简化HBV-DNA抽提用于多聚酶链式基因扩增

采用异硫氰酸胍、柠檬酸钠、2-巯基乙醇、十二烷基肌氨酸钠作为变性裂解剂,结合水饱和酚、氯仿、异戍醇等进行快速程序式抽提血清HBV-DNA模板用于多聚酶链式(PCR)基因扩增。该提取法比一般方法简单、稳定、不易污染,抽提过程可在lh内完成。PCR应用结果表明敏感性高于地高辛素标记探针斑点杂交法。经酶切及a-~(32)标记放射自显影鉴定PCR产物具有良好的特异性。     

建立检测血清HBV DNA的多聚酶链反应技术

建立检测血清HBV DNA的多聚酶链反应技术。人工合成adr、adw和ayw三个业型HBV的两个共有序列NC1和NC2作为引物扩增一长428bp且含一BglⅡ酶切点的HBV C基因片段。含FD酶的反应体系在水浴93℃30秒、55℃60秒、72℃90秒依序循环30周期,当克隆HBV DNA模板最小加量为10 fg时,产物作琼脂糖凝胶电泳经溴化乙锭染色在紫外线下观察仍可见428 bp位置的阳性荧光带。阳性产物经BgⅠⅡ酶切后分为125 bp和303 bp的两个特异片段。同一条件下的阴性对照则出现阴性结果。这一技术用以检测经常规DNA提取的127例HBsAg阳性血清,结果HBV DNA检出率达88％,其中HBeAg阳性血清HBV DNA检出率为97％,抗HBeAg阳性血清HBV DNA检出率为82％。     

HBV—DNA不同模板制备进行多聚酶链基因扩增

本文采用 4.2mol/L异硫氰酸胍、25mmol/L柠檬酸钠、0.1mol/L2一巯基乙醇,0.5%(W/V)十二烷基肌氨酸钠作为裂解液进行一步法程序式抽提血清标本HBV—DNA模板用于多聚酶链基因扩增.该法与常规DSD抽提法及微量直接法进行比较,具有方法简单、稳定、不易污染且敏感性高.抽提过程可在1个小时内完成,经酶切及a~(32)P标记探针放射自显影鉴定PCR产物具良好特异性,该法尤其适应于大量临床标本的检测,值得推广使用.     

限制性内切酶酶切及限制性内切酶酶切图谱分析

限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)是一类能够识别DNA的特异序列并在识别位点剪切双链DNA的核酸内切酶。主要存在于原核生物中，大多数来自于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制一修饰体系，限制外源DNA、保护内源DNA。1970年Smith等分离到第一种限     

Nested PCR检测HBV DNA技术的建立与应用

本研究建立一种Nested PCR技术检测HBV DNA,即采用内外两对引物分别进行连续两次扩增,使检测极限由一次PCR的10~(-2)Pg提高到10~(-5)Pg;经~(32)P标记寡核苷酸探针作Southern转移杂交以及BgIⅡ作酶切分析证实两次扩增均为特异性扩增。通过抗-HBe阳性、单项抗一HBc阳性和单项抗-HBs阳性三种血清的HBV DNA的检测,表明该方法确能检出标准PCR所不能检出的极低水平的HBV感染,对提高乙型肝炎的诊断水平及更准确地评价药物疗效有重要意义。     

用限制性内切酶分析溶组织内阿米巴的致病性

用SH-3、SH-5、SH-6、SH-7和SH-85株溶组织内阿米巴的DNA增殖35个周期,将其基因DNA用内切酶HinfⅠ和EcoT22Ⅰ进行消化后,作琼脂糖凝胶电泳分析,显示,5株虫株DNA经35个循环周期后产生531-bp的产物;经HinfⅠ消化后,SH-3、SH-5、SH-6和SH-7的基因DNA产生3个相同的片段,而显示其均与非致病性虫株SAW142的电泳谐完全相同;而SH-8基因DNA的电泳谱与致病性虫株SAW408的电泳谱一致,而用EcoT22Ⅰ消化结果也显示SH-8的图谱与致病性虫株SAW408的相同,证实了从包囊携带者和有发热、腹泻而无脓血便患者粪便中分离的虫株均属于非致病性虫株,从有发热、腹泻、脓血便的急性阿米巴痢疾患者粪便中分离到的虫株属于致病性虫株,均与酶株群分析相一致。提示,应用多聚酶链反应和限制性内切酶消化基因DNA来检测溶组织内阿米巴的基因型是十分有意义的。     

以二氧化硅快速提取HBV－DNA用于双阶变温PCR检测

以异硫氰酸胍裂解血清释放核酸使被二氧化硅吸附，经乙醇洗涤后用水悬浮，上清即含纯化ＤＮＡ。结合双阶变温ＰＣＲ建立一种简单快速的血清ＨＢＶ－ＤＮＡ检测方法。该法只需检测１０ｕｌ血清，完成提取和扩增只要３ｈ．操作很易掌握。用之检测５６例ＨＢｓＡｇ＋／ＨＢｅＡｇ＋的血清、４２例ＨＢｓＡｇ＋／ＨＢｅＡｇ－的血清和５４例ＨＢｓＡｇ／ＨＢｅＡｇ的血清，结果ＨＢＶ－ＤＮＡ检出率分别为８６％、５７％和１３％。应用表明这是一种简捷有效的核酸纯化和扩增方法，适于对大量临床样本作检测之用。     

应用错配PCR和限制性片段长度多态性分析技术检测HBV YMDD变异株

目的：建立简便易行的检测乙型肝炎病毒（HBV）多聚酶基因（P基因）上YMDD变异株的方法，评价运用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患对此变异的影响，方法：采用套式／错配聚合酶链反应（PCR）结合限制性片段长度多态性（RFLP）分析技术对108例治疗前HBV DNA（PCR）阳性正在拉米夫定治疗中的慢性乙型肝炎患者的HBV YMDD变异情况进行检测。结果：运用上述技术能有效区分HBV YMDD野生株和变异株，上述108例患者经拉米夫定治疗后，HBV DNA阴转者63例（58．3％），HBV YMDD野生株和变异株分别为23例（21．3％）和22例（20．4％），结论：建立的套式／错配PCR－RFLP分析技术可用于HBV YMDD变异株的临床监测，拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者可导致部分患者的HBV多聚酶基因上YMDD发生变异。     

乙型病毒性肝炎的基因诊断

对１２０例乙肝病毒（ＨＢＶ）感染者血清中ＨＢＶ－ＤＮＡ用ＰＣＲ技术进行检测，结果表明，ＰＣＲ法的敏感性阳性检出率７５．８％，明显高于ＥＬＩＳＡ法（ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ和ＨＢＣＡｂ）的阳性率分别为６１％、３８％和６２％）；ＰＣＲ检测ＨＢｓＡｇ和ＨＢＡｂ一血清的ＨＢＶ－ＤＮＡ，阳性率分别为２６％、５２％和２４％，ＰＣＲ检测三者均为阳性血清的ＨＢＶ－ＤＮＡ，阳性率为１００％慢性迁延肝炎、慢性活动性肝炎     

新生儿与儿童乙肝和丙肝病毒感染及其防治的前瞻性研究

目的 为了评价新生儿和儿童乙肝病毒（ＨＢＶ）和丙肝病毒（ＨＣＶ）感染的现状以及防治水平，为预防儿童病毒性肝炎，提高儿童保健水平提供参考依据。     

雌二醇和地塞米松调节乙型肝炎病毒抗原的表达

对雌二醇和地塞米松调节乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒θ抗原(HBeAg)表达的研究结果表明,10~(-6)mol/L雌二醇和10~(-6) mol/L地塞米松都能增加乙型肝炎病毒-DNA转染人体肝癌细胞株2·2·15细胞分泌HBsAg和HBeAg,雌二醇的作用明显强于地塞米松。未发现该两类激素之间有协同或拮抗作用。作者对乙型肝炎(乙肝)发病与性激素的关系及乙肝疫苗生产途径的设想进行了讨论。     

HBV血清标志物表达形式及其意义

通过对1658份血清7项HBV血清标志物的关系进行研究,共综合成25种血清表达形式。发现HBV—DNA、HBeAg和PHSA具有明显的一致性,各项标志物之间关系密切。提示同时检测多项HBV血清标志物,综合分析,才能准确断定HBV感染状态。     

环介导等温扩增法对乙肝病毒的快速检测和分型

目的针对乙肝病毒(HBV)不同亚型,建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,实现对HBV的快速检测及基因分型。方法分别设计HBV B、C、D三亚型基因组特征序列的LAMP引物,优化反应条件,建立特异灵敏的HBV亚型LAMP检测方法,并与Real-time PCR方法进行临床样本检测结果比对。结果 LAMP法在数十分钟内有效地检测出HBV的B、C、D三亚型;其中,HBV-B亚型的检出限为17拷贝;C亚型的检出限为25拷贝;D亚型的检出限为10拷贝。与Real-time PCR法相比,灵敏度提高1 000倍左右。结论 LAMP法可实现HBV的快速检测及分型,具有高特异度和高灵敏度,可用于临床检测诊断。     

随机引物引导的乙型肝炎病毒DNA探针标记和重复杂交

随机引物引导的探针标记足一种比切中移位更为有效的探针标记方法,作者应用这种方法制备~(32)P标记的乙型肝炎病毒(HBV)DNA探针。经液闪测定,探什比放射性为lxl0~(9)cpm/ug,(32)P掺入率为71.43％,均比切口移位有关参数上限高出数倍。将这种探针用于尼龙膜载样杂交,在每100cm~(2)的样膜所加探针放射性强度为5 x10~(6)cpm、浓度为20ug/L条件下,放射自显影24小时即可出示清晰结果。并且检出HBV DNA灵敏度达0.1Pg,检测HBSAg和HBCAg双阳性血清,HBVDNA阳性率达87％(26/30)。用这种方法还制备地高辛素标记的HBV DNA探针,并在探针浓度为20 ug/L条件下,对~(32)p探针杂交过的样膜重复杂交。结束检出HBV DNA灵敏度为0.05 Pg,检测HBsAg和HBeAg双阳性血清,HBV DNA阳性率为73％(22/30)。上述结果表明随机引物引导标记可用于制备高比放同位素探针和高敏感性非同位索探针。前者对研究微量基因必不可少,后者对基层单位常规开展检测非常重要。     

RNAi靶向抑制HBV复制和HBeAg表达

目的观察靶向HBVC基因区的RNA干扰对HBV复制的抑制作用。方法选择HBV基因组C区的Nt2021-2049作为靶序列,合成相应的正、反义寡核苷酸,退火后形成双链,克隆入shRNA表达质粒,将得到的质粒与HBV质粒共转染HepG2细胞,观察HepG2细胞中HBV的受抑制情况。结果病毒复制及HBeAg的表达明显受到抑制。结论所选靶区通过RNA干扰可有效抑制HBV复制。     

PBMCs中HBV逆转录酶P基因的mRNA表达X基因的整合与肝细胞癌变的关系

目的在外周血单个核细胞(PBMCs)中研究乙型肝炎病毒(HBV)DNA多聚酶/逆转录酶P基因的mRNA表达、X基因的整合与肝细胞癌变的关系。方法设计HBV P基因引物P1、P2,及X基因引物X1、X2。分离HBsAg阳性40例原发性肝癌病人及36例慢性乙肝病人PBMCs,分别提取其基因组总DNA和总RNA,RNA逆转录合成cDNA;PCR检测HBV的X基因整合;RT-PCR方法检测HBV的DNA多聚酶/逆转录酶P基因在PBMCs中的mRNA表达。结果PBMCs中X基因片段的整合率在HCC组为79.5%(31/40),与CH组的整合率50%(18/36)无统计学差异(P>0.05)。P基因的mRNA表达率HCC组为10%(4/40),与CH组表达率33.3%(12/36)有统计学差异(P<0.05)。结论在HCC阶段HBV病毒复制相对静止,大量X基因整合最终导致HCC的发生。     

血痕中GC亚型的检出及其在法医实践中的应用

本文将蒸馏水双重浸泡的方法用于等电聚焦(IEF)前血痕中Gc的提取,分别对不同条件下保存的血痕中Gc可检出时间进行了探讨,检测了-30℃保存半年和室温保存4个月的血痕,其Gc检出率为100%。37℃保存一周的血痕,85%可正确定型。并将Gc系统应用于亲子鉴定和个人识别中。     

血清、白细胞HBV－DNA的PCR检测结果与HBV血清复制标志的关系

３０例慢性乙型肝炎患者中，有５３．３％的病人用ＰＣＲ可从清和白细胞中检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ；ＨＢｅＡｇ阳性和抗－ＮＢｃ－ＩｇＭ阳性的患者１００％可以检出ＨＢＶ－ＤＮＡ，而仅抗－ＨＢｃ－ＩｇＭ阳性的患者ＨＢＶ－ＤＮＡ的检出率为６６．７％。１３例乙肝血清学复制标志阴性的病人中有５例（３８．５％）也可检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ。在ＨＢｓＡｇ转阴的３例病人中有１例可从白细胞中检测出ＨＢＶ－ＤＮＡ。