应用多重PCR法鉴定蚊胃血血源的研揪

目的建立多重PCR法鉴定蚊胃血来源。方法依据常见蚊吸血对象(人、牛、猪和犬)的线粒体DNA细胞色素b序列的差异,设计种特异引物,建立多重PCR法,并应用该法检测现场按蚊标本。结果应用多重PCR法共检测249只按蚊,血源来自牛和猪的共91只和63只,未检出吸人血按蚊。立即处死并干燥保存的现场按蚊标本检测成功率最高,为92.50%。结论多重PCR法鉴定蚊胃血血源快速、灵敏,结果客观、可靠。     

聚合酶链式反应(PCR)扩增基因鉴定蚊胃血血源

目的探寻鉴定蚊胃血来源的实验室快速检测方法。方法对抗人血红蛋白胶体金试纸条(简称试纸条)检测有人血成分的按蚊干血痕标本,依据常见蚊吸血对象(人、牛、猪)的DNA序列的差异,设计特异DNA基因引物,运用聚合酶链式反应(PCR)方法对按蚊胃内干血痕标本进行DNA基因扩增,1.5%琼脂糖电泳检测扩增产物,并对扩增产物进行序列测定后查询其同源性匹配。结果试纸条共检测87只按蚊,血源来自牛和猪的共83只,检出仅含人血痕4份。该4份人血痕蚊标本经PCR扩增检测和基因序列匹配查询,与人基因序列同源性为100%,而无牛和猪基因。结论PCR法鉴定蚊胃血血源快速、灵敏、特异。     

应用多重PCR法分析西藏察隅疟疾流行区按蚊吸血习性

目的用多重PCR法分析西藏疟疾流行区察隅县常见按蚊的吸血习性,为下一步研究传疟媒介提供参考。方法2011年7~8月选择察隅县不同生态环境的3个自然村(日玛村、塔玛村和京都村),每个村在人房和畜舍选择8个点,采用诱蚊灯全通宵(20∶00至次日08∶00)诱捕法捕捉按蚊,次日清晨收集诱捕的蚊虫,经形态学鉴定蚊种,分析按蚊组成。收集饱血按蚊,分别提取单只蚊胃血的DNA,采用基于不同动物mtDNA-cytb序列差异的多重PCR法鉴定各蚊胃血源,计算人血指数,分析按蚊的吸血习性。结果共捕获按蚊1 442只,经形态学鉴定,多斑按蚊种团占99.6%(1 436/1 442),带足按蚊和腹簇按蚊占0.4%(6/1442)。多斑按蚊种团中,伪威氏按蚊占85.5%(1228/1436),威氏按蚊占14.5%(208/1 436)。用多重PCR检测202只多斑按蚊种团(伪威氏按蚊188只和威氏按蚊14只)的饱血蚊胃血,结果显示,伪威氏按蚊兼吸牛/猪血和人血,人血指数为0.35,威氏按蚊吸食猪血和人血,人血指数为0.29。结论西藏察隅县2种常见按蚊(伪威氏按蚊和威氏按蚊)均兼吸人畜血,伪威氏按蚊的人血指数较高。     

醋酸纤维膜微量免疫扩散法鉴定按蚊胃血的实验研究

本文用醋酸纤维膜微量扩散法鉴定按蚊胃血,具有简便、经济和准确等优点。为了解敏感性和特异性,应用醋纤法和沉淀法对2～3期按蚊胃血标本129份作鉴定,其阳性率分别为98.4％和89.9％,对4～5期按蚊胃血标本121份的阳性率分别为93.4％和19.8％,对采自牛、猪房的102价标本,醋纤法全部阳性,沉淀法阳性85份。表明醋纤法的敏感性和特异性高于沉淀性.     

鉴定蚊胃血的一种快速方法

蚊胃血血源的鉴定是虫媒疾病流行病学调查研究的一个重要内容,本文介绍一种可在现场鉴定蚊胃血血源的琼脂扩散试验方法。按照Templis等(1963)方法制备抗下列3组动物的混台免疫血清,Ⅰ组为抗牛、羊、猪等免疫血清,Ⅱ组为抗人、猴、狗、马、鼠、兔等     

直接免疫荧光抗体试验鉴定蚊胃血血源的研究

近年来,国内学者在改进蚊胃血血源鉴定方法方面进行了不少的研究。为探讨直接免疫荧光抗体试验(下称直接法)鉴定蚊胃血血源的效果,而进行此项研究,同时以胃血环状沉淀试验(下称沉淀法)对照比较,研究结果如下。材科与方法一、材料 1.蚊胃血标本:实验室饲养羽化4～6d饥饿24h大劣按蚊叮刺志愿者前臂吸饱血,然后在不同时间制备胃血滤纸标本;于海口市郊人、牛房采集吸饱血的三带喙库蚊制胃血滤纸标本。装入塑料袋,4℃密封保存。     

云南省边境地区景洪市疟疾媒介调查

目的了解云南省边境地区景洪市疟疾重要传播媒介的按蚊种类、生态习性及其疟原虫子孢子感染情况。方法于2015年在景洪市选取1个历史上疟疾流行高发村曼辉龙村为调查点,6-10月每月捕蚊3 d。在调查点东、西、南、北、中5个方位各选择1户人房和畜房,采用灯诱法通宵捕捉按蚊,调查按蚊种群密度;多重PCR检测按蚊胃血,观察其嗜血习性。选择村内和村外各1处采用帐诱法捕捉按蚊,观察按蚊夜间活动规律;采用巢式PCR检测按蚊疟原虫子孢子感染情况。结果共捕获1 286只按蚊,属13种,其中中华按蚊936只(占72.8%),微小按蚊188只(占14.6%),为当地按蚊优势蚊种。按蚊的捕获来源地主要为畜房,占85.6%(1 101只)。125份中华按蚊胃血多重PCR检测结果显示,人血指数为0,猪血指数为100。中华按蚊村内叮人率为0.6只/(人·h),村外的叮人率为0.2只/(人·h),夜间活动高峰期为20∶00-22∶00。101只微小按蚊、 517只中华按蚊和40只多斑按蚊巢式PCR检测,均未发现疟原虫子孢子感染。结论景洪市按蚊媒介种群以中华按蚊为主,其次为微小按蚊。中华按蚊以嗜家畜血为主。捕获的按蚊中未检测到疟原虫子孢子感染。     

中缅边境(西段)传疟媒介的初步调查

目的了解中缅边境(西段)传疟媒介的分布与构成。方法 2008年8～9月,在中缅边境的中国云南省盈江县及其相邻的缅甸昔懂县6个自然村,用诱蚊灯在人房和牛棚共进行20次通宵诱捕。将捕获的蚊虫以传统方法进行形态学鉴定,然后用复合PCR法鉴别微小按蚊、乌头按蚊和杰普按蚊。同时,抽提部分蚊虫标本总基因组DNA,以巢式PCR方法检测蚊体内的疟原虫感染情况。结果共捕获各类蚊虫4 571只,隶属9属50种,其中按蚊属是优势蚊种,占总量的54.32%(2 483/4 571)。人房和牛棚的按蚊蚊种构成差异有统计学意义,其中人房以腹簇按蚊、微小按蚊和中华按蚊为主,而牛棚以腹簇按蚊(223只)、环纹按蚊(184只)、迷走按蚊(131只)和杰普按蚊(129只)为主。对比有牛村和无牛村中人房的蚊种构成发现,有牛村的人房以微小按蚊(260只)和腹簇按蚊(49只)为主,而无牛村人房则以腹簇按蚊(481只)和中华按蚊(124只)为主。巢式PCR检测1 075只按蚊,其中9只检出疟原虫阳性,分别为微小按蚊(7/408)、乌头按蚊(1/125)和伪威氏按蚊(1/101)。经测序鉴定均为恶性疟原虫感染,目的条带长204 bp。结论中缅边境(西段)...     

醋酸纤维膜对流免疫电泳鉴定蚊胃血血源的研究

以醋酸纤维膜作对流免疫电泳,试用于鉴定蚊胃血,经试验选择的工作浓度:抗血清为1:8,抗原1:500,与常用的环状沉淀试验法同时对比鉴定离体刺吸人血或猪血的中华按蚊胃血标本,吸血后4、12及24小时制作的标本,于4℃冰箱贮存6、16及29个月的标本以及现场采集的蚊胃血标本,两法鉴定结果一致,反应特异性相似,初步证明此法可试用于蚊胃血的鉴定。     

海南岛残存微小按蚊调查

微小按蚊仍为海南岛传疟媒介之一。经研究从其形态特征及酯酶同工酶的比较,可分为两个不同类型,即微小按蚊A型和B型。人工感染实验证明两型微小按蚊对间日疟原虫均为易感。我们选择海南岛西南部石碌镇牙营自然村为观察点,在该村的边缘微小按蚊幼虫孳生地附近,建两间茅草实验小屋,采用人、牛为诱饵,从日落开始至日出为止,观察两型微小按蚊的活动情况。在不同场所采集吸血的微小按蚊,经鉴定后制作胃血标本,用醋酸纤维膜对流免疫电泳和环状沉淀法,鉴别两型微小按蚊的胃血血源。 1986年4～6月在牙营村两间实验小屋观察     

PCRRFLP单酶切法鉴别赫坎按蚊复合体的研究

目的建立一种新的赫坎按蚊复合体近缘种按蚊基因鉴别技术,应用于现场按蚊样本的鉴别。方法用分子生物学软件Vector NTI 9.0,对赫坎按蚊复合体的嗜人按蚊、雷氏按蚊、中华按蚊、八代按蚊4个近缘种按蚊rDNA基因的ITS2区段序列进行限制性内切酶酶切位点预测分析,选择特异性内切酶,建立一种能同时鉴别4种近缘种按蚊的聚合酶链反应限制性片段长度多态(PCR RFLP)单酶切法鉴别技术,并对现场捕获的452只按蚊样本进行基因鉴别。结果软件预测赫坎按蚊复合体近缘种4种按蚊的rDNA基因的ITS2区段可被限制性内切酶Dde I切成大小易于区分的不同片段,PCR RFLP单酶切实验结果和软件预测结果完全吻合。4个疟疾流行区捕获的452只按蚊样本经PCR RFLP Dde I单酶切法鉴定有20只嗜人按蚊、6只雷氏按蚊、391只中华按蚊、35只八代按蚊,与形态学鉴别结果符合率为93.4%,与PCR RFLP双酶切法结果符合率为100%。结论新建立的PCR RFLP Dde I单酶切法基因鉴别技术可准确鉴别赫坎按蚊复合体,比传统的形态学鉴别更为简便、可靠,适合用于复合媒介地区的媒介监测。     

非放射性DNA斑点杂交鉴定蚊体内人血

嗜血昆虫的血餐鉴定是流行病学媒介评价的一个重要内容。以往用血清学方法,近年来DNA杂交已广泛用于生物体内异种DNA的鉴定,DNA探针可避免免疫学分析中固有的交叉反应,且能检测室温保存1年以上蚊胃血标本。但同位素~(32)P标记探针的半衰期短,易污染环境,因此,作者用生物素化人DNA探针斑点杂交法来鉴定蚊胃血,以适用于常规野外调查和现场应用。DNA探针为一个1.7kb的HindIII/EcoRI酶切片段,构建自人β-球蛋白基因3’端的Kpn-I重复序列(4.3kb),用Bjo-11-UTP以切口平移法标记该片段。生物素化探针的敏感性和特异性;人和猴、犬、牛、猪、小鼠、山羊6种动物的抗凝血样经裂解缓冲     

琼脂双向扩散法鉴定蚊胃血血源的研究

用琼脂双向扩散技术,以全血清为抗原制备多种巳知抗体血清检测未知抗原鉴定蚊虫胃血。并观察了不同抗血清及抗原浓度、反应时间与反应温度的试验结果,证明环状沉淀试验的敏感性比琼脂扩散法高约2倍,但以1:4抗血清检测≤1:1000的抗原浓度,在24～37℃中反应24小时,其结果与环状沉淀试验相似。按此法与环状沉淀试验同时检测离体刺吸牛血的中华按蚊胃血标本,两法牛血阳性率均为100％,但环状沉淀试验尚出现7.8％的马、羊血阳性反应,而琼脂扩散法则否;同时对比鉴定采集于现场的中华按蚊胃血标本,两法符合率在胃血稀释度1:500及1:1000分别为99.3％及98.6％。琼脂扩散法方法简单,可试用于蚊胃血标本的鉴定。     

应用rDNA ITS2区段基因序列分析对浙江省传疟媒介的鉴定

目的 对浙江省传疟媒介种类进行鉴定，以指导疟疾防治工作。方法 针对媒介按蚊核糖体核酸内转录间隔2（rDNAITS2）区段基因特征，应用PCR基因鉴别技术，对浙江省现场捕捉的按蚊与嗜人按蚊、八代按蚊、中华按蚊、雷氏按蚊实验室标本进行基因鉴别和比较。结果 浙江省现场捕捉的按蚊DNA样本的PCR扩增产物均为250bp，与实验室中华按蚊标本一致。结论 中华按蚊目前仍是浙江省的主要传疟媒介，现场调查未发现嗜人按蚊。     

我国赫坎按蚊种团的分子鉴别及中华按蚊的区系分布研究

目的改进赫坎按蚊种团部分成员种的多重PCR鉴别方法,鉴别赫坎按蚊种团中的中华按蚊,研究我国中华按蚊的区系分布及其影响因素。方法依据赫坎按蚊种团成员种中华按蚊、八代按蚊、雷氏按蚊、比伦按蚊和克莱按蚊的核糖体DNA内转录间隔区2 (rDNA-ITS2)序列差异设计种特异引物,改进多重PCR分子鉴别方法。2013-2018年,在我国8个省(直辖市、自治区)共18个地点,以诱虫灯和人工吸取相结合的方法采集按蚊,依据形态特征初步鉴定为赫坎按蚊种团的成员种。提取单只蚊虫基因组DNA,使用改进的多重PCR方法鉴定种类。对多重PCR法无扩增产物的个体分析rDNA-ITS2序列,在GenBank上进行BLAST比对,确定其种类。查找我国以及韩国和俄罗斯远东地区用分子特征鉴别为中华按蚊的文献,结合本研究结果,汇总中华按蚊采集地的地理位置和气候数据,使用地理探测器模型计算影响决定力q值,分析经度、纬度、年平均气温和年平均降雨量对中华按蚊分布的影响。结果改进的多重PCR法一次扩增即可依据扩增片段大小鉴别赫坎按蚊种团的5个成员种:中华按蚊(490 bp)、雷氏按蚊(313 bp)、八代按蚊(216 bp)、克莱按蚊(386 bp)和比伦按蚊(165 bp)。在我国18个采集点共捕获赫坎按蚊种团按蚊365只,多重PCR鉴别为中华按蚊114只(来自陕西、安徽与山东的采集点)、八代按蚊34只、雷氏按蚊9只、克莱按蚊181只和比伦按蚊5只。22只多重PCR无扩增产物的蚊虫中,经rDNA-ITS2序列分析鉴定为贵阳按蚊2只、类中华按蚊1只、朝鲜按蚊8只、林氏按蚊7只和帕氏按蚊4只。获取用分子特征鉴别为中华按蚊的文献17篇,共汇总了101个采集地信息,其中有中华按蚊分布的采集点80个,无中华按蚊分布的21个地点。地理探测器软件计算获得的q值,从大到小依次为0.592 0(年平均气温)、0.507 2 (纬度)、0.351 2 (经度)和0.214 4 (年平均降雨量)。中华按蚊的分布与年平均气温关系最为密切,其次是纬度。综合分析分布地的纬度和年平均温度等结果显示,年平均气温10℃可以作为划分中华按蚊在我国分布北界线的依据。我国中华按蚊的分布范围包括云南、贵州、重庆、河南、山东、天津、江苏、安徽、湖北、浙江、上海、福建、江西、广西、广东、海南等省(直辖市、自治区)及台湾、香港、澳门特别行政区的全境,以及西藏、四川、甘肃、陕西、山西、河北、北京、辽宁等省(直辖市、自治区)的南部部分地区。结论改进的赫坎按蚊种团多重PCR分子鉴定方法快速简单、客观可靠。综合分析显示划分中华按蚊在我国分布北界线的依据是年平均气温10℃线,中华按蚊在我国的分布应小于之前记载的范围。     

巢氏PCR判定西藏疟疾流行区传疟媒介

目的确定西藏墨脱县疟疾流行区的疟疾传播媒介。方法根据2005、2006和2007年疟疾发病情况,在墨脱县选择了3个疟疾发病较高的自然村,采用人诱、牛诱、灯诱及清晨人房全捕等方法捕获成蚊,经形态学鉴定后麻醉处死,密封干燥,带回实验室-20℃冻存备用,采用混合样本法随机抽取10只多斑按蚊复合体为一份混合标本,提取蚊虫DNA。根据文献采用巢氏PCR扩增疟原虫小亚单位核糖体脱氧核糖核酸(SSUrDNA),并对阳性结果克隆测序,比对证实。结果共捕获按蚊5345只,其中多斑按蚊复合体5190只,带足按蚊155只,提取的360份多斑按蚊复合体混合样本DNA中发现子孢子阳性扩增样品2份,种型鉴定2份阳性混合样本均为伪威氏按蚊,PCR产物经克隆测序,NCBIBLAST同源性比对证实为疟原虫SSurDNA基因片段。结论多斑按蚊复合体中的伪威氏按蚊为西藏林芝疟疾流行区的传疟媒介。     

PCR检测蚊体内恶性疟原虫子孢子方法的建立

为建立能检测蚊体内恶性疟原虫的聚合酶链反应技术 ,根据恶性疟原虫 CSP基因序列 ,设计合成 1对引物 ,以 Chelex- 10 0煮沸法制备 DNA模板 ,采用 PCR方法 ,恶性疟原虫子孢子模板预期被扩增出 2 45 bp的 DNA条带 ,并将该法与蚊虫解剖镜检子孢子方法相比较。结果经人工感染恶性疟原虫的 31只大劣按蚊中 14只 PCR阳性 ,被扩增出预期大小的 DNA片段 ,其余 17只 PCR阴性 ;以该技术检测野外捕捉的 98只按蚊 ,结果均为阴性。 PCR法与解剖镜检法相比较 ,检测结果完全符合 ;相当于 1/ 10个阳性蚊子的模板即可满足 PCR检测。该检测体系灵敏、特异 ,对于蚊体内恶性疟原虫的检测具有一定的应用价值     

西藏林芝地区墨脱县传疟媒介调查研究

目的 调查西藏林芝地区墨脱县传疟媒介,为制定针对性防制措施提供依据。 方法 2007年7～8月在墨脱县选择3个疟疾发病率较高的自然村,采用通宵/半通宵室内、外人/牛饵帐诱捕法、通宵人/牛房诱蚊灯诱捕法和清晨人房搜捕法捕蚊,对捕获的按蚊进行形态学鉴定,并进行种群组成、密度、叮人率、吸血习性、栖息习性和经产蚊比率等观察;在不同的水体捞取按蚊幼虫,进行蚊种鉴定,调查按蚊幼虫孳生环境。 结果 共捕获按蚊5 345只,经形态鉴定,只发现伪威氏按蚊、威氏按蚊和带足按蚊等3种,其中伪威氏按蚊占94.71%（5 062/5 345）,威氏按蚊与带足按蚊分别为2.39%（128/5 345）和2.90%（155/5 345）。伪威氏按蚊室内和室外的半通宵诱捕平均密度分别为17只/人和105只/人;全通宵室内和室外的人饵帐诱平均叮人率分别为15.80只/（人·夜）（79/5）和326.22只/（人·夜）（1 468/4.5）;全通宵室外人、牛饵诱捕及人、牛房诱蚊灯灯诱,伪威氏按蚊趋吸人血与牛血的比率分别为30.51%（714/2 340）和69.49%（1 626/2 340）及32.02%（57/178）和67.98%（121/178）,表明伪威氏按蚊偏吸牛血并兼吸人血;清晨人房搜捕,共捕获伪威氏按蚊7只,均为胃血未消化的饱血蚊;共捞获按蚊幼虫106条,其中伪威氏按蚊和威氏按蚊幼虫62条,带足按蚊幼虫44条,按蚊幼虫孳生的水体类型仅限于稻田。 结论 伪威氏按蚊具备在当地传播疟疾的媒介生物学条件。     

疟疾蚊媒监测多重PCR方法的建立

目的 建立疟疾消除后高效的蚊媒监测多重PCR方法。方法 设计疟原虫属、人血、中华按蚊和蚊通用4对特异性引物,与通用引物（5′-CGAGTCCTGCGGTCTCAAATT-3′）连接后,形成4对嵌合特异性引物。常规PCR确定各引物对的最佳退火温度和引物工作浓度,多重PCR优化4对引物混合后的最佳反应条件,引入模拟风险感染阳性蚊虫样品,建立敏感的多重PCR反应体系。检测4种疟疾（间日疟、卵形疟、恶性疟、三日疟）患者全血样品的原虫密度梯度稀释样品的各基因扩增情况,评估检测灵敏度。用溶组织内阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫、田鼠巴贝虫、杜氏利什曼原虫、刚地弓形虫、日本血吸虫尾蚴、卫氏并殖吸虫、蛔虫、牛带绦虫、猪带绦虫等11种其他寄生虫虫体DNA或感染样品评价该方法的检测特异性。用畜圈周围采集的野生中华按蚊样品,评价所建PCR方法的应用效果。结果优化后的多重PCR反应体系各组分含量（体积比）为：DNA模板10%、引物Mix10%、三蒸水30%, Taq酶预混液50%。引物Mix中,蚊通用、按蚊、人血和疟原虫引物的用量配比为1∶1.75∶3∶5。反应体系的最佳循环条件为：95℃5 min; 94℃...     

rDNA ITS2区段基因序列分析技术用于江苏省疟疾疫情不稳定地区传疟媒介的鉴定

目的了解江苏省近年来疟疾疫情回升地区媒介按蚊种类。方法采用rDNA ITS2区段基因序列分析技术，对半通宵室外人饵诱捕法和清晨蚊帐内捕蚊法捕获的现场按蚊进行蚊种鉴定。结果经形态学鉴定和PCR基因扩增，并与实验室模式种中华按蚊、嗜人按蚊、八代按蚊、雷氏按蚊DNA基因比较，现场捕获的按蚊均为中华按蚊。结论中华按蚊仍是目前江苏省疟疾疫情回升地区的主要传疟媒介。