂和碱性琼脂上均有霍乱弧菌疑似菌落,但在TCBS琼脂上为绿色、透明、中等大小、光滑、湿润的菌落;血平板上可见灰白色、湿润菌落,有透明溶血环;染色镜检湿片暗视野下未见流星状运动细菌。氧化酶和粘丝实验阳性,霍乱弧菌O1、O139群血清凝集试验阴性。菌株经API20E鉴定为拟态弧菌(93.5%可能性)。环境标本中未分离和检测到拟态弧菌。PCR检测该拟态弧菌中携带霍乱毒素基因,而O1、O139群特异性为阴性。结论从急性霍乱样腹泻粪便中分离到1株拟态弧菌,对于临床类似霍乱样症状的病例标本,当病原的霍乱弧菌血清凝集为阴性时,应进一步做霍乱毒素的检测。     

1986-2009年浙江省舟山市普陀区霍乱监测分析及控制措施

目的定期对腹泻病例、外环境及水产品进行霍乱病原体监测,以掌握其动态变化,为预测疫情及制定防控措施提供依据。方法浙江省舟山市普陀区范围开展腹泻病例监测,选择历年霍乱高发的1个城区、1个渔农村为监测点,对外环境和水产品进行专项监测。结果开展监测的前12年(1986-1997年)共登记腹泻患者74 734例,检测霍乱弧菌63 544例,检测率为85.03%,检出阳性1807例,阳性率为2.84%,死亡6例,病死率为0.33%。年最高发病率为374.76/10万(1994年),年均发病率为45.48/10万,患者密切接触者的带菌率为2.58%(151/5845),可能引起霍乱发病的可疑污染物检出率为3.94%(119/3018)。监测点专项监测各类样本6331份,检出霍乱弧菌48份,检出率为0.76%,其中水体检出率0.27%(6/2185),水产品检出率1.05%(19/1803),粪便检出率1.47%(23/1569),774份蝇类未检出。监测共检获菌株2125株,经鉴定除在冻虾仁中检出1株O139群霍乱弧菌外,其余2124株均为O1群霍乱弧菌。流行菌株20世纪90年代前以稻叶型1d占优势,90年代后转变为小川型1b为主,且监测点检测出的48份霍乱噬菌体生物型与当年的霍乱流行型完全一致。35株小川型1b菌株药敏试验显示氟哌酸为首选药物,强力霉素敏感,痢特灵中敏,青霉素耐药。开展监测后12年(1988-2009年),腹泻患者登记50 591例,检测43 798例,检测率为86.57%,监测点专项监测各类样本6192份,均未检出霍乱弧菌。结论开展监测的前12年普陀区霍乱疫情严重,而后12年霍乱疫情为零报告。长期对霍乱进行定期监测,治标与治本相结合,以治本为主是控制霍乱发生行之有效的措施。     

2006年湖南省霍乱监测结果分析

目的 监测人群中霍乱病例和被霍乱弧菌污染的水体及食物,以便尽早采取预防控制措施,防止疫情扩散.方法 全省范围开展腹泻患者及外环境、食品监测,选择重点地区开展甲鱼霍乱弧菌污染状况专项监测.结果 2006年湖南省共登记腹泻患者111 526例,检测霍乱弧菌89 661例,检测率为80.39%,检出阳性4例,均为0139群霍乱弧菌感染;检测环境和食品样44 533份,其中水体35 113份,全部为阴性,水产品5377份,阳性16份,阳性率为0.30%,阳性标本为甲鱼和牛蛙,其他食品4043份,均为阴性;甲鱼专项监测2323份,检出阳性33份,阳性率为1.42%;霍乱毒素基因检测34株菌,20株为产毒株,占58.80%;药敏试验28株菌,均对诺氟沙星、环丙沙星、丁胺卡那霉素100%敏感,对强力霉素、复方新诺明的敏感率为92.86%.结论 甲鱼、牛蛙等水产品是湖南省发生霍乱的主要因素,应加强水产品的监测和卫生管理.     

浙江省非O1、非O139群霍乱弧菌快速检测与毒力基因研究

目的 建立一种快速检测非O1、非O139群霍乱弧菌方法,并对浙江省部分地区海水产品中非O1、非O139 群霍乱弧菌及其携带毒力基因开展快速检测.方法 采用三糖斜面、氧化酶实验、粘丝实验、无盐胨水等简单生化进行初筛,对全部结果阳性的菌株用聚合酶链反应(PCR)方法检测霍乱弧菌外膜蛋白OmpW以及毒力基因ctxA、hl...     

2015－2017年北京市顺义区食源性疾病监测腹泻病例霍乱弧菌感染及病原学特征分析

目的研究食源性疾病监测腹泻患者霍乱弧菌感染特点及病原学特征，为科学防控和临床治疗提供依据。方法从2015－2017年北京市顺义区腹泻监测病例的粪便标本中分离培养霍乱弧菌，针对分离菌株进行毒力基因聚合酶链式反应（PCR）检测、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）图谱分析以及抗生素敏感性分析。结果2015－2017年，共收集1 105例腹泻患者，霍乱弧菌的检出率为0.54%（6/1 105），霍乱毒素基因ctxAB均为阴性，血清学分型为非O1/O139型，其中5株霍乱弧菌携带Ⅲ型分泌系统毒力基因。 菌株PFGE聚类分析结果和MALDI-TOF MS图谱聚类结果具有较好的一致性。结论霍乱弧菌流行强度不高，但其感染和病原学监测工作应在食源性疾病监测体系中得到重视。     

利用脉冲场凝胶电泳及核糖体分型技术对14株上海崇明地区O139群霍乱弧菌分型分析

目的 对14株上海市崇明地区2005年O139群霍乱弧菌菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)及核糖体分型分析。 方法 用PFGE、核糖体分型对霍乱弧菌进行分析。 结果 14株O139群霍乱弧菌产毒株经核糖体分型分析为同一型;而PFGE双酶切分型结果为其中10株为同一型,其余4株为高度同源性。 结论 上海市崇明地区2005年流行的O139群霍乱弧菌核酸指纹分型基本一致。     

Enzyme activity of induced auxotrophic mutants of El Tor Vibrio cholerae

Vibrio cholerae induced auxotrophic variants nonfermenting several carbohydrates simultaneously have been obtained for the first time. Eltor vibrio clones have been selected, referred to Heuberg's groups V and VI by their enzymic activities. The findings of the present study evidence that, when isolating Eltor vibrio strains negative towards differential carbohydrates, in case of a positive agglutination test, the incubation period should be prolonged to 3 days. The principal differential diagnostic test for this species, when cholera is bacteriologically diagnosed, should be a positive volumic agglutination test with species- and variant-specific sera, irrespective of Heuberg's group.     

2005年中国El Tor霍乱弧菌流行优势菌株分子特征分析

目的研究2005年中国霍乱弧菌流行优势菌株的分子特征。方法使用脉冲场凝胶电泳对菌株进行聚类分析,使用PCR和序列测定的方法对特异片段进行扩增和序列分析的研究。 结果2005年中国霍乱弧菌流行优势菌株的脉冲场凝胶电泳图谱高度一致并且不同于以往分离的菌株;这些菌株的VSPⅡ（IVibrio/I seventh pandemic island-Ⅱ）区域有相同的由插入序列的插入导致的基因缺失。 结论2005年霍乱弧菌流行优势菌株是一种首次报道的、由VSP-Ⅱ突变菌株引起流行的菌型,其扩散能力较强,应该在今后霍乱的监测中引起注意。     

福建省漳州市海、水产品霍乱弧菌污染状况调查分析

目的查明福建省漳州市海、水产品霍乱弧菌污染状况及菌型特征。方法 2008年5-10月采集养殖场及市场、餐厅销售的海、水产品,用涂抹法对其体表、腮部和泄殖腔取样后,直接接种于碱性蛋白胨水进行增菌,划线接种庆大琼脂平板分离培养。取纯培养物进行染色镜检,用霍乱弧菌混合多价、O139群及单价分型诊断血清做玻片凝集试验,阳性菌株进一步做试管凝集及系统生化鉴定;使用常规PCR检测霍乱弧菌肠毒素ctxA基因。霍乱弧菌检出率的比较用χ2检验。结果漳州市海、水产品霍乱弧菌带菌率为5.08%(26/512),其中小川型15株、稻叶型11株。蛙类带菌率最高为25.00%(13/52)。ctxA基因检测均为阴性。增菌6～8 h霍乱弧菌检出率为0.78%、增菌18～24 h为2.34%,两种增菌时间霍乱弧菌检出率的比较差异有统计学意义(P0.05);第一次增菌霍乱弧菌检出率为2.34%、第二次为5.08%,两次增菌霍乱弧菌检出率的比较差异有统计学意义(P0.05)。结论漳州市海、水产品存在霍乱弧菌污染,需采取相应的预防措施防止霍乱疫情的发生。本次通过对染菌样品培养条件进行对比实验证明,染菌样品最适增菌时间应为18～24 h并宜二次增菌。