人巨细胞病毒感染对人胚肺成纤维细胞复制允许因子Cdt1表达的影响

目的研究人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）感染对人胚肺成纤维细胞（human embryonic lung fibroblast，HELF）复制允许因子Cdt1表达的影响，探讨HCMV感染的发病机制。方法以HCMV感染同步化的HELF作为感染组，同时设模拟感染组为对照组。采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测Cdt1 mRNA的表达水平。结果模拟感染组在感染后12h时Cdt1 mRNA表达水平最高，后逐渐下降，至72h时达最低水平，96h时又稍回升。感染组在感染后12h时Cdt1 mRNA表达水平较低，24h时稍升高，48h达最高峰，48h后至72h急剧下降，96h时大致维持72h时水平。两组相比，12h、24h和48h时Cdt1 mRNA表达水平差异有显著性（P为0．001～0．030），12h和24h时感染组较模拟感染组明显降低，48h时感染组较模拟感染组明显升高。模拟感染组Cdt1 mRNA表达水平的高峰出现在感染后12h，而感染组的高峰则出现在感染后48h，较之明显滞后。结论HCMV感染使HELF复制允许因子Cdt1 mRNA的表达水平迟滞。     

金叶败毒制剂对人巨细胞病毒感染宿主细胞周期的调节作用

目的:探讨中药金叶败毒制剂(简称中药)对人巨细胞病毒(HCMV)感染宿主细胞周期的影响。方法:用HCMV AD169感染人胚肺成纤维细胞(HEL),用金叶败毒制剂干预后,采用免疫组织化学法检测HCMV感染及中药干预后宿主细胞P16蛋白的表达,并采用流式细胞技术检测HCMV感染及药物干预后宿主细胞周期。结果:在HCMV感染48h后,金叶败毒制剂能明显抑制宿主细胞P16蛋白的表达。经中药干预后,在病毒感染24h后,宿主细胞处于S期细胞明显减少;病毒感染48h后,宿主细胞处于G2/M期的细胞明显增多;在HCMV感染72h后,宿主细胞均表现为S期细胞明显减少,G2/M期细胞明显增多,而G0/G1期细胞亦明显增多。结论:金叶败毒制剂可能通过抑制HCMV感染细胞P16蛋白的表达,促进感染细胞从S期进展到G2/M期,促进细胞周期进程而发挥抗病毒作用。     

苯并(a)芘对不同时相人胚肺成纤维细胞阻滞作用

目的 研究低遗传损伤浓度苯并(a)芘(BaP)对人胚肺成纤维细胞(HELF)的细胞周期调控的影响.方法 0.5%血清饥饿法及10%血清再刺激方法获得处于各细胞周期时相的HELF;分别以二甲基亚砜(DMSO)、2,10和50 μmol/L BaP于血清再刺激后10～12,16～18和22～24 h作用HELF 2 h;采用流式细胞术分析细胞周期分布;采用蛋白印迹法分析细胞周期调控蛋白Cyclin D、Cyclin E、Cyclin A、Cyclin B、P53、P21和P16表达.结果 BaP针对血清再刺激后10～12,16～18和22～24 h作用均引起明显的S期细胞比例的下降;血清再刺激后10～12 h作用引起G0/G1期细胞比例增加,BaP低、中、高浓度组分别为36.79%,42.73%,43.28%,伴随Cyclin D表达明显下降;血清再刺激后16～18 h作用引起G2/M期细胞比例增加,BaP低、中、高浓度组分别为18.46%,23.55%,28.44%,伴随P53和P21表达增强;血清再刺激后22～24 h作用引起G0/G1期细胞比例增加,BaP低、中、高浓度组分别为38.92%,54.08%,51.69%,伴随P53和P21表达增强.结论 BaP针对不同时相的HELF作用顺序激活了G1和G22种周期关卡监控机制,并产生相应的周期阻滞效应.     

亚砷酸钠对人胚肺成纤维细胞增殖活性及细胞周期的影响

目的 探讨亚砷酸钠对人胚肺成纤维细胞(HELF)增殖活性及细胞周期的影响.方法 将体外培养的HELF细胞分别暴露于浓度为0(对照)、20、40、60 μmol/L的亚砷酸钠培养基24、48和72 h.采用噻唑蓝(MTr)法检测细胞活力,采用流式细胞仪检测细胞周期分布.结果 与对照组相比,各浓度亚砷酸钠染毒24、48、72 h后细胞抑制率均升高,差异有统计学意义(P＜0.05);HELF细胞抑制率与亚砷酸钠浓度及作用时长均呈正相关(P＜0.05).HELF细胞G2+M期的比例仅在染毒24、48 h时均与亚砷酸钠染毒浓度呈正相关(P＜0.05).HELF细胞S期比例在染毒48 h时与亚砷酸钠染毒浓度呈负相关(P＜0.05).结论 亚砷酸钠染毒可降低HELF细胞的增殖活性,并能够选择性地将细胞阻滞在合成末期及分裂期(G2+M期).     

苯并(a)芘引起静止期二倍体人胚肺成纤维细胞可逆的G1期阻滞

目的研究苯并（a）芘[B（a）P]对静止期的二倍体人胚肺成纤维细胞（HELF）细胞周期的影响。方法血清饥饿法使细胞同步化于G0期;20μmol／LB（a）P作用细胞4h后,采用流式细胞术分别检测遗传损伤发生后0、24、48h细胞周期分布的改变,并采用Western blotting分析0、5、10、20μmol／LB（a）P作用24h后及20μmol／LB（a）P作用4h后24h内细胞周期主要调节基因p53、p21和p16表达的改变。结果0．5％低血清培养48h能够较好的达到G0同步化效果,处于G0期细胞占78％;正常培养细胞持续进入细胞周期进行DNA合成,24h时S期细胞达43．9％,而20μmol／LB（a）P处理组细胞发生G1期阻滞;48h后对照组细胞完成一个细胞周期回到以G1期为主的状态,B（a）P处理组细胞则从G1期阻滞中恢复,继续进入细胞周期,S期细胞达到了26．5％,延迟约24h。不同浓度B（a）P作用后引起P53、P21蛋白表达明显增加,20μmol／LB（a）P处理后4h即可诱导蛋白表达增加。P53在12h后逐渐恢复,P21直至24h仍未下降。P16初始略有下降,24h恢复。结论B（a）P引起同步化于G0期的细胞发生可逆转的G。期阻滞,该阻滞和p53-p21途径相关。     

Cyclin D1和CDK4正性调节苯并(a)芘所致人胚肺成纤维细胞周期改变

目的研究苯并(a)芘[B(a)P]对人胚肺成纤维细胞(HELF)的细胞周期分布及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)蛋白表达的影响,并探讨两种蛋白含量改变与细胞周期效应之间的关系。方法将反义cyclin D1质粒和反义CDK4质粒导入HELF细胞内,建立两种质粒稳定转染的细胞模型。用0.1、0.5、2.5和12.5μmol/L的B(a)P处理HELF细胞24h,用蛋白印迹方法检测cyclin D1和CDK4蛋白表达水平;利用流式细胞技术检测B(a)P处理对HELF细胞及两种稳定转染细胞系细胞周期的影响。结果成功建立了反义cyclin D1和反义CDK4稳定转染的细胞系。不同剂量B(a)P处理可引起cyclin D1蛋白表达的显著增加,但对CDK4蛋白表达无明显影响;2.5μmol/L的B(a)P处理HELF细胞24h后,引起其细胞周期G1期显著下降,S期显著增加;2.5μmol/L的B(a)P处理反义cyclin D1和反义CDK4稳定转染的HELF细胞24h后,对其细胞周期的分布无显著影响。结论Cyclin D1和CDK4基因均参与了B(a)P所致细胞周期改变过程,并发挥正性调节作用。     

Cyelin D1和CDK4正性调节苯并(a)芘所致人胚肺成纤维细胞周期改变

目的 研究苯并(a)芘[B(a)P]对人胚肺成纤维细胞(HELF)的细胞周期分布及细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)蛋白表达的影响,并探讨两种蛋白含量改变与细胞周期效应之间的关系.方法 将反义cychn D1质粒和反义CDK4质粒导入HELF细胞内.建立两种质粒稳定转染的细胞模型.用0.1、0.5、2.5和12.5μmol/L的B(a)P处理HELF细胞24h.用蛋白印迹方法检测cvclin D1和CDK4蛋白表达水平;利用流式细胞技术检测B(a)P处理对HELF细胞及两种稳定转染细胞系细胞周期的影响.结果 成功建立了反义cyelin D1和反义CDK4稳定转染的细胞系.不同剂量B(a)P处理可引起cvclin D1蛋白表达的显著增加,但对CDK4蛋白表达无明显影响;2.5/μmol/L的B(a)P处理HELF细胞24h后,引起其细胞周期G1期显著下降,S期显著增加;2.5μmol/L的B(a)P处理反义cyclin D1和反义CDK4稳定转染的HELF细胞24h后,对其细胞周期的分布无显著影响.结论 Cyelin D1和CDK4基因均参与了B(a)P所致细胞周期改变过程,并发挥正性调节作用.     

NF-KB在人巨细胞病毒感染人胚肺成纤维细胞中的表达及意义

目的:探讨核转录因子(NF-KB)在人巨细胞病毒(HCMV)感染宿主细胞中的表达及意义.方法:用HCMV AD169株感染人胚肺成纤维细胞(HEL),采用免疫组化和原位杂交方法检测HEL细胞不同时相NF-kB和bcl-2蛋白的表达及NF-KB P 65 mRNA的表达,同时用流式细胞术检测细胞凋亡指数.结果:HCMV感染后48 h细胞核表达NF-KB蛋白阳性数最多,96 h后逐渐减少,120 h无阳性细胞,NF-KBp 65 mRNA表达水平在24h达到最高,bd-2的表达与NF-kB的活性改变一致.HCMV感染在72 h前抑制宿主细胞凋亡,在120 h可诱导宿主细胞凋亡.结论:NF-KB在宿主细胞中的动态表达与HCMV的生活周期及致病有关.     

活化蛋白-1和细胞周期蛋白在石英诱导的细胞周期改变中的作用

目的 探讨在石英刺激的人胚肺成纤维细胞(HELF)中AP-1/细胞周期蛋白D1 (cyclin D1)通路在细胞周期改变中的作用.方法 建立稳定转染空载体PXJ的HELF系(HELF-PXJ)及空载体PXJ与反义cyclin D1质粒或反义细胞周期蛋白依赖激酶(CDK4)质粒分别共转染的HELF系(简称anti-D1和anti-K4),将HELF-PXJ、anti-D1和anti-K4细胞分为对照组和石英刺激组(共6组),各对照组不加任何处理,石英刺激组用200 μg/ml石英处理细胞24h.检测AP-1对石英诱导的cyclin D1、CDK和E2F-4表达改变的影响.AP-1的化学抑制剂姜黄素(curcumin) 20μmol/L预处理细胞1h后,200 μg/ml石英刺激24 h,将HELF分为4组,分别为HELF对照组、HELF+石英组、HELF+curcumin对照组、HELF+curcumin+石英组.用免疫印迹(Western blot)法和免疫荧光法检测cyclin D1、CDK4和E2F-1/4蛋白表达;运用反义RNA技术证明通路的上下游关系;用流式细胞术检测细胞周期变化.结果 200 μg/ml石英处理HELF细胞,cyclin D1和CDK4蛋白表达升高,E2F-4蛋白表达明显降低,而E2F-1蛋白的表达没有明显改变.HELF-PXJ+石英组G1期细胞所占比例下降,S期细胞所占比例升高,与HELF-PXJ对照组的差异有统计学意义(P＜0.05).抑制cyclin D1或CDK4表达后,与对照组比较,anti-D1+石英组和anti-K4+石英组G1期细胞和S期细胞百分比无明显变化.抑制AP-1活性,与HELF+石英组比较,HELF+curcumin+石英组cyclin D1和CDK表达均减低,E2F-4表达增多.结论200μg/ml石英可诱导cyclin D1和CDK4蛋白表达增高,E2F-4蛋白表达减少,并通过AP-1/cyclin D1通路诱导细胞周期改变.     

p53蛋白在苯并(a)芘诱导的p21、E2F-1表达及细胞周期改变中的作用

目的 探讨p53蛋白在苯并(a)芘[benzo(a)pyrene,B(a)P]诱导的人胚肺成纤维细胞(HELF)细胞周期改变中的作用及其与p21、E2F-1的关系.方法 转染p53 siRNA质粒(p53-H)和载体CMV的HELF细胞(HELF/CMV)无血清培养48 h后,加入2 μmol/L B(a)P作用24 h.用流式细胞仪检测细胞周期的变化.用Western blotting检测细胞中p53、p21蛋白含量的改变,利用细胞核、细胞浆分离技术观察其亚细胞定位.用免疫荧光法观察E2F-1蛋白含量及细胞核、细胞浆分布.利用p53 siRNA质粒和化学抑制剂pifithrin-α(PFT)抑制其表达,观察p53与p21、E2F-1的上下游关系以及其在B(a)P引起的细胞周期改变中的作用.结果 2 μmol/L B(a)P作用24 h后,G1期细胞比例由(71±5)%减少为(39±4)%;p53、p21以及E2F-1蛋白含量增加,并且主要分布在细胞核内.用p53 siRNA质粒和PFT抑制p53表达后,B(a)P诱导的p21高表达被抑制,细胞核内的含量明显减少;B(a)P诱导的E2F-1蛋白含量增加以及细胞周期的改变没有明显变化.结论 B(a)P通过p53非依赖的信号通路引起HELF细胞周期的改变;p53对p21的表达具有调节作用,而对E2F-1的表达不具有调节作用.     

cyclinD1/E2F通路在苯并(a)芘引起人胚肺成纤维细胞周期改变中的作用

目的探讨细胞周期蛋白D1（cyclinD1）／细胞周期蛋白依赖激酶4（CDK4），E2F-1／4通路在苯并（a）芘[B（a）P]引起的人胚肺成纤维细胞（HELF）周期改变中的作用。方法分别用2μmol／L的B（a）P作用HELF24h和100μmol／LB（a）P作用3次，每次24h，细胞具有转化细胞的部分特征（THELF）。用转染反义cyclinD1和CDK4质粒的HELF（A-D1，A-K4）和T-HELF（T-A-D1，T-A-K4）研究cyclinD1／CDK4与E2F-1／4的上下游关系。用流式细胞仪和Western blot法检测细胞周期、cyclin D1、CDK4和E2F-1／4蛋白表达的改变。结果2μmol／LB（a）P作用24h HELF中G1期细胞数明显减少。在A-D1和A-K4的HELF中，cyclinD1和CDK4表达的抑制阻断了由B（a）P引起的细胞周期从G1期进入S期的变化。B（a）P刺激后HEIF中cyclinD1和E2F-1的表达明显增加。在A-D1中，E2F-1的高表达被抑制。B（a）P作用A-K4细胞后，CDK4表达明显升高，E2F-4表达明显降低。T-A-D1和T-A-K4的T-HELF多数停留在G1期。与HELF相比，T-HELF中cyclin D1的表达明显增加；与T-HELF相比，T-A．D1和T-A-K4中E2F-4表达明显增加。结论在2μmol／L B（a）P作用的HELF中，B（a）P通过cyclinD1／CDK4-E2F-1／4信号转导通路引起细胞周期的改变。在T-HELF中，B（a）P通过cyclinD1／CDK4-E2F-4信号转导通路引起细胞周期的改变。     

转染突变基因对HELF细胞有丝分裂的影响

目的 观察正常人胚肺成纤维细胞(HELF)在转染突变关卡基因hBubl后有丝分裂关卡功能的变化。方法 应用脂质体转染突变hBubl基因表达载体，流式细胞术检测细胞的有丝分裂关卡功能。结果 HELF细胞经pTet-On质粒和pBI-GFP—hBubl共转染后，在转染24h后可见部分细胞有报告基因绿色萤光蛋白(GFP)的表达；转染HELF细胞经秋水仙素处理12h后收获，于流式细胞仪上检测细胞的周期分布情况，反应细胞的有丝分裂关卡功能，可见未转染的对照细胞经秋水仙素处理后有较高的G2／M期细胞比例(43．21％)；转染野生型hBubl细胞无论有无GFP表达也有类似的G2／M期细胞比例(44．27％和43．37％)；而转染2种突变型hBubl的细胞，有GFP表达的细胞有相对较低的G2／M细细胞比例(23．13％和20．87％)。结论 突变hBubl基因在转染入正常HELF细胞并诱导表达后引起有丝分裂关卡功能下降。     

孕妇围生期HCMV感染与婴儿先天性疾病关系

目的探讨孕妇人巨细胞病毒（HCMV）活动性感染对婴儿的近期影响。方法采用ELISA和PCR相结合的方法，采集74例HCMV活动性感染孕妇及50例无HCMV活动性感染孕妇的婴儿血进行HCMV—IgM及HCMV—DNA检测．并对感染婴儿定期随访至生后6个月，追踪其近期预后。结果孕期HCMV活动性感染组的婴儿先天性感染率为36．49％，围产期感染率为45．95％，显著高于孕期无HCMV活动性感染组（P〈0．005）；HCMV活动性感染孕妇的婴儿中，先天性感染组症状性感染发病率高于围生期感染组（P〈0．025）；神经系统异常、先天畸形及全身性感染发病例数多于围生期感染组（P〈0．05）；先天性感染组中，症状性感染婴儿治疗后肝功能恢复、HCMVHCMV—IgM和／或HCMV—DNA转阴率及近期预后比围生期感染组差（P〈0．05）。结论孕期HCMV活动性感染与婴儿先天性感染及围生期感染显著相关。孕期HCMV活动性感染引起的先天性感染较围生期感染严重，预后差．故应重视孕期HCMV感染的检测，预防和阻断HCMV先天性感染的发生。     

Optimized recombinant dense bodies of human cytomegalovirus efficiently prime virus specific lymphocytes and neutralizing antibodies without the addition of adjuvant

Control of human cytomegalovirus (HCMV) infection correlates with the reconstitution of antiviral T lymphocytes in haematopoietic stem cell transplant recipients. A vaccine to foster this reconstitution and to ameliorate the severe consequences of HCMV reactivation is yet unavailable. This work focused on providing a rationale for the amendment of the yields and the antigenic composition of a vaccine, based on subviral dense bodies (DB) of HCMV. Modified DB were generated that contained the HLA-A2 presented IE1 model peptide TMYGGISLL, integrated at different positions in the major DB protein pp65. Insertion at position W175 of pp65 allowed efficient formation of recDB in the cytoplasm of infected cells and resulted in considerable yields of these particles. Even in the absence of adjuvant, these particles proved to be highly immunogenic with respect to CD8 and CD4 T cell and neutralizing antibody responses.