腺病毒介导血管内皮抑素基因转染肺癌细胞后的表达

目的:观察重组腺病毒介导的血管内皮抑素基因在体外转染A549细胞后的表达。方法:以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将血管内皮抑素基因导入肺癌A549细胞,以免疫组织化学法、Western印迹法和ELISA法检测内皮抑素在A549细胞中的表达。结果:免疫组化染色、ELISA法和Western印迹法检测:A549细胞中内皮抑素蛋白表达阳性,Ad.Null组及PBS组内皮抑素蛋白未见有表达。结论:Ad.Endostatin转染A549细胞可表达具有生物学活性的内皮抑素。     

重组人内皮抑素提取方法的优化及其对膀胱癌的抑制作用

目的 摸索重组人内皮抑素(rhES)蛋白的最佳表达条件.探索内皮抑素(Es)对膀胱癌实体肿瘤及细胞系的抑制作用.方法 分别从不同异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、加IPTG 时机、表达时间等几个方面对 rhES 的蛋白表达条件进行摸索和优化.活性检测:(1)动物实验:观察内皮抑素对裸鼠皮下移植瘤的生长情况的影响.(2)细胞实验:MTT法、肿瘤细胞生长曲线观察内皮抑素对T-24膀胱癌细胞系的作用.结果 rhES 在大肠杆菌中的表达量占总菌体蛋白的58.65%,纯化后的蛋白纯度为96.22%.动物实验:rhES的抑瘤率为66.8%.细胞实验:MTT实验中rhES的半数抑制浓度IC_(50)=22μg/ml;肿瘤细胞生长曲线表明第7天时rhES组的细胞数比对照组减少了58.75%.结论 本实验所优化的最佳表达条件可获得高表达、高活性的rh Es蛋白,Es不但对裸鼠接种的膀胱癌有抑制作用,对膀胱癌细胞系也有抑制作用.     

人内皮抑素cDNA克隆和初步表达

目的：克隆人内皮抑素基因,获得初步表达产物,为进一步研究打下基础,方法：用RT－PCR方法从中国汉族人正常肝组织扩增出内皮抑素cDNA,T／A插入puCm-T载体,测序,,再插入表达载体pKPL-3a,转化大肠杆菌POP2136,42度诱导表达,SDS－PAGE分析表达蛋白,结果：中国人内皮抑素cDNA开放阅读框架全长552bp,编码184个氨基酸,其85位谷氨酸和98位天冬氨酸密码子的第三位碱基出现改变,但编码的氨基酸不变,结论：构建了中国人内皮抑素的克隆载体和表达载体,初步表达了约20kD人重组内皮抑素。     

含小鼠分泌型内皮抑素基因重组质粒的构建及表达

目的:克隆小鼠分泌型内皮抑素(sEndostatin)cDNA,构建pCMV-分泌型内皮抑素和pEgr-分泌型内皮抑素重组质粒,检测重组质粒在B16细胞中的表达. 方法:用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出内皮抑素cDNA,经测序证实后,连入信号肽,构建pCMV-分泌型内皮抑素和pEgr-分泌型内皮抑素重组质粒,以脂质体转染小鼠B16细胞,用Western blot方法检测B16细胞上清中内皮抑素的表达.结果:测序表明扩增的分泌型内皮抑素序列与报道完全一致, Egr-1启动子和分泌型内皮抑素cDNA正确插入表达载体pcDNA3.1,Western blot证实转染B16细胞上清中有目的蛋白表达.结论:小鼠内皮抑素基因成功地被克隆和表达,为今后检测pEgr-分泌型内皮抑素的辐射诱导表达和恶性肿瘤的基因-放射治疗奠定基础.     

基因转染内皮抑素与阿霉素协同作用对小鼠肝癌细胞的影响

目的 探讨内皮抑素作为一种抑制血管生成的蛋白,能否与阿霉素协同作用治疗肝细胞癌(HCC).方法 构建内皮抑素表达质粒和在BALB/c裸鼠皮下建立HepG2人肝细胞肝癌动物模型,用阿霉素和生长抑素表达质粒基因转染治疗.结果 构建的内皮抑素表达质粒在体内、外均可稳定表达.内皮抑素蛋白与阿霉素协同抑制肿瘤和血管内皮细胞的增殖.内皮抑素基因治疗及阿霉素均可抑制裸鼠皮下肿瘤的生长及新生血管的生成,并且呈现协同作用.内皮抑素基因转染下调了缺氧诱导因子(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达,而阿霉素仅能下调VEGF的表达.内皮抑素及阿霉素协同下调VEGF的表达.结论 内皮抑素及阿霉素联合作用对抑制HCC治疗有确切效果,内皮抑素可提高阿霉素对肝癌细胞生长的抑制.     

抗肿瘤的人重组内皮抑素基因的克隆及表达

目的 克隆抗肿瘤因子内皮抑素基因并表达内皮抑素蛋白重组人内皮抑素(human endosbtatin,HES)。方法 从人胎盘组织中分离总RNA,用RT-PCR法扩增出570bp的DNA片段,经序列测定证实为内皮抑素基因,并成功地克隆到pUC18质粒载体中,用Xpress系统体外表达出内皮抑素蛋白并纯化成功。结果 克隆的HEScDNA其序列和国外报道一致;构建了重组HES融合蛋白表达菌株,经SDS-PAGE等分析,表达目的蛋白达细菌总蛋白的40％以上。结论 通过HES基因克隆和表达的研究与探讨,得到了HES的基因克隆和高效表达菌株,为内皮抑素在临床治疗恶性肿瘤奠定了基础。     

提高重组抗菌蛋白BPI23在E.coli中表达水平和复性率的研究

目的:提高重组抗菌蛋白BPI23在E.coli DH 5α中的表达水平及提纯后蛋白的复性率.方法:通过降低目的基因5′端序列中GC含量和构建双拷贝重组表达载体pBV220-(synBPI600)2,减少低频密码子数目和增加目的基因拷贝数,并采用不同复性方法对提纯后的蛋白进行复性.结果:降低目的基因5′端序列中GC含量后,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的14.3%;单双拷贝重组表达载体转化E.coli DH 5α后,目的蛋白的表达水平无明显差异;在复性液中加入PEG4000后,目的蛋白产生聚集沉淀较少.结论:减少目的基因中GC含量可显著提高BPI23的表达水平,增加表达载体中目的基因的拷贝数对其表达水平无影响,在蛋白复性液中加入PEG4000可明显抑制蛋白聚集沉淀.     

重组人血管内皮抑素抗人乳腺癌 MCF -7细胞作用机制研究

目的 研究国产重组人血管内皮抑素在体外对人乳腺癌MCF -7细胞增殖抑制、细胞周期及HIF -1α蛋白表达的影响.方法 应用MTT法检测重组人血管内皮抑素对人乳腺癌MCF -7细胞的生长抑制率、FCM法分析细胞周期变化状况、ELISA法检测处理前后细胞中HIF -1α蛋白表达量.结果重组人血管内皮抑素作用于MCF -7...     

用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素的方法研究

目的探索用硫氧还蛋白融合表达系统表达小鼠内皮抑素(endostatin)重组蛋白的最佳生产工艺路线.方法用pThioHis-endo重组质粒转化不同的大肠杆菌BL21、JM109、DH5α,经几种不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthio-galactoside,IPTG)诱导表达重组融合蛋白,或诱导表达不同时间后,采用SDS-PAGE分析表达产物;按所优化的条件进行重组内皮抑素的表达、包涵体的提取、洗涤、变性和复性,最后经Ni 柱纯化,再通过SDS-PAGE分析纯化的结果.结果3种大肠杆菌表达效果相差无几,最佳IPTG的浓度0.9 mmol/L,最佳诱导时间为5 h,经Ni 柱纯化后可获得可溶性的重组内皮抑素.结论利用本实验的优化条件可获得高产量、高纯度、可溶性的小鼠内皮抑素重组蛋白.     

内皮抑素对人肺腺癌A_(549)细胞周期的影响研究

目的:研究内皮抑素对人肺腺癌A549细胞增殖及周期的影响。方法:设计空白对照组及不同浓度的内皮抑素溶液作用于A549细胞,MTT比色法测定A549细胞生长的抑制率;流式细胞仪分析A549细胞增殖周期的变化。结果:内皮抑素对A549细胞具有生长抑制作用,其抑制作用呈浓度依赖性,其抑制率随药物浓度升高而增加,25μg/L时达到76.7%,实验组与对照组之间差异有统计学意义,P<0.05;内皮抑素对A549细胞具有细胞周期阻滞作用,可将其阻滞于G2/M期和S期。结论:内皮抑素对人肺腺癌A549细胞的增值生长具有显著的抑制作用;并可使A549细胞增值周期停滞于G2/M期和S期,从而阻止细胞进一步增殖。     

乙醇对心肌梗死大鼠冠脉血管新生的影响

 目的  探讨乙醇对大鼠急性心肌梗死后冠脉侧支循环形成的影响及其机制。方法  取雄性SD大鼠随机分成4组:假手术组,空白对照组,小剂量乙醇组(50%乙醇,0.5 g·kg-1·d-1)及大剂量乙醇组(50%乙醇,5 g·kg-1·d-1)。制作心肌梗死模型,每组各8只,于术后第3天处死,留取梗死边缘区存活心肌,采用免疫组织化学SP法检测梗死边缘区心肌内微血管密度(microvascular density,MVD),ELISA法测定血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及内皮抑素水平。通过方差分析研究各组间MVD及VEGF、内皮抑素表达水平有无差异。结果  与假手术组相比,空白对照组MVD明显增加(P<0.05),VEGF、内皮抑素水平明显升高(P<0.05);小剂量乙醇组MVD较空白对照组明显增加(P<0.01),VEGF明显升高(P<0.05),内皮抑素浓度明显降低(P<0.05);而大剂量乙醇组MVD则明显减少(P<0.01),VEGF水平与空白对照组相比差异无统计学意义,而内皮抑素明显升高(P<0.05)。结论  乙醇能够改变心肌梗死后缺血心肌内VEGF和内皮抑素的表达,少量乙醇摄入可以通过增加VEGF的表达促进缺血心肌内的血管新生过程,而大量乙醇摄入则提高内皮抑素的表达而抑制缺血心肌的血管新生过程。     

血管内皮抑素基因转染人脐带血CD34+造血干细胞的实验研究

目的：探讨人血管内皮抑素(内抑素)基因转染人脐带血CD34^ 造血干细胞的方法及检测。方法：用逆转录病毒载体pLNCX，将人内抑素基因导人人脐带血CD34^ 造血干细胞。应用PCR及Western bolt方法检测人内抑素基因的转染和表达。结果：PCR证实，转染内抑素基因的人脐带血CD34^ 造血干细胞基因组中有550bp人内抑素特异性片段，Western bolt分析示人内抑素基因在转染细胞中获得稳定表达和分泌。结论：人内抑素基因可转染到人脐带血造血干细胞中并稳定表达。     

外源性VEGF对鼠脊髓缺血再灌注后内皮抑素和脑源性神经营养因子及其受体的影响

目的探讨重组鼠血管内皮生长因子（rrVEGF¹⁶⁵）对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后血清中内皮抑素（ES），脑源性神经营养因子（BDNF）及脊髓组织中相应受体酪氨酸激酶B（TrkB）表达的影响。方法将Wistar大鼠48只随机分为假手术组（S组，n=8），模型组（M组，n=24）和治疗组（V组，n=16）。腹主动脉阻断90min后再开放建立脊髓缺血再灌注模型。HE染色观察脊髓组织病理学变化，ELISA法检测血清ES和BDNF水平，RT PCR法检测组织中TrkB受体mRNA表达水平。结果与模型组相比，再灌注后治疗组的病理状况得到明显改善。血清学检查以假手术组为对照值。ES水平：M组再灌注后6h开始升高（P＜0.05）并持续至7d达高峰（P＜0.01）；V组虽再灌注6?h也有升高（P＜0.05），但7d时基本维持该水平，没有进一步升高。BDNF水平：M组再灌注6h降低（P＜0.01），2?d回升至对照水平；随后再度下降，7d时降至最低，仅为对照水平的59.1%（P＜0.01）,且明显低于再灌注6h（P＜0.01）；V组再灌注6?h明显升高（P＜0.01），7d时恢复至对照水平。TrkB受体mRNA表达：M组再灌注6h有所上调但2d时回调至对照水平，并于随后继续下调,至7d时表达最低；V组则于6h、7d均保持高表达（P＜0.01），并显著高于模型组（P＜0.01）。结论外源性rrVEGF¹⁶⁵能显著降低大鼠脊髓缺血再灌注后血清ES的升高，减轻BDNF的降低，促进BDNF受体TrkB mRNA的高表达，改善缺血再灌注后的脊髓病理损伤。     

内皮抑素基因治疗子宫内膜异位症裸鼠模型异位病灶中Bcl-2、PCNA的表达

目的：探讨内皮抑素基因治疗子宫内膜异位症裸鼠模型异位病灶中B细胞淋巴瘤，白血病-2（Bcl-21蛋白和增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白的表达。方法：将成模的子宫内膜异位症裸鼠模型60只随机分成3组：内皮抑素组（n=20）、空病毒组（n=20）、PBS组（n=20），应用免疫组化法检测裸鼠模型异位病灶中Bcl-2和PCNA的表达。结果：3组中的腺体均萎缩，但是内皮抑素组的腺体萎缩及血管减少较空病毒组和PBS组明显。给予治疗后，Bcl-2和PCNA均在腺体中表达，Bcl-2在内皮抑素组的阳性表达率明显低于在空病毒组的阳性表达率及在PBS组的阳性表达率，有显著性差异（P〈0．05），Bcl-2在空病毒组与PBS组的阳性表达率无差异（P〉0．05）；PCNA在内皮抑素组的阳性表达率明显低于在空病毒组的阳性表达率及在PBS组的阳性表达率，有显著性差异（P〈0．05），PCNA在空病毒组与PBS组的阳性表达率无差异（P〉0．05）。结论：内皮抑素能够治疗子宫内膜异位症。     

内皮抑素在肺癌患者血清中的表达

目的:研究肺癌患者外周血清中内皮抑素的含量与肺癌临床和病理生理特征的关系。方法:采用ELISA法检测70例原发肺癌与20例健康人血清中内皮抑素的含量。结果:血清内皮抑素含量在肺癌及健康人分别为(105.14±32.59)ng·ml-1和(55.56±19.78)ng·ml-1,P<0.01;血清内皮抑素含量与肺癌原发肿瘤的大小、有无远处转移、细胞分化程度及临床分期密切相关(P<0.05),与性别、年龄、组织学类型及淋巴结转移无显著相关。结论:肺癌患者血清中内皮抑素的表达水平是预测肿瘤恶性行为的有效指标。     

肺癌患者血清内皮抑素水平对肺癌早期诊断价值的研究

目的探讨肺癌患者不同临床分期、组织学类型血清内皮抑素的水平以及化疗前后其水平的变化,从而判断血清内皮抑素水平对肺癌的早期诊断和预后的价值。方法对40例肺癌患者、20例良性肺病患者和20例正常人用ELISA方法检测血清内皮抑素。对不同临床分期、病理类型及化疗前后血清内皮抑素的水平进行分析。结果(1)肺癌组血清内皮抑素水平(10．71±9．99)ng／ml高于良性肺病组(4．79±1．23)ng／ml和正常对照组(4．51±1．14)ng／ml,差异有统计学意义(P<0．01);(2)Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者血清内皮抑素的水平高于Ⅲ期,差异有统计学意义(P<0．05)。(3)肺癌患者不同病理类型血清内皮抑素水平的比较差异无统计学意义。(4)肺癌患者化疗后血清内皮抑素水平明显高于化疗前,差异有统计学意义(P<0．05)。结论(1)血清内皮抑素可能成为肺癌早期诊断的参考指标;(2)血清内皮抑素水平的动态变化可作为化疗疗效观察和预后的评价指标。     

口腔鳞癌组织中Endostatin表达与血管生成的关系

目的:探讨内皮抑素(Endostatin)在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)中的表达及其与血管生成的关系。方法:采用免疫组化法对50例OSCC肿瘤组织、22例正常口腔粘膜组织进行Endostatin、CD34免疫组化染色。检测OSCC组和正常口腔粘膜组中Endostatin的表达和微血管密度(MVD),并分析Endostatin表达与MVD之间,以及它们与OSCC临床病理特征之间的关系。结果:在正常口腔粘膜组与OSCC组中,Endostatin阳性表达率的差异有统计学意义(P<0.05),Endostatin在OSCC中的表达与临床分期、分化程度、有无淋巴结转移无关(P>0.05);OSCC中Endostatin表达与MVD无相关关系(P>0.05)。结论:OSCC的侵袭性可能与Endostatin表达下调有关。