人源DNMT1基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及其活性检测

目的:利用PCR扩增人源DNA甲基转移酶1(DNMT1)基因启动子,构建其荧光素酶报告基因载体并对其活性进行检测。方法:运用PCR技术以人非小细胞肺癌细胞A549基因组DNA为模版扩增出目的片段,将PCR产物用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic上,然后进行转化、菌落PCR及测序验证等。将构建成功的pGL3-proDNMT1-luc重组质粒和内参质粒pRL-CMV-luc共转入H1299细胞中检测DNMT1启动子活性。结果:成功扩增出长度为1634 bp的目的片段,并成功构建出DNMT1启动子荧光素酶报告基因载体,启动子具有活性。结论:DNMT1启动子的成功克隆为进一步研究其分子调控机制和生物学意义奠定了基础。     

肠三叶因子启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性分析

目的:克隆肠三叶因子(ITF)启动子序列,构建ITF启动子荧光素酶报告基因载体,并检测启动子活性。方法:运用PCR方法从人全血基因组DNA中获得目的基因;双酶切后连接到荧光素酶报告基因载体上,构建不同长度的ITF启动子报告基因载体(-100--1 826bp);将重组质粒转染至HEK293细胞和LS174细胞48h后,采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。结果:PCR扩增出不同长度的ITF启动子片段;双酶切及测序鉴定重组体构建正确;转染HEK293细胞和LS174细胞后检测启动子活性,100和200bp启动子活性较低,而300至1 826bp启动子活性较强。结论:成功构建了ITF启动子报告基因载体,具有活性的启动子最小长度为300bp。     

含mdr1启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建

目的克隆编码mdr1基因的启动子并插入荧光素酶报告基因载体.方法用PCR技术扩增出人类mdr1基因启动子片段,通过亚克隆将启动子分别插入到pGEM-T载体和荧光素酶报告基因pGL3-enhancer载体中,并确定扩增DNA的序列.结果测序结果显示扩增mdr1启动子序列正确.结论成功克隆了mdr1启动子,为下一步对多耐药性卵巢癌进行靶向基因治疗提供了重要基础.     

抑癌基因BRCA1启动子荧光素酶报告基因的构建及活性测定

目的:克隆人BRCA1基因的启动子,构建荧光素酶报告基因载体,并在细胞内检其活性,为其后续基因凋控研究提供依据。方法:采用PCR技术,从人正常宫颈组织细胞中扩增出BRCA1启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,测序所扩增的DNA序列,将其转染入HCT 116细胞中并检测其活性。结果:酶切及基因测序方法证实所构建质粒含有pGL3-basic全序列及BRCA1启动子上游调控序列,扩增的BRCA1启动子序列正确;双报告基因实验检测荧光素酶活力表明,p53缺失的HCT116细胞中BRCA1启动子明显增加（P<0.05）,构建的报告基因具有启动子活性。结论:克隆BRCA1启动子及成功构建人BRCA1启动子报告基因,可实现快速、经济和准确地克隆已知基因启动子分子和构建启动子载体的目的。     

p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的 构建人p53RFP基因启动子序列不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,研究启动子的转录活性.方法 PCR扩增人p53RFP基因启动子区域不同长度的目的片段,克隆到pGL3-Basic中,构建启动子区域3个不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双酶切和基因测序鉴定正确后,转染HEK293细胞,双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性.结果 成功构建了p53RFP启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双荧光素酶报告基因检测分析,3个启动子片段均具有转录活性.结论 成功构建了人p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体,为研究p53RFP基因的转录调控机制提供了实验基础.     

含人SOD_2基因启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建和鉴定

目的:从人基因组中克隆SOD2基因的启动子并插入到荧光素酶报告基因载体中并进行基因测序鉴定。方法:以人基因组DNA为模板,用PCR的方法扩增出人SOD2基因启动子片段后,将其插入到pGL3-basic载体的荧光素酶报告基因上游,将构建的重组质粒通过双酶切片段的凝胶电泳分析和DNA测序以确定插入位置和序列的正确性。结果:双酶切反应和测序结果显示SOD2基因启动子插入的位置和序列是正确的。结论:成功克隆了SOD2基因启动子,为后续SOD2转录调控机制的研究提供重要的实验基础。     

MDR1 基因单靶点双荧光素酶报告基因系统的建立

目的通过构建以MDR1启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统并进行活性分析，为MDR1基因表达的单靶点调控研究和逆转剂的筛选提供一种有效的方法。方法从HCT-8细胞中提取DNA并克隆含有MDR1基因启动子中Y—box序列。将该序列重组到萤光素酶报告基因载体pGL-3．Basic的启动区域中，从而构建报告基因载体pGL-MDR1。将pGL-MDR1和pRL-TK载体共转染到HCT-8和HCT-8／VCR细胞中。通过调节不同载体的比例来优化转染效率。利用MDRI基因激活剂（热诱导）和抑制剂（EGCG）等处理来分析其启动转录活性受外界因素的影响。结果通过直接测序法验证了pGL-MDR1含有MDR1基因启动子Y—box序列且没有出现碱基突变。在pGL-MDR1和pRL-TK的转染比例为5：5时，转染效率最高并具有最高的萤光素酶活性。通过MDR1基因激活处理后表现为时间依赖性地激活MDR1基因的表达，而MDR1基因抑制剂的作用则相反。结论MDR1启动子为启动序列的双荧光素酶报告基因系统建立成功。该系统不但可以用于研究活体生物发光成像和MDRI基因表达的机理，而且可用于单靶点的多药耐药抑制剂的筛选。     

GPC3启动子报告基因载体构建与转录活性分析

目的 构建磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)启动子荧光素酶报告基因载体,并验证其转录活性.方法 以人类基因组DNA为模板,PCR扩增GPC3启动子基因片段,克隆到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体上,通过转染HepG2细胞检测荧光素酶活性来验证GPC3启动子的转录活性.结果 GPC3基本启动子和全长启动子分别成功构建到pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体中,GPC3基本启动子具有很强的转录活性,而全长启动子的转录活性比基本启动子高4倍以上.结论 成功构建了GPC3启动子荧光素酶报告基因载体,为研究GPC3转录调控提供了重要手段.     

含人P21启动子双荧光素酶基因载体的构建

目的构建带有EGFP标记含人P21启动子的双荧光素酶报告基因载体。方法从人血白细胞DNA中克隆P21启动子,用于控制firefly荧光素酶的表达;renilla荧光素酶基因和EGFP基因用IRES连接,在CMV启动子控制下表达;上述元件和基因克隆至载体pLL3.7中,应用酶切和测序的方法进行鉴定正确后转染至293FT细胞观察EGFP表达。结果经酶切、测序证实成功构建了带有EGFP标记的含人P21启动子的双荧光素酶报告基因的载体,并成功表达EGFP。结论含人P21启动子的双荧光素酶报告基因的载体成功构建,为下一步的药物筛选打下基础。     

EOLA1基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.     

EOLAl基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.     

Id1启动子的荧光素酶报告基因载体的构建及其在肝癌HepG2细胞中的活性检测

目的:扩增Id1启动子基因,构建Id1启动子的报告基因载体. 方法:通过PCR及双酶切方法,从HepG2细胞基因组DNA中获得Id1基因编码序列上游包含不同长度碱基的两段Id1启动子序列;分别克隆到报告基因pGL3-enhancer载体上,构建包含两段不同长度Id1启动子的报告基因载体;用脂质体转染法将两报告基因载体分别转染至肝癌HepG2细胞系;采用双荧光素酶报告基因系统评估Id1启动子活性. 结果:经PCR方法扩增出大小分别为1096 bp和266 bp的两段不同长度的Id1启动子片段,序列测定其编码序列及读框正确,酶切鉴定亚克隆序列正确. 瞬时转染HepG2后经报告基因检测,两段启动子均具有转录活性. 结论:成功构建了Id1启动子的报告基因载体,为进一步研究Id1启动子和肝癌的关系奠定了实验基础.     

EOLA1基因5'侧翼区的克隆及调控功能初步研究

目的研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(endothelial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1)基因5'侧翼区的调控序列.方法通过基因组步移克隆EOLA1基因5'侧翼区不同长度的片段,插入β-半乳糖苷酶(β-gal)报告基因载体,分析各片段在ECV304细胞中的β-gal调节活性.结果含EOLA1基因5'侧翼区-1～-2 659 bp和-1～-1 951 bp序列的重组质粒在ECV304细胞中能明显表现β-gal上调活性,而-1～-361 bp序列的重组质粒活性无明显变化.结论 EOLA1基因5'侧翼区-361～-1 951 bp内存在基因转录启动子元件.     

稳定表达人BACE1启动子及荧光素酶报告基因HEK293细胞株的建立

目的 对人β位点裂解酶-1(BACE1)基因核心启动子进行克隆,构建携带BACEI基因启动子的荧光素酶报告载体,筛选稳定表达细胞株并分析其转录活性.方法 提取人胚肾HEK293细胞基因组DNA,以其为模板,PCR扩增BACE1核心启动子(-691～+67)并克隆至荧光素酶报告载体pGL4.21中,构建BACE1基因启动子荧光素酶报告载体pGL4.21-BACE1,将其转染HEK293细胞(无启动子的pGL4.21载体作阴性对照),利用嘌呤霉素筛选稳定表达株后检测其转录活性.结果 成功扩增到758 bp的BACE1核心启动子,pGL4.21-BACE1载体经双酶切鉴定正确;HEK293细胞被该载体转染后经嘌呤霉素筛选得到6株稳定表达BACE1启动子的细胞株,其转录活性分别是对照组(HEK293/pGL4.21)的(134.7±22.3)、(634.0±13.9)、(437.6±6.1)、(805.5±5.5)、(492.8±59.1)、(1 021.1±46.6)倍(P=0.001).结论 成功构建了人BACE1基因启动子荧光素酶报告载体.     

EOLA1基因5′侧翼区的克隆及调控功能初步研究

目的研究内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(endothelial overexpressedlipopolysaccharide associatedfactor1,EOLA1)基因5′侧翼区的调控序列。方法通过基因组步移克隆EOLA1基因5′侧翼区不同长度的片段,插入β半乳糖苷酶(βgal)报告基因载体,分析各片段在ECV304细胞中的βgal调节活性。结果含EOLA1基因5′侧翼区-1～-2659bp和-1～-1951bp序列的重组质粒在ECV304细胞中能明显表现βgal上调活性,而-1～-361bp序列的重组质粒活性无明显变化。结论EOLA1基因5′侧翼区-361～-1951bp内存在基因转录启动子元件。     

虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的:构建表达虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为腺病毒中和抗体流行水平的定量检测奠定基础?方法:采用腺病毒表达系统(ViraPower Adenoviral Expression System)构建重组腺病毒表达载体?首先利用PCR的方法扩增虫荧光色素酶基因使其具备特定的CACC接头,以连接?转化?提取质粒等方法克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得入门克隆,经PCR及测序鉴定正确后,用重组酶(LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix)进行入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应,以获得表达克隆rAd-Luci?表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒?经过扩增后,用极限稀释法检测病毒滴度,用Western blot法检测rAd-Luci载体是否能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并检测此酶蛋白的功能活性?结果:用PCR的方法扩增到具有CACC接头的虫荧光色素酶基因,其重组入门和腺病毒表达克隆经PCR和测序鉴定构建正确,重组表达克隆转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为1.8×1011 pfu/ml,此病毒能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并且具有较强的功能活性?结论:成功构建了虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为此重组载体用于腺病毒中和抗体的定量检测奠定基础?     

HMGB1启动子荧光素酶报告基因的构建及鉴定

目的：构建高迁移率族蛋白B1（HMGB1）启动子驱动的荧光素酶报告基因的真核表达载体pGL3-HMGB1P,转染肺泡上皮细胞（A549）后检测报告基因在机械牵张刺激中的转录活性.方法：以A549细胞基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增HMGB1启动子片段,测序正确后克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3,将重组质粒pGL3-HMGB1P导入A549细胞,检测不同强度机械牵张（分别为5%和20%）刺激下荧光素酶的活性变化.结果：PCR和测序结果表明扩增的HMGB1启动子序列正确,酶切检测证实重组真核表达载体pGL3-HMGB1P构建成功.在5%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的2.9倍（P〈0.05）;而在20%牵张应变作用下,转染pGL3-HMGB1P的A549细胞荧光素酶活性是转染空载体pGL3-Basic的6.2倍（P〈0.01）.结论：利用荧光素酶报告基因系统证实机械牵张可诱导HMGB1转录表达增加,为深入研究HMGB1转录表达的调控机制提供了基础.