噬菌体展示肽库筛选赭曲霉毒素A模拟表位的研究

目的从噬菌体随机肽库中筛选模拟赭曲霉毒素A表位的噬菌体粒子,并以其替代毒素建立免疫学检测方法。方法以抗赭曲霉毒素A的单克隆抗体为配基,免疫亲和筛选以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ上的随机七肽库,以ELISA方法鉴定阳性克隆,同时进行DNA测序确定插入七肽的氨基酸序列。结果经过4轮淘选,共筛选到11株能与该抗体特异性结合的阳性克隆,且该结合能被赭曲霉毒素A阻断,模拟表位的共有序列为IRPMVXX,X为任意氨基酸。以其中的P2号克隆建立了竞争ELISA检测方法,线性范围为200～8000pgml,检测下限为150pgml。结论噬菌体展示技术可成功筛选到赭曲霉毒素A模拟表位,筛选到的噬菌体粒子可作为毒素的替代品建立免疫学分析方法。     

应用随机肽库筛选展示河豚毒素模拟表位噬菌体

目的利用噬菌体随机肽库筛选展示河豚毒素(TTX)模拟抗原表位的噬菌体,并以其替代毒素建立免疫学检测方法。方法以抗TTX单克隆抗体为靶分子,从以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ表面的随机七肽库中进行生物亲和淘选,用ELISA法鉴定阳性克隆。结果通过4轮淘选,获得了7株能与抗TTX单克隆抗体特异性结合的噬菌体,采用间接竞争ELISA,筛选到3株能抑制TTX的阳性克隆。其中以4号噬菌体建立的免疫检测方法,线性范围为1～20ng/ml(TTX毒素浓度),R2=0.9947,检测下限为1ng/ml。结论从噬菌体七肽库筛选到了展示TTX模拟抗原表位的噬菌体,淘选出来的噬菌体粒子可作为毒素的替代品用于免疫学检测。     

黄曲霉毒素B1抗原模拟表位高效表达

目的 构建黄曲霉毒素B1(AFB1)模拟表位pⅧ噬菌体展示载体,为建立无毒害免疫学检测方法提供依据.方法 构建呈现AFB1抗原模拟表位的噬菌体载体,并引入肠激酶酶切位点,诱导表达,肠激酶处理重组噬菌体颗粒,酶联免疫吸附法鉴定反应原性.结果 重组质粒酶切谱、PCR扩增结果及测序结果均与设计一致,在pC89载体中插入了GACGACGACGACAAGCATCCTAGTGATCCGCGTCATGGG序列,肠激酶处理后的重组噬菌体颗粒可与AFB1抗体特异性结合,吸光度(A)值可达2.112.结论 成功构建了包含肠激酶酶切位点的AFB1抗原模拟表位pⅧ噬菌体表达载体,重组噬菌体颗粒经初步表达有一定反应原性.     

应用噬菌体展示技术筛选氯胺酮模拟表位的研究

目的应用噬菌体展示技术筛选氯胺酮模拟表位,为建立无毒ELISA检测体系提供基础。方法以抗氯胺酮单克隆抗体为配体,在噬菌体七肽库中淘选氯胺酮的模拟表位。经4轮淘选后,选择可与氯胺酮单克隆抗体有不同程度结合的噬菌体,并进一步以间接竞争ELISA确定与盐酸氯胺酮存在竞争抑制的阳性克隆。结果发现10个噬菌体均可与氯胺酮单克隆抗体不同程度的结合;以间接竞争ELISA确定其中5个阳性克隆与盐酸氯胺酮存在竞争抑制现象;5个阳性克隆测序结果表明,获得了4种不同的氨基酸序列。结论初步判断这4个噬菌体展示了氯胺酮模拟抗原表位。     

用噬菌体肽库筛选SARS病原体的模拟抗原表位

目的筛选SARS病原体的模拟抗原表位。方法以混合SARS患者恢复期血清Ig作为筛选分子，从噬菌体肽库中筛选出能与患者血清Ig结合的模拟抗原表位，并研究其抗原特性。结果得到2个能与SARS患者恢复期血清Ig特异性结合的阳性克隆；DNA测序结果显示这2个模拟抗原表位与SARS抗原无同源性。结论用噬菌体肽库成功筛选得到SARS的模拟表位，为开展用SARS模拟抗原表位探索SARS的防治研究创造了条件。     

生殖支原体黏附素蛋白模拟表位的筛选和鉴定

目的制备兔抗重组生殖支原体粘附素蛋白(rMgPa)的多克隆抗体(pAb),以期筛选MgPa的模拟表位。方法用rMgPa免疫新西兰兔以制备兔抗rMgPa的pAb,以此pAb为靶分子对噬菌体展示随机12肽库进行生物淘洗,随机挑取74个噬菌体克隆进行DNA测序与分析,用ELISA检测噬菌体与pAb结合的特异性。结果制备了兔抗rMgPa的特异性pAb,以此抗体为靶分子对噬菌体展示肽库进行生物淘洗后,特异性噬菌体克隆得到了明显富集。经对74个噬菌体克隆所展示的外源性多肽序列进行比较分析,共可大致分为3组一致性的核心序列:P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P,A-K-I/L-T/Q-X-T-L-X-L和K-S-L-S-R-X-D-X-I。ELISA结果说明36个噬菌体克隆能与pAb发生特异性结合,因此,这三组核心序列可能是MgPa的模拟表位。结论成功制备了兔抗rMg-Pa的pAb,并筛选到MgPa的3个可能的模拟表位,为进一步研究Mg的诊断与预防提供一定的实验依据。     

黄曲霉毒素B1分析方法

黄曲霉毒素是常见霉菌—黄曲霉和寄生曲霉中产菌毒株的代谢产物。黄曲霉在自然界的存在较寄生曲霉普遍,此菌能在受到侵染的粮食和油料作物(尤其是玉米和花生)上生长繁殖产生毒素。1060年,英国曾发生了约十万只火鸡幼仔短短几个月内相继死亡的严重事故,后来查明是由于火鸡吃了含有霉变花生饼的饲料引起的,并从霉变的花生饼中分离出黄曲霉产菌毒株,1961年即证实了喂饲含有黄曲霉毒素的花生饼可使大鼠发生原发性肝癌。此后,人们对黄曲霉毒素的种类、理化性质、毒素、致癌性、去毒方法以及与人类肝癌的关系等方面做了大量的研究。     

ELISA间接竞争法检测食品中的黄曲霉毒素B_1

本文介绍了用FLISA间接竞争法测定食品中的黄曲霉毒素B_1(AFB_1)。本法灵敏度为0.01ng/ml。检测玉米、花生、大米中AFB_1的回收率达77.1～91.8%。检测10份样本只需3小时。此外,还可用目测定量。同薄层法(TLC)比较,本法同样具有简便、经济、快速的优点;但其灵敏度高于薄层法,而且特异性高,使用有机溶剂少,可全定量检测。试剂已全部国产化,适于在我国推广应用。     

ELISA间接竞争法检测食品中的黄曲霉毒素B_1

本文介绍了用ELISA间接竞争法测定食品中的黄曲霉毒素B_1(AFB_1)。本法(?)敏度为0.01ng/ml。检测玉米、花生、大米中AFB_1的回收率达77.1～91.8％。检测10份样本只需3小时。此外,还可用目测定量。同薄层法(TLC)比较,本法同样具有简便、经济、快速的优点;但其灵敏度高于薄层法,而且特异性高,使用有机溶剂少,可全定量检测。试剂已全部国产化,适于在我国推广应用。     

随机肽库筛选赭曲霉毒素A模拟表位及其应用

目的从噬菌体随机肽库中筛选模拟赭曲霉毒素A表位的噬菌体粒子,并以其替代毒素建立免疫学检测方法。方法以抗赭曲霉毒素A的单克隆抗体为配基,免疫亲和筛选以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ上的随机七肽库,以ELISA方法鉴定阳性克隆,同时进行DNA测序确定插入七肽的氨基酸序列。结果经过4轮淘选,共筛选到11株能与该抗体特异性结合的阳性克隆,且该结合能被赭曲霉毒素A阴断,模拟表位的共有序列为:异亮氨酸—精氨酸—脯氨酸—蛋氨酸—缬氨酸—X—X,X为任意氨基酸。以其中阻亲和力最强的克隆(P2)建立了竞争ELISA检测方法,线性范围为200~8000pg/ml,检测下限为150pg/ml。结论噬菌体展示技术可成功筛选到赭曲霉毒素A模拟表位,筛选到的噬菌体粒子可作为毒素的替代品建立免疫学分析方法。     

抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体细胞株的建立

本研究建立了抗黄曲霉素素ＡＦＭ１的单克隆抗体细胞株,用ＡＦＭ１－肟＝朱血清白蛋白（ＡＦＭ１－ｏｘｉｍｅ－ＢＳＡ）ＷＪＭ ＢＵ ＴＲ ＱＫＵＭ本研究建立     

用双标记时间分辨荧光免疫法同时检测黄曲霉毒素B_1和赭曲霉毒素A

目的 采用双标记时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术建立同时检测黄曲霉毒素B_1(AFB_1)和赭曲霉毒素A(OTA)的高灵敏分析方法.方法 将AFB_1-HRP、OTA-BSA包被96孔板为固相抗原,与游离AFB_1、OTA共同竞争有限的抗AFB_1多克隆抗体或抗OTA单克隆抗体,以稀土离子Eu~(3+)标记的羊抗兔抗体、Sm~(3+)标记羊抗鼠抗体进行示踪,采用间接竞争免疫分析方法在解离增强荧光免疫分析体系中建立AFB_1/OTA-TRFIA.结果 该方法检测AFB_1的灵敏度为0.02μg/L,测量范围为0.02～100μg/L,批内和批间变异系数(CV)分别为3.2%和7.3%,平均回收率为88.1%;检测OTA的灵敏度为0.05μg/L,测量范围为0.05～5μg/L,批内和批阅CV分别为2.9%和7.9%,平均回收率为89.9%,AFB_1/OTA-TRFIA检测时,AFB_1与OTA不相互干扰.样品经双标记AFB_1/OTA-TRFIA与单标记AFB_1-TRFIA、OTA-TRFIA同时检测,与AFB_1-TRFIA两者检测AFB_1结果的相关系数为0.972,与OTA-TRFIA两者检测OTA结果的相关系数为0.981,说明结果相符.结论 AFB_1/OTA-TRFIA灵敏度高,可测范围宽,稳定性好,一次操作可以同时得到AFB_1、OTA的两个结果.是一种简便、快速、经济的可进行大批量样品筛查的方法.     

抗黄曲霉毒素M1抗体制备及检测方法建立

目的制备针对黄曲霉毒素M1的单克隆抗体并建立针对黄曲霉毒素M1的间接竞争酶联免疫吸附试验检测方法。方法利用B细胞杂交瘤技术。建立能分泌抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，建立间接竞争酶联免疫吸附试验检测方法。结果研制出1株能特异性分泌抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2F2。该单克隆抗体的Ig亚类为IgG1，亲和常数为2．8×10^-11mol／L。该抗体与黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2和黄曲霉毒素M2等结构类似物有微弱的交叉反应，具有较高的特异性。在此基础上建立了间接竞争酶联免疫吸附试验检测方法。该方法的最低检出浓度为0．07ng／ml。校正曲线的线性范围为0．02～2ng／ml，线性方程y=-0．4364x＋0．2693（R^2=0．9949）。方法的加标回收率为72．5％～131．3％。结论制备了具有高特异性和亲和力的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，并建立了快速、灵敏的针对黄曲霉毒素M1的酶联免疫吸附试验检测方法。     

茶叶对黄曲霉毒素B_1-DNA加合物生成的影响

本研究在体外实验条件下,测定了乌龙茶水等12种茶样对黄曲霉毒素 B_1(AFB_1)-DNA加合物生成的影响。结果表明,受试样品在高浓度下均有明显抑制AFB_1-DNA加合物生成的作用,随着浓度下降,抑制作用亦随之降低,有明显的剂量-反应关系。本实验结果提示,茶叶对AFB_1的致癌性可能具有一定的抑制作用。     

生物素—亲和素系统检测食品中黄曲霉毒素B_1的研究

建立了ABC—ELISA检测食品中AFB_1的方法,最小检测值0.01ng/孔,灵敏度比普通ELISA高10倍,检测时间缩短1h。方法灵敏、特异、简便、快速,样品提取液可直接用于测定。对抗体标记生物素的方法、溶剂影响、反应时间等作了较详细的讨论。对3类食品(83份样品)加标回收率为70-100％,变异系数为7.7 17.3％。将本法测得的12个玉米样品中AFB-1值与国家标准检测法测得的值作配对资料的t检验,P>0.05,说明两种方法测得结果间的差异无显著性。     

食品中黄曲霉毒素B_1单克隆抗体酶联免疫测定方法的建立及初步应用

用抗 AFB_1的单克隆抗体 AFB_1-2H8,建立了检测食品(玉米、花生、小麦、大米、植物油)中 AFB_1的 ELISA 间接竞争法。该方法最低检出浓度为0.01ng/g,敏感范围为0.2～50ng/g,平均回收率为83.0%～110.3%,精密度为2.0%～24.3%。用该法测定了分布于淮河以北地区的145份样品,并对25份植物油样品用 TLC 和 ELISA 两种方法进行了对比测定。     

伏马菌素B1免疫学检测方法的建立

目的建立应用单克隆抗体的伏马菌素B1(fumonisin B1,FB1)间接竞争酶联免疫吸附检测方法.方法利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗FB1单克隆抗体,建立FB1间接竞争酶联免疫吸附方法.结果建立稳定分泌抗FB1毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分泌的抗体为IgG1亚类,分子量150KD,腹水稀释度为12.0×108,亲和常数为6.72×109L/mol.FB1间接竞争酶联免疫吸附方法的最低检出浓度为5μg/L,校正曲线的线性范围50～500μg/L,线性方程Y=-0.582X+1.793(r=0.99,P＜0.05);与脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、T-2毒素均无交叉反应.回收率71.89%～112.95%,平均回收率100.23%.结论所建立的检测方法具有快速、简便、灵敏的特点,可满足实际工作需要.