含HPV16型反义E7基因的腺相关病毒骨架质粒pUF1-E7AS的构建及鉴定

目的:构建含HPV16型反义E7基因的腺相关病毒骨架质粒pUF1- E7AS并鉴定,探讨腺相关病毒介导的反义E7基因技术用于治疗早期宫颈癌的可能性。方法:使用RT -PCR法扩增全长HPV16型E7基因,利用基因重组法将目的片段反向插入腺相关病毒骨架质粒pUF1并酶切鉴定。结果:RT PCR法扩增全长315bp的HPV16型E7基因,装入pGEM -Teasy载体进行测序,经NCBI数据库blast检索为100%的符合,经基因重组获得含HPV16型反义E7基因的腺相关病毒骨架质粒pUF1 E7AS,AccⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定pUF1 E7AS。结论:含HPV16型反义E7基因的腺相关病毒骨架质粒pUF1 E7AS可成功构建。     

反义HPV16 E6/E7-EGFP重组质粒的构建及其对宫颈癌SiHa细胞的促凋亡作用

目的:构建HPV16早期基因E6/E7的反义重组质粒,探讨其对SiHa细胞的促凋亡作用。方法:将HPV16E6/E7基因片段反向克隆于真核表达载体pEGFP-C1并转染SiHa细胞,用RT-PCR方法检测转染后SiHa细胞E6、E7基因mRNA的表达,West-ernblot方法检测转染后E6/E7蛋白的表达,流式细胞仪检测转染后细胞的凋亡率。结果:成功构建携带HPV16E6/E7基因反义片段的真核表达载体,转染该质粒后,SiHa细胞E6、E7基因的mRNA和蛋白均明显下调;转染后细胞凋亡率为(59.3±11.3)%,明显高于转染空载体组[(9.4±1.8)%]和未转染组[(2.1±0.4)%](P<0.05)。结论:反义HPV16E6/E7基因可下调宫颈癌细胞中E6/E7癌基因的表达,诱导宫颈癌细胞凋亡,为宫颈癌的基因治疗提供了实验依据。     

腺病毒伴随病毒表达载体表达人乳头状瘤病毒16型E6/E7基因的构建及应用

目的　为了了解人乳头状瘤病毒 (Humanpapillomavirus ,HPV) 1 6型的E6 /E7基因在细胞恶性转化中所起的作用 ,利用腺病毒伴随病毒载体 (AAVHelper -FreeSystem)构建和表达人乳头状瘤病毒 1 6型E6 /E7基因。方法　在pLXSN1 6E6E7质粒中经PCR扩增回收HPV 1 6E6E7基因片段 ,连接于T载体上进行测序 ,将正确的HPV 1 6E6E7插入pAAV -IRES -hrGFP质粒 ,协同pAAV -RC质粒和pHelper质粒共转染HEK 2 93细胞 ,包装表达HPV 1 6E6E7基因的重组腺病毒伴随病毒 ,收获病毒 ,并检测病毒的感染效率。结果　在包装细胞系HEK 2 93细胞中能形成较高感染效率的腺病毒伴随病毒 ,激光共聚焦检测可发现HEK 2 93细胞内有绿色荧光蛋白表达 ,HEK 2 93细胞经PCR可扩增出特异性的HPV 1 6E6E7基因片段 ,经流式细胞仪检测重组病毒的感染效率为71 3%。结论　携带人乳头状瘤病毒 1 6型E6E7基因的腺病毒伴随病毒可感染细胞 ,并在细胞内表达 ,可望用于宫颈癌病因学的研究     

HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌CaSki细胞增殖及成瘤性的影响

目的:通过载体介导的RNA干扰技术干扰E7癌基因的表达,探讨HPV16E7小干扰RNA(siRNA)表达载体对宫颈癌CaSki细胞增殖及成瘤性的影响,以及成为宫颈癌基因治疗新策略的可行性。方法:利用脂质体将HPV16E7特异性siRNA表达载体、空载体转染CaSki细胞,分别命名为CaSki-S、CaSki-P。通过荧光定量RT-PCR及流式细胞仪检测CaSki、CaSki-S、CaSki-P3种细胞E7mRNA和蛋白的变化,通过流式细胞仪及MTT法检测3种细胞的细胞周期及生长曲线变化,并检测3种细胞在裸鼠体内成瘤性及生长活性的差异。结果:荧光定量RT-PCR及流式细胞仪检测显示,CaSki-S细胞E7基因mRNA和蛋白的表达明显低于CaSki细胞,抑制率分别为92.86%、84.21%。MTT法检测显示,CaSki-S细胞生长明显慢于CaSki细胞。流式细胞仪检测细胞周期显示,CaSki-S细胞与未转染组CaSki细胞比较,G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例则明显减少。裸鼠体内成瘤性及生长活性显示CaSki-S细胞显著低于CaSki细胞。而CaSki-P细胞无论是在E7mRNA和蛋白的表达,还是在肿瘤细胞生长、细胞周期的改变及成瘤性方面都与CaSki细胞无明显差异。结论:HPV16E7siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达,部分逆转其恶性表型。因此它有望成为宫颈癌基因治疗的新策略之一。     

非全长型人卵透明带-3蛋白慢病毒表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中表达的研究

目的:构建含非全长型人卵透明带-3蛋白(hZP3)的慢病毒载体,转染293FT细胞获得重组慢病毒颗粒,感染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)使其表达hZP3。方法:将hZP3基因序列插入到慢病毒系统的入门载体pENTR-11中构建为pENTR-hZP3,采用LR重组酶将pENTR-hZP3和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成新重组载体pLenti6/V5-DEST-hZP3。将该重组载体和其它viruspower 3个质粒载体充分混合,用阳离子脂质体转染293FT细胞,培养和待细胞完全裂解后收集富含hZP3基因的病毒颗粒上清液,取适量上清液感染CHO-K1细胞,采用杀稻瘟Blastcidin筛选,挑单克隆对其扩增培养,进行基因水平和蛋白水平的鉴定。结果:获得的含hZP3基因的病毒颗粒上清液滴度为1×105TU/ml,随机挑取的16株单克隆细胞中,有9株表达hZP3。结论:成功构建含hZP3的慢病毒表达载体,获得表达hZP3的CHO株,为后续研究与开发奠定了基础。     

稳定转染短发夹状RNA后子宫颈癌细胞中人乳头状瘤病毒18型E6基因表达的变化

目的探讨宫颈癌细胞株HeLa细胞稳定转染表达短发夹状RNA(shRNA)的质粒后,HeLa细胞中人乳头状瘤病毒18型E6基因(HPV18E6)表达的变化。方法实验组将本实验室前期构建的可遗传性表达HPV18E6shRNA的pE6-1shRNA质粒和含E6基因突变点的pE6-2shRNA质粒分别转染HeLa细胞,对照组以空质粒pSUPER和不加质粒的脂质体分别转染HeLa细胞。稳定转染后,氨基糖苷抗生素(G418)筛选阳性细胞克隆,RT-PCR技术和免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法分别检测HeLa细胞中HPV18E6mRNA和蛋白表达的变化。结果稳定转染后,G418筛选,实验组HeLa细胞有新的阳性细胞克隆形成,而对照组HeLa细胞最终全部死亡。实验组转染pE6-1shRNA质粒的HeLa细胞中HPV18E6mRNA表达水平为0·76±0·28,明显低于对照组转染脂质体者(1·14±0·45)和转染pSUPER质粒者(1·12±0·23,P<0·05);HeLa细胞中HPV18E6蛋白阳性表达强度较对照组转染脂质体者弱。实验组转染pE6-2shRNA质粒的HeLa细胞中HPV18E6mRNA和蛋白表达水平分别与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0·05)。结论稳定转染表达HPV18E6shRNA的质粒后,宫颈癌细胞中HPV18E6mRNA和蛋白表达明显受到抑制。     

外源性人乳头瘤病毒16型E7癌基因导入对HeLa细胞cdc25A表达的影响

目的:研究HPV16型E7病毒癌基因感染对人宫颈癌HeLa细胞周期调节因子cdc25A mRNA表达的影响,探讨E7癌基因和cdc25A在宫颈癌发生发展中的作用。方法:用含有HPV16E7病毒癌基因的重组腺病毒载体感染体外培养的人宫颈癌HeLa细胞。采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测感染前后HeLa细胞cdc25A mRNA表达的差异。结果:感染后HeLa细胞cdc25A的mRNA含量较感染前显著增加(感染前灰度值0.2306±0.0964,感染后0.8739±0.2188,P<0.01)。结论:HPV16E7癌基因促进细胞周期调节因子cdc25A的表达,可能是宫颈癌发病机制中的重要分子事件。     

siRNA对宫颈癌细胞系 HPV16 E6基因的作用

目的 构建并筛选出最有效的HIV16 E6基因特异的小干扰RNA(amall interfering RNA，siRNA)表达载体，观察其对宫颈癌细胞中HIV16 E6基因表达的长期影响，探讨E6基因在宫颈癌发生过程中的分子作用机制，为临床HIV感染及宫颈癌治疗探索新方法。方法 构建Hairpin siRNA质粒，稳定转染宫颈癌SiHa细胞，鉴定转染细胞中的质粒DNA，通过Real-Time RT-PCR检测细胞中HPV16 E6mRNA表达，采用Westem-blot检测p53、p21等蛋白的变化。MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)检测SiHa细胞转染siRNA后细胞增殖曲线。结果 HIV16 E6A hairpin siRNA表达载体转染人宫颈癌SiHa细胞，可以在细胞内长期表达siRNA，有效抑制细胞内HIV16 E6基因的表达。E6A siRNA能抑制细胞生长，作用持续达4个月以上。结论 利用siRNA表达载体抑制整合在细胞中的外源HIV E6病毒癌基因可能是治疗HIV感染和宫颈癌的一种新的理想方法。     

外源性人乳头状瘤病毒16型E7基因对子宫颈癌细胞周期的影响

目的了解外源性人乳头状瘤病毒16型(HPV16)E7基因对子宫颈癌细胞周期的影响。方法从宫颈癌标本中经 PCR 扩增回收 HPV16 E7基因片段,将正确的 E7基因片段插入到穿梭质粒 pAdrTrack-CMV 中,与骨架质粒 pAdEasy-1在大肠埃希菌 Bj5183中同源重组,重组腺病毒质粒转染人胚肾细胞株 HEK-293细胞,包装表达 E7基因的腺病毒,然后转染 HPV18阳性的宫颈癌细胞株HeLa 细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测转染后 HeLa 细胞的增殖情况,以吸光度(A)值表示;流式细胞仪检测转染前后 HeLa 细胞的细胞周期和细胞周期蛋白 D1表达的变化。结果在 HEK-293细胞中,可以收获高转染效率的腺病毒。在荧光显微镜下,可以观察到 HEK-293细胞和 HeLa 细胞中均有绿色荧光蛋白的表达。提取 HEK-293细胞 RNA,RT-PCR 技术可以检测到 E7基因的表达。MTT 比色法检测结果显示,转染后 HeLa 细胞的 A 值最低为0.38±0.02,最高为0.96±0.01,分别与转染前的0.27±0.03比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。流式细胞仪检测结果显示,转染12h后,S 期细胞占(36.0±2.0)%,转染24h 后为(49.9±4.2)%,分别与转染前的(26.0±0.4)%比较,差异均有统计学意义(P<0.05);转染前、后细胞周期蛋白 D1阳性表达率分别为22.4%、55.2%,两者比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论携带 HPV16 E7基因的腺病毒可转染子宫颈癌 HeLa细胞,并在 HeLa 细胞内表达,HPV16 E7基因的表达进一步影响 HeLa 细胞的细胞周期蛋白的表达,促进 HeLa 细胞增殖,可望用于治疗宫颈癌。     

全酿酒酵母HPV16-E7疫苗的构建及免疫原性研究

目的构建人乳头状瘤病毒16型（HPV16）E7重组全酿酒酵母疫苗,评价疫苗的免疫效应。方法将HPV16 E7 cDNA亚克隆人酵母表达载体pYES2／NT,重组质粒转化酿酒酵母,经诱导表达、热灭活制备全酵母HPV16-E7疫苗,免疫C57BL／6小鼠。ELISA、MTT、LDH法分别检测疫苗诱导的细胞因子、脾淋巴细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答水平。结果全酵母疫苗能够有效表达HPV16-E7蛋白;疫苗小鼠免疫,能够刺激脾淋巴细胞增殖,并诱导出Th1型细胞因子和特异性CTL杀伤效应;免疫效果优于单纯HPV16-E7蛋白免疫（P〈0．01）。结论全酵母疫苗既能表达HPV16-E7蛋白,又能有效诱导特异性CTL免疫应答。研究结果为进一步进行疫苗抗肿瘤疗效研究,提供了实验基础。     

人canstatin腺病毒载体的构建及在卵巢癌细胞的表达

目的:构建并鉴定人canstatin基因腺病毒表达载体Ad-can及研究在卵巢癌的表达。方法:(1)提取人卵巢癌组织总RNA,设计带有特殊酶切位点的引物,用RT-PCR方法扩增canstatin片段,克隆入载体pMD-18T,并转化至大肠杆菌DH5α,大量扩增目的基因(pMD-can);(2)双酶切pMD-can和pAdtrack质粒,酶切产物在T4DNA连接酶作用下连接,获得pAdtrack-canstatin(pAdtr-can)穿梭载体;(3)PmeⅠ酶切pAdtr-can,使其线性化,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy共同转化大肠杆菌BJ5183,使其同源重组,获得pADeasy-canstatin(pAd-can)载体;(4)内切酶PacⅠ再次将重组子线性化,脂质体转染细胞株HEK293,借助GFP表达观察包装病毒Ad-can。重组腺病毒载体感染HEK293细胞扩增病毒,经4次扩增、纯化后,用空斑形成实验法测病毒滴度;(5)用包装的病毒转染卵巢癌细胞HO8910PM,借助GFP的荧光表达观察卵巢癌细胞转染情况;(6)RT-PCR检测转染后卵巢癌细胞中目的基因的表达。结果:各中间载体经酶切鉴定,DNA测序证实正确。转染的HEK293细胞2～3天产生病毒,7～10天出现病毒斑。最终包装的病毒中携带有目的基因canstatin,并能够在包装细胞中表达。用空斑形成实验法测定病毒滴度约为1.6×1011pfu/ml。将包装的病毒转染卵巢癌细胞,荧光显微镜下可观察到大部分卵巢癌细胞发出绿色荧光,经RT-PCR检测可发现canstatin基因扩增片段。结论:大肠杆菌内同源重组法能有效和较方便的构建canstatin基因腺病毒载体Ad-can。重组子Ad-can能转染卵巢癌细胞,并在卵巢癌细胞中表达,为进一步研究canstatin基因治疗卵巢肿瘤提供了良好的转导载体。     

高危型HPV16 E6蛋白表达抑制宫颈癌细胞株p63α表达的研究

目的:探讨高危型HPV16 E6蛋白的表达对宫颈癌细胞株中p63α表达的影响。方法:用RT-PCR法从SiHa中扩增出带酶切位点的HPV16 E6的片段,将HPV16 E6基因片段克隆到p3×flag-CMV-Myc-24真核表达载体上,通过脂质体转染入宫颈癌细胞株后,W estern blot检测p63α的表达。结果:成功构建HPV16 E6真核表达载体,转染至宫颈癌SiHa和Caski细胞株中,p63α均低于对照组。结论:高危型HPV E6能够抑制p63α的表达,提示p63α与HPV E6的相互作用在子宫颈癌发病中发挥重要作用。     

人乳头状瘤病毒16型E6、E7基因诱导的人子宫颈永生化上皮细胞系的建立及其生物学特性的鉴定

目的 建立人宫颈上皮的永生化细胞系,并进行生物学特性进行鉴定。方法 用含人乳头状瘤病毒(HPV)16型E6、E7基因的腺病毒伴随病毒感染人胎儿宫颈上皮细胞,培养、传代。采用激光共聚焦免疫荧光和PCR技术检测HPV16型E6、E7基因的表达情况;取20代细胞,采用软琼脂培养、染色体核型分析和Scid小鼠皮下接种等方法检测细胞系的生物学特性;采用电子显微镜观察细胞的形态。结果 20代细胞的表型仍保留原代上皮细胞的特征,表现为单层生长和锚锭依赖性生长。激光共聚焦免疫荧光和PCR技术检测显示,细胞内有HPV16型E6、E7基因的表达,其基因片断长度为829bp。20代细胞进行软琼脂培养不形成克隆;scid小鼠皮下接种未成瘤;染色体核型分析：勾二倍体和多倍体,11号染色体可能为HPV16型E6、E7基因整合的部位。电子显微镜观察可见张力原纤维,证实细胞为鳞状上皮来源。结论 成功建立了HPV16型E6、E7基因诱导的宫颈上皮永生化细胞系,且其生物学特性稳定,可进一步用以宫颈癌病因和发病相关机制的研究。     

自噬基因Beclin1抑制宫颈癌HeLa细胞裸鼠移植瘤生长的研究

目的:研究自噬基因Beclin1对裸鼠宫颈癌细胞株HeLa移植瘤的抑制作用。方法:将自噬基因Beclin1真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Beclin1经脂质体包裹后转染人宫颈癌HeLa细胞,通过荧光定量PCR(RT-PCR)和Westernblot检测其mRNA及蛋白水平的表达,MTT法检测细胞生长抑制率;将HeLa细胞接种于裸鼠右前肢腋下建立裸鼠人宫颈癌移植瘤模型,待瘤结节直径≥5mm后,分别以重组质粒pcDNA3.1(+)-Bec-lin1、pcDNA3.1(+)和生理盐水200μl每两天1次直接瘤内注射,连用3周后,测量3组肿瘤大小并观察肿瘤组织形态学改变。结果:pcDNA3.1(+)-Beclin1能使HeLa中Bec-lin1mRNA及蛋白表达增加(P<0.05),并显著抑制HeLa细胞的生长,呈现时间依赖性,与其余两组相比,有显著统计学差异(P<0.05);经重组质粒治疗21天后,裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,相对于对照组瘤体明显缩小、瘤重明显减轻(P<0.05),病理检查可见,pcD-NA3.1(+)-Beclin1处理组瘤块内细胞坏死减少,结缔组织增生,而对照组中癌细胞分布呈弥漫性。结论:自噬基因Beclin1可以抑制HeLa移植瘤的生长。