小鼠IL-1β在H22细胞的表达及对NK细胞杀伤活性的影响

目的：重组表达小鼠IL-1β全长基因，转染H22肝癌细胞，分析对NK细胞杀伤活性的影响。方法：构建小鼠IL-1β重组表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β，利用jetPEI转染H22肝癌细胞，RT—PCR和激光扫描共聚焦显微镜分析IL-1β重组载体的表达，MTT方法分析转染前后，野生型小鼠脾脏NK细胞对H22细胞杀伤活性的变化。结果：RT—PCR扩增出小鼠IL-1β，长度约843bp。纯化的PCR产物与pIRES2-EGFP同时经Xho I和EcoR I双酶切，在T4连接酶作用下连接，转化大肠杆菌，提取质粒经PCR、限制性酶谱分析（XhoI＋EcoRI）和DNA序列测定后，确认获得重组表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β。将该质粒转染至H22小鼠肝癌细胞中，RT—PCR和荧光观察证实，H22细胞能表达高水平IL-1β重组表达载体，与转染空载体的对照组细胞相比，IL-1β转基因后H22细胞对NK92细胞杀伤抵抗性明显增强，同时野生型小鼠脾脏NK细胞对pIRES2-EGFP-mIL-1β转基因细胞的杀伤活性明显下降，效靶比40：1时下降了约10％。结论：IL-1β能够明显增强H22肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗性，可能是肝癌细胞借以逃逸天然免疫应答的重要机制。     

人IL-1β重组表达载体在肝癌细胞的表达及对其NK细胞杀伤敏感性的影响

目的：构建全长人IL-1β真核表达载体,转染H7402肝癌细胞,分析对其NK细胞杀伤敏感性的影响。方法：RT-PCR法扩增人IL-1β基因全长编码序列,经T-A克隆,构建pIRES2-EGFP-IL-1β重组表达载体,采用阳离子聚合物jetPEI的方法转染H7402肝癌细胞,G418筛选获得稳定表达的细胞克隆,RT-PCR分析IL-1β的表达水平,MTT方法分析转染前后NK细胞对肝癌细胞杀伤活性的变化。结果：从LPS处理的人外周PBMCs总RNA中扩增出IL-1β（大小约829 bp）,先构建pMD18-IL-1β克隆载体,DNA序列鉴定正确后,利用Pfu DNA聚合酶将IL-1β基因亚克隆到pIRES2-EGFP中,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-IL-1β,经PCR、限制性酶谱分析（BamHⅠ和EcoRⅠ）和DNA序列测定正确后,将其转染H7402肝癌细胞,G418筛选获得稳定表达IL-1β的细胞,与转染空载体的细胞相比,该细胞对NK-92细胞杀伤的敏感性显著降低,效靶比10∶1时下降了约30%。结论：促炎性细胞因子IL-1β能够显著增强肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗性,可能是导致肝癌细胞发生天然免疫逃逸的重要机制。     

人caspase-1基因在肝癌细胞中的表达及对IL-1β水平的影响

目的:将人caspase-1基因真核表达载体转染肝癌细胞后观察其表达水平及对IL-1β水平的影响,为研究cas-pase-1与IL-1β的关系及其在慢性炎症与肿瘤中的作用提供依据。方法:利用阳离子聚合物(jetPEI)将pIRES2-EGFP-caspase-1重组表达载体和pIRES2-EGFP对照载体转染人肝癌细胞HepG2(HepG2/caspase-1、HepG2/mock),48小时后倒置相差荧光显微镜下观察表达情况,利用RT-PCR、Western blot方法检测两组细胞caspase-1表达水平,采用caspase-1底物显色分析研究的方法检测两组细胞中caspase-1的活性。夹心ELISA法检测细胞培养上清以及细胞裂解液中IL-1β的表达水平。结果:转染48小时后倒置相差显微镜下可见,pIRES2-EGFP-caspase-1和pIRES2-EGFP重组表达载体均能在HepG2细胞中高效表达;HepG2/caspase-1细胞中caspase-1 mRNA表达水平显著提高;经LPS刺激后,HepG2/caspase-1细胞中caspase-1总蛋白的水平明显升高;caspase-1的生物活性水平与对照组相比具有显著性差异(t=25.679,P<0.05);HepG2/caspase-1细胞培养上清中IL-1β的水平明显高于HepG2/mock组细胞(t=3.417,P<0.05),胞浆裂解液中的变化相对不显著(t=2.396,P>0.05)。结论:人caspase-1基因真核表达载体pIRES2-EGFP-caspase-1能够在肝癌细胞中高效表达caspase-1,且该重组表达载体在HepG2细胞中能提高活性IL-1β的表达。     

NKG2D配体在鼻咽癌细胞的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响

NK细胞对靶细胞的杀伤活性与其细胞表面的受体和靶细胞表面的配体密切相关，NKG2D为NK细胞活化性受体，表达于所有的NK细胞表面，是介导NK细胞识别和溶解肿瘤细胞的主要活化性受体。NKG2D配体为MHCⅠ类链相关基因产物（MICA、MICB）及ULBPS（人巨细胞病毒UL16蛋白的结合蛋白ULBP1、ULBP2、ULBP3），NKG2D的配体在多种肿瘤细胞表达，其在鼻咽癌细胞的表达尚未见报道。本文通过流式细胞仪技术探讨其在鼻咽癌细胞CNE2的表达情况，并进一步分析其在NK细胞杀伤CNE2细胞中的作用。     

IL-1β对Hepa1-6细胞增殖、迁移及IFN应答的影响

目的:构建应用于小鼠肝脏内表达和研究的IL-1β肝癌细胞特异性表达载体,观察其对小鼠Hepal-6细胞体外增殖活性、迁移能力及干扰素增殖抑制效应等体外生物学行为的影响.方法:由C57BL/6小鼠腹腔液巨噬细胞扩增IL广1β基因,构建肝脏特异性pLIVE-IL-1β重组表达载体.利用transiT-LT1将鉴定后的pLIVE-IL-1β转染至Hepal-6肝癌细胞,RT-PCR及双抗体夹心ELISA法分析转染前后IL-1表达水平,MTT法分析IL-1对细胞体外增殖活性的影响;利用细胞划痕实验分析对其迁移能力的影响,并确定对IFN-α诱导的细胞增殖抑制效应的作用.结果:重组载体经限制性酶谱分析酶解出822 bp的条带,其序列与GenBank登录的小鼠IL-1β基因一致;转染后的Hepal-6细胞培养上清中IL-1β的表达明显增高,细胞体外增殖速度明显加快;给予IFN-α作用后,IL-1β的表达使细胞对于扰素的抵抗性明显增强.结论:小鼠IL-1β肝癌组织特异性表达载体pLIVE-IL-1βp能够在小鼠肝癌细胞中高效表达IL-1β,并能够显著促进肿瘤的体外增殖和迁移能力,削弱IFN-α对Hepal-6细胞的增殖抑制作用.     

IL-2、IL-15对NK细胞亚群表型和功能的调节作用

目的 探讨IL-2和IL-15对NK细胞亚群表型和功能的调节作用。方法 采用双色免疫荧光染色和流式细胞仪分析，比较IL-2和IL-15对新鲜分离外周血单个核细胞（PBMC)中NK细胞及经混合淋巴细胞培养(MLC)活化的NK细胞表型的调节作用；用4h ^51Cr释放实验检测IL-2和IL-15对NK细胞杀伤水平的影响。结果 在PBMC培养中，当IL-2或IL-15最终为50U／mL时，能明显上调PBMC中CD56^ NK细胞的比例，且IL-15对CD56^bright亚群增殖的促进作用强于IL-2；在MLC中，当IL-2或IL-15为50U／mL时，能够促进MLC活化的NK细胞比率的增加，NK细胞亚群由CD56^dim为主转变成CD56^bright为主，此诱导作用IL-2强于IL-15。IL-2和IL-15都能上调PBMC和MLC中NK细胞杀伤水平，并呈剂量依赖关系，在PBMC中，当IL-15为50U／mL时，IL-15对NK细胞杀伤水平的促进作用强于IL-2；而在MLC中当IL-2为50U／mL时，对NK细胞杀伤水平的促进作用高于IL-15。在PBMC中，同时加入50U／mL的IL-15和IL-2，NK细胞杀伤率高于单独加入IL-15或IL-2。结论 IL-15促进PBMC中NK细胞向CD56^bright亚群分化和杀伤水平强于IL-2，而IL-2促进同种异体抗原诱导的活化NK细胞向CD56^bright亚群分化和杀伤水平则高于IL-15。这种反应格局的差别，可能与不同条件下NK细胞IL-2或/和IL-15细胞因子受体表达不同以及同时有其他细胞因子的协同作用有关。     

IL-12依赖于TRAIL途径增强NK细胞对Jurkat细胞的杀伤功能

目的:探讨IL-12增强正常人NK细胞对Jurkat细胞杀伤功能的相关机制。方法:纯化正常人NK细胞,分为加或不加IL-12两个刺激组,通过基因芯片筛选差异基因,并通过流式细胞术在单个细胞水平检测相关杀伤分子的表达。结果:基因芯片系统结果显示IL-12刺激组和未刺激组相比,17种基因具有显著性差异(fold change≥10),其中5种基因上调,12种基因下调。在IL-12的刺激作用下,TRAIL的表达在CD56+CD16+和CD56-CD16+NK细胞上显著增加。同时,Jurkat细胞亦高表达TRAIL受体TRAIL-R2(DR5)。TRAIL中和抗体RIK-2可以阻断IL-12诱导的NK细胞对Jurkat细胞的杀伤功能。结论:TRAIL是IL-12增强正常人NK细胞对Jurkat细胞杀伤功能的主要途径之一。     

层粘连蛋白反义RNA对TGFβ1调节五种细胞内信号分子表达的影响

目的　明确转化生长因子 (transforming growth factorβ1 ,TGFβ1 )对大肠癌细胞 E-钙粘着蛋白、α-、β-、γ-连环蛋白及粘着斑激酶 (focal adhesion kinase,FAK)的影响 ,明确层粘连蛋白 (laminin,L M)反义 RNA对上述表达的调节作用。方法　采用免疫印迹技术检测各蛋白的表达水平 ,采用增强的化学发光技术显示结果。结果　 TGFβ1 可促进α-和γ-连环蛋白表达。该表达不受 L M反义 RNA的影响 ;TGFβ1可促进 E-钙粘着蛋白表达 ,但 L M反义 RNA既可抑制 E-钙粘着蛋白表达 ,又能抑制 TGFβ1 对该蛋白的调节作用 ;TGFβ1 只有在 L M反义 RNA存在下才具有抑制 FAK表达的作用。结论　 TGFβ1 对肿瘤恶性表型的抑制作用可能与 E-钙粘着蛋白、α-、γ-连环蛋白表达增加有关 ,E-钙粘着蛋白和 FAK表达的改变可能是 TGFβ1 通过影响 L M的表达间接作用所致。 TGFβ1 对肿瘤细胞表型的影响是多种蛋白综合作用的结果。     

分泌型小鼠IL-1β表达载体促进Hepa1-6肝癌细胞的增殖和迁移

目的:构建小鼠经典途径分泌型IL-1β真核表达载体,转染Hepa1-6细胞后,检测胞质及上清中IL-1β分泌表达水平,并考察其对肝癌细胞体外增殖活性、迁移能力的影响。方法:利用特异性上下游引物将小鼠AFP信号肽序列和小鼠IL-1β成熟蛋白编码基因进行拼接后,再与pLIVETM载体进行连接,DNA测序鉴定阳性克隆;jetPEI法将重组载体、pLIVETM空载体、pLIVE-lacZ转染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6后,经β-gal染色监测转染效率;各转染组经LPS及monesin处理后双抗体夹心ELISA法分析细胞培养上清及细胞裂解液中IL-1β的表达水平;通过MTT方法分析经典途径分泌型IL-1β对细胞体外增殖活性的影响。结果:成功构建出了小鼠分泌型IL-1β真核重组表达载体pLIVE-smIL-1β;β-gal染色后,显示外源基因在3 d左右时转染效率最高;双抗体夹心ELISA法表明转染后与Hepa1-6/mock组细胞相比,Hepa1-6/smIL-1β组细胞胞质和上清中IL-1β的表达明显增高;MTT及细胞迁移实验分析证实,转染Hepa1-6/smIL-1β组细胞体外增殖速度明显加快。结论:该表达载体可以通过经典途径分泌促炎性因子IL-1β且高效表达成熟肽IL-1β,并能够显著促进肿瘤细胞的体外增殖和迁移能力。     

IL-2活化人NK细胞的作用机理

淋巴因子激活的杀伤细胞可以杀伤NK细胞耐受的靶细胞[1 ] ,用足量的IL 2处理NK细胞可加强其细胞毒作用 ,因此IL 2广泛应用于肿瘤等疾病的治疗。对IL 2促进NK细胞毒作用的分子机制 ,尤其是活化NK细胞后激活信号传导的过程知之甚少。国外许多研究已表明[2 ] ,Ca2 和蛋白激酶C (Proteinkinasec ,PKC)对调节NK细胞的活性起主导作用。本研究目的旨在探讨IL 2是否触发了NK细胞由Ca2 介导的信号传导途径 ,以初步探讨IL 2活化NK细胞的分子机制 ,为临床更好地应用IL 2治疗肿瘤及病毒性疾病提供理论依据。1　材料与方法1.1　主要试…     

反义RNA阻断Hep G2细胞FasL的表达及功能研究

应用分子克隆技术将人FasLcDNA片段反向插入逆转录病毒载体pLXSN ,构建重组质粒pL (hFasL AS )SN ,转染包装细胞PA317后获得FasL反义RNA重组逆转录病毒表达载体假病毒上清 ,经NIH3T3细胞检测其感染滴度后转染肝癌细胞株HepG2细胞并筛选建系 ,命名为HepG2 hFasL AS。半定量RT PCR检测显示HepG2 FasL AS细胞FasL的mRNA明显少于正常HepG2细胞 ;FACS检测显示HepG2 FasL AS细胞FasL的表达与HepG2细胞相比显著下降 ;同时 ,HepG2 FasL AS细胞导致HL 6 0细胞凋亡能力有所下降。表明人FasL反义RNA重组逆转录病毒表达载体能抑制转染细胞FasL的表达并下调其致凋亡功能     

DNAM-1介导静止NK细胞对新分离的卵巢癌细胞的识别杀伤

NK细胞杀伤肿瘤的功能是众所周知的，但是对于静止NK细胞和新分离的人类肿瘤细胞间的相互作用几乎未见报道。最近，有研究针对来自健康供体的静息状态NK细胞和晚期卵巢癌患者低表达HLAI类分子的卵巢癌细胞进行了相关实验。     

血管内皮细胞(ECV304)表达的HLA-G1对NK细胞杀伤活性的抑制作用

目的:证实HLA-G1分子能够抑制NK细胞对同种血管内皮细胞系的杀伤作用。方法:采用脂质体介导的DNA转染技术,以构建的真核表达质粒pcDNA3-HLA-G1转染人脐静脉内皮细胞系ECV304,再用免疫荧光法检测表达的HLA-G1分子。并用MTT比色法检测HLA-G1对NK细胞杀伤活性的影响。结果:ECV304细胞上可稳定表达HLA-G1。NK细胞对空质粒pcDNA3转染的ECV304细胞的杀伤率为(50.6±18.1)%;而对pcDNA3-HLA-G1转染的ECV304细胞的杀伤率为(29.7±11.4)%,两者差异具有显著意义(P<0.01)。结论:HLA-G1分子可明显抑制NK细胞对同种血管内皮细胞的杀伤效应。     

血管活性肠肽对leydig细胞分泌的IL-1、IL-6和TGF-β的影响

目的研究血管活性肠肽（VIP）对感染时的leydig细胞分泌的细胞因子IL-1、IL-6和TGF-β的影响。方法SD大鼠的睾丸经Ⅱ型胶原酶消化、过滤及Pereoll分离获得高纯度、高活率的leydig细胞,经不同剂量的VIP作用后,再感染溶脲脲原体（UU）,观察在UU感染时,不同剂量VIP对leydig细胞分泌的IL-1（MTT法）、IL-6、TGF-β（ELISA法）的影响。结果UU感染时,VIP对leydig细胞分泌的细胞因子有明显的影响：能促进leydig细胞分泌IL-1（活性）、抑制IL-6（含量）分泌;同时既能促进（高剂量VIP）又能抑制（低剂量VIP）TGF-β分泌。结论在UU感染时,VIP能改变大鼠leydig细胞细胞因子的分泌格局,表明VIP在抗感染免疫中具有一定的免疫调节作用。     

表达反义细胞周期蛋白cyclinD1载体对胰腺癌细胞生长和凋亡的 …

观察反义细胞周期蛋白ｃｙｃｌｉｎＤ１对胰腺癌细胞的生长影响。方法采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和Ｎｏｒｔｈｅｒｍｂｌｏｔ方法检测了５株人胰腺癌细胞中ｃｙｃｌｉｎＤ１的扩增及表达情况。     

低氧对大鼠大脑皮层细胞表达IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的影响

目的:观察不同氧浓度环境下不同时间处理对大鼠大脑皮层细胞表达IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的影响。方法:原代培养新生SD大鼠大脑皮层细胞,设1%、4%两个低氧浓度和3、6 h两个低氧处理时间,处理结束后收集各组细胞,采用实时荧光定量PCR(RT-QPCR)方法检测各组细胞表达IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA情况。结果:与相应的常氧对照组相比,1%和4%氧浓度环境处理细胞3 h和6 h时,IL-1β和TNF-αmRNA表达量均无明显变化(P>0.05);处理细胞3 h时,IL-6 mRNA表达量均无明显变化(P>0.05),但有上升的趋势,处理细胞6 h时IL-6 mRNA表达量均显著升高(P<0.05)。结论:1%和4%氧浓度环境虽均对大脑皮层细胞表达IL-1β和TNF-α mRNA无影响,但可诱导细胞表达IL-6 mRNA,且具有时间依赖性。     

带有人红细胞生成素信号肽序列的IL-1β基因在HepG2细胞中的表达北大核心CSCD

目的构建由经典分泌途径和非经典途径表达人IL-1β的慢病毒载体,制备慢病毒后,感染HepG2肝癌细胞,比较肝癌细胞中IL-1β表达的水平。方法分别以表达人IL-1β前体蛋白基因和人红细胞生成素(EPO)信号肽序列与IL-1β成熟蛋白融合基因的pIRES2-EGFP-proIL-1β和pIRES2-EGFP-epoIL-1β质粒为模板,PCR扩增获得人IL-1β全长基因和含有EPO信号肽与IL-1β成熟蛋白融合基因的序列,将其分别克隆入pLenti6/V5慢病毒载体中,构建由非经典途径和经典途径分泌IL-1β的pLenti6/V5-proIL-1β和pLenti6/V5-epoIL-1β慢病毒表达载体。利用三质粒包装体系在HEK293T细胞中包装生产慢病毒,随后感染HepG2肝癌细胞,双抗体夹心ELISA和Western blot法检测细胞质和培养上清中IL-1β的表达水平。结果构建了含有人IL-1β全长基因和含有EPO信号肽与IL-1β成熟蛋白融合基因的pLenti6/V5-proIL-1β和pLenti6/V5-epoIL-1β慢病毒载体,经双酶切和DNA测序证实与基因库中登录的人IL-1β以及EPO信号肽序列一致。利用三质粒系统包装制备经不同途径表达IL-1β的慢病毒,研究证实经由2条不同途径分泌表达人IL-1β的慢病毒感染HepG2细胞后,与转染空载体的对照细胞相比,细胞培养液上清和胞质中IL-1β的水平均显著升高(P<0.01),其中HepG2/epoIL-1β细胞培养液上清中成熟蛋白IL-1β的水平明显高于HepG2/proIL-1β细胞,而胞质中总IL-1β的水平HepG2/proIL-1β高于HepG2/epoIL-1β。结论构建的带有EPO信号肽序列的IL-1β基因的慢病毒载体,在HepG2细胞表达后,分泌成熟IL-1β的水平明显高于非经典途径分泌的表达载体。     

带有人红细胞生成素信号肽序列的IL-1β基因在HepG2细胞中的表达

目的构建由经典分泌途径和非经典途径表达人IL-1β的慢病毒载体,制备慢病毒后,感染HepG2肝癌细胞,比较肝癌细胞中IL-1β表达的水平。方法分别以表达人IL-1β前体蛋白基因和人红细胞生成素(EPO)信号肽序列与IL-1β成熟蛋白融合基因的pIRES2-EGFP-proIL-1β和pIRES2-EGFP-epoIL-1β质粒为模板,PCR扩增获得人IL-1β全长基因和含有EPO信号肽与IL-1β成熟蛋白融合基因的序列,将其分别克隆入pLenti6/V5慢病毒载体中,构建由非经典途径和经典途径分泌IL-1β的pLenti6/V5-proIL-1β和pLenti6/V5-epoIL-1β慢病毒表达载体。利用三质粒包装体系在HEK293T细胞中包装生产慢病毒,随后感染HepG2肝癌细胞,双抗体夹心ELISA和Western blot法检测细胞质和培养上清中IL-1β的表达水平。结果构建了含有人IL-1β全长基因和含有EPO信号肽与IL-1β成熟蛋白融合基因的pLenti6/V5-proIL-1β和pLenti6/V5-epoIL-1β慢病毒载体,经双酶切和DNA测序证实与基因库中登录的人IL-1β以及EPO信号肽序列一致。利用三质粒系统包装制备经不同途径表达IL-1β的慢病毒,研究证实经由2条不同途径分泌表达人IL-1β的慢病毒感染HepG2细胞后,与转染空载体的对照细胞相比,细胞培养液上清和胞质中IL-1β的水平均显著升高(P0.01),其中HepG2/epoIL-1β细胞培养液上清中成熟蛋白IL-1β的水平明显高于HepG2/proIL-1β细胞,而胞质中总IL-1β的水平HepG2/proIL-1β高于HepG2/epoIL-1β。结论构建的带有EPO信号肽序列的IL-1β基因的慢病毒载体,在HepG2细胞表达后,分泌成熟IL-1β的水平明显高于非经典途径分泌的表达载体。     

MICA在NK细胞杀伤胰腺癌PANC-1细胞中的作用

探讨MHC I类链相关分子A(MHC class I chain-related A,MICA)在NK细胞杀伤胰腺癌PANC-1细胞中的作用。应用NK细胞分选试剂盒从外周血中分选高纯度NK细胞用于实验,体外培养PANC-1细胞和NK细胞,应用抗体封闭法,观察NKG2D与膜型MICA识别在NK细胞杀伤PANC-1细胞中的作用。将健康志愿者NK细胞在含有sMICA阳性胰腺癌患者血清的培基液中培养,观察NK细胞对PANC-1细胞的杀伤作用。经MICA或NKG2D抗体封闭后,NK细胞的杀瘤活性较封闭前显著减弱(P0.01)。胰腺癌患者血清sMICA水平显著高于健康志愿者和慢性胰腺炎患者(P0.01),胰腺癌患者血清中的sMICA可以显著降低NK细胞对PANC-1细胞的杀伤活性。NKG2D与膜型MICA识别在NK细胞杀伤人胰腺癌PANC-1细胞中起重要作用;sMICA是造成胰腺癌免疫逃逸的重要分子机制之一。     

层粘连蛋白反义RNA对TGFβ1调节五种细胞内信号分子？…

目的 明确转化生长因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ,β１ＴＧＦβ１）对大肠癌细胞Ｅ－钙粘着蛋白,α－,β－,γ－连环蛋白及粘着斑激酶（ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｋｉｎａｓｅ,ＦＡＫ）的影响,明确层粘连蛋白（ｌａｍｉｎｉｎ,ＬＭ）反义ＲＮＡ对上述表达的调节作用。方法 采用免疫抑迹技术检测各蛋白的表达水平,采用增强的化学发光技术显示结果。