Notch信号通路在鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡中的作用

目的 探讨Notch信号通路在鱼藤酮诱导PC12细胞凋亡中的作用机制.方法 用鱼藤酮(5 μmol/L)处理PC12细胞,检测PC12细胞的凋亡和Notch信号通路的活化状态.同时以Notch信号抑制剂(2S)-N-N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰-2-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT,10 μmol/L)处理上述PC12细胞,观察Notch信号通路抑制后PC12细胞对鱼藤酮处理的凋亡反应,分析Notch信号通路与鱼藤酮诱导PC12细胞凋亡之间的关系.结果 鱼藤酮显著诱导PC12细胞凋亡[(35.6±5.4)％,P＜0.05]和半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)活性升高(0.52±0.15,P＜0.05),并活化其Notch/Jagged1信号通路.DAPT显著抑制鱼藤酮诱导的Notch/Jagged1信号通路活化并降低PC12细胞凋亡率[(9.8±3.1)％,P＜0.05]和Caspase-3活性(0.16 ±0.06,P＜0.05).结论 Notch信号通路活化是鱼藤酮诱导PC12细胞凋亡的主要机制之一.     

肝癌细胞迁移过程中Notch信号通路的作用效果

目的:探讨Notch信号通路在肝癌细胞迁移过程中的作用及相关机制。方法:体外培养正常非肿瘤肝细胞系HL-7702,肝癌细胞系HepG2、Huh-7。利用Transwell小室检测细胞的迁移能力,Western blot检测Notch、Snail、E-cadherin蛋白的表达。分别采用1μmol/L DAPT、5μmol/L DAPT阻断Notch信号通路,比较不同浓度下对细胞迁移能力的影响以及对肝癌细胞中Snail和E-cadherin蛋白表达的影响。结果:肝癌细胞系的侵袭迁移能力明显高于正常非肿瘤肝细胞(P0.05),肝癌细胞HepG2的侵袭迁移能力稍高于Huh-7,但差异未见统计学意义(P0.05)。采用Western blot蛋白印记方法检测细胞Notch、Snail、E-cadherin的蛋白表达量,肝癌细胞中Notch、Snail的表达高于正常细胞,E-cadherin的表达显著低于正常细胞。采用1μmol/L DAPT和5μmol/L DAPT阻断Notch信号通路,与对照组比较,1μmol/L DAPT和5μmol/L DAPT均能明显下调Snail的表达,上调E-cadherin的表达,且随着浓度的增加作用加强(P0.05)。结论:Notch信号通路在肝癌细胞侵袭迁移过程中发挥着重要作用,初步认为与Snail、E-cadherin的表达有关。     

党参炔苷调节Shh/Gli1信号通路对胃癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化的影响

目的 ：探讨党参炔苷（LOB）调节音猬因子（Shh）/胶质细胞瘤转录因子1(Gli1)信号通路对胃癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化（EMT）的影响。方法：体外培养MKN-45细胞,分为对照组、LOB组（10μmol/L LOB）、SHH特异性激活剂组（PM组,1μmol/L PM）、LOB+PM组（10μmol/L LOB+1μmol/L PM）;CCK-8实验检测MKN-45细胞增殖;划痕试验检测MKN-45细胞迁移;Trans w e ll检测MKN-45细胞侵袭;流式细胞术检测MKN-45细胞凋亡;We s te rn blot检测EMT相关蛋白和Shh、Gli1蛋白表达水平。结果 ：相较于对照组,LOB组吸光度（A450）值、划痕愈合率、细胞侵袭数目及Vim e ntin、Gli1、Shh、N-cadhe rin蛋白表达下降（P<0.05）,细胞凋亡率和E-cadhe rin蛋白表达显著升高（P<0.05）;PM组A450值、划痕愈合率、细胞侵袭数目及Vimentin、Gli1、Shh、N-cadherin蛋白表达增高（P<0.05）,细胞凋亡率和E-cadhe...     

Zeste基因增强子同源物2基因对于人多发性骨髓瘤细胞的影响及其机制

目的研究Zeste基因增强子同源物2(EZH2)在人多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226中的作用和分子机制。方法采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测3株人多发性骨髓瘤细胞和20名多发性骨髓瘤患者骨髓单个核细胞中EZH2的表达水平。以RPMI8226细胞为代表,采用小干扰RNA(siRNA)沉默EZH2基因,蛋白质印迹法(Western blot)检测EZH2沉默后RPMI8226细胞中EZH2的表达水平,RT-qPCR法检测EZH2的mRNA表达水平,确定基因沉默的效果。EZH2沉默组分别设置对照组(Control)、siRNA阴性对照组(siRNA-NC)和EZH2 siRNA组(siRNA-EZH2)。四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期的改变及凋亡水平,Transwell小室法检测细胞侵袭能力,蛋白质印迹法(Western blot)检测凋亡抑制蛋白(Survivin)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3/7(Caspase-3/7)、基质金属蛋白酶-2/9(MMP-2/9)的表达水平。组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),并用Bonferoni校正的t检验进行组间两两比较。结果3株人多发性骨髓瘤细胞中EZH2的表达水平显著高于正常人骨髓细胞(分别为0.38±0.08、0.25±0.05、0.22±0.06和0.12±0.03),而多发性骨髓瘤患者骨髓单个核细胞中EZH2的水平也显著高于正常人骨髓细胞的水平(4.25±0.85比0.15±0.05)。在EZH2沉默的实验中发现siRNA-EZH2组的细胞活力显著低于Control组细胞(0.02±0.01比0.41±0.01)。siRNA-EZH2组细胞S期的比例为(10.22±3.21)%,显著低于Control组细胞[(52.31±3.33)%,t=16.310,P<0.01],差异有统计学意义。siRNA-EZH2组细胞存活率为(49.15±2.11)%,显著低于Control组细胞[(98.22±1.22)%]。siRNA-EZH2组细胞侵袭能力相比Control组显著降低(106.78±5.62比358.63±7.90),且siRNA-EZH2组细胞中Survivin、MMP-2/9的蛋白水平显著低于Control组(分别为0.86±0.12比2.15±0.15、3.61±0.07比1.06±0.02和2.24±0.11比0.47±0.08),Caspase-3/Caspase-7的水平显著高于Control组(分别为2.98±0.03比0.67±0.04和1.96±0.24比0.42±0.02)。结论EZH2在人多发性骨髓瘤中高表达,其作用与增强人多发性骨髓瘤细胞生长、抗凋亡、促侵袭有关。     

自噬在吉西他滨诱导胰腺癌细胞凋亡中的作用

目的:研究自噬在吉西他滨(gemcitabine,Gem)诱导胰腺癌细胞SW1990凋亡中的作用,并以氯喹特异性抑制自噬,以探讨其可能机制。方法:采用CCK8法检测Gem对胰腺癌细胞增殖的影响,并用实时定量PCR检测自噬相关基因LC3的表达,以p62免疫荧光染色检测细胞内自噬泡,通过Western印迹法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin 1的表达,并用AnnexinⅤ/PI流式细胞方法检测Gem诱导后细胞凋亡的变化。进一步通过氯喹抑制自噬,检测自噬抑制前后细胞增殖、自噬及凋亡的变化。结果:Gem对胰腺癌细胞SW1990增殖具有部分抑制作用,Gem作用能迅速激活细胞自噬从而产生耐药。LC3的mRNA表达升高1.4~2.2倍(P<0.05),LC3-Ⅱ蛋白水平升高1.5~2.7倍(P<0.05)。Gem和氯喹联合用药组较Gem单药组细胞凋亡蛋白Caspase-3表达升高,细胞存活率从64.3%±3.1%降低为35.2%±3.4%(P<0.05)。结论:自噬在Gem诱导胰腺癌细胞凋亡的过程中可能起到保护作用,氯喹抑制自噬后可增强Gem的促凋亡作用。     

臭椿酮抑制ENST00000441270/miR-149轴影响结直肠癌细胞增殖和凋亡的实验研究

目的探讨臭椿酮对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响。方法根据检测结果实施分组,采用低(0.2μmol/L)、中(0.4μmol/L)、高剂量(0.6μmol/L)的臭椿酮干预结直肠癌SW1116细胞24 h,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活力,集落形成实验检测克隆形成数,流式细胞术检测细胞凋亡,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测ENST00000441270和微小RNA-149(miR-149)的表达水平。转染ENST00000441270小干扰RNA(si-ENST00000441270)至SW1116细胞,采用上述方法检测干扰ENST00000441270表达对SW1116细胞活力、克隆形成以及凋亡的影响。双荧光素酶报告基因实验验证ENST00000441270与miR-149之间靶向关系。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。结果臭椿酮低剂量组SW1116细胞的活力[(0.84±0.05)比(0.84±0.05),t=0.529,P>0.05]、克隆形成数[(110.00±3.56)个比(111.33±3.86)个,t=0.499,P>0.05]、凋亡率[(7.56±0.80)%比(7.35±0.63)%,t=0.307,P>0.05]、ENST00000441270[(0.98±0.06)比(0.99±0.06),t=0.238,P>0.05]和miR-149[(1.01±0.07)比(0.99±0.07),t=0.303,P>0.05]表达与对照组比较,差异均无统计学意义。臭椿酮中、高剂量组SW1116细胞的活力(0.63±0.04、0.40±0.03比0.84±0.05,t=7.667、12.667,P<0.05]、克隆形成数[(85.67±2.87)个、(58.33±2.62)个比(111.33±3.86)个,t=9.487、24.666,P<0.05]、ENST00000441270表达[(0.69±0.05)、(0.41±0.03)比(0.99±0.06),t=7.138、13.799,P<0.05]低于对照组,差异均有统计学意义,细胞凋亡率[(12.61±0.91)%、(21.66±0.97)%比(7.35±0.63)%,t=7.715、12.036,P<0.05]、miR-149表达[(1.48±0.08)、(1.92±0.10)比(0.99±0.07),t=7.415、14.074,P<0.05]高于对照组,差异均有统计学意义。si-ENST00000441270组SW1116细胞活力[(0.35±0.02)比(0.88±0.05),t=17.047,P<0.05]、克隆形成数[(49.67±2.87)个比(112.67±3.40)个,t=24.525,P<0.05]低于阴性对照(si-NC)组,细胞凋亡率[(22.62±0.82)%比(7.58±0.65)%,t=24.896,P<0.05]高于si-NC组,差异均有统计学意义。miR-149是ENST00000441270的靶基因。结论0.4、0.6μmol/L的臭椿酮能够抑制结直肠癌细胞SW1116增殖,诱导细胞凋亡,其机制可能与抑制ENST00000441270/miR-149分子轴有关。     

Notch信号抑制剂(2S)-N-N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰-2-苯基甘氨酸叔丁酯对肾正常及肿瘤细胞c-myc的影响

目的 观察Notch信号抑制剂(2S)-N-N-(3,5-氟苯乙酰基)-L-丙氨酰-2-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)对肾小管上皮细胞HKC及肾肿瘤细胞786-O中c-myc表达及对细胞增殖的影响.方法 通过实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)及Western blot方法连续3次检测HKC及786-O 中c-myc的表达及DAPT处理后HKC及786-O细胞中c-myc的表达变化,并检测DAPT对细胞增殖及周期的影响.结果 786-O中c-myc表达比HKC高(2.54±0.24)倍(P＜0.01).DAPT处理后,HKC及786-O细胞中c-myc表达分别下调(1.41±0.13)和(2.93±0.26)倍(P均＜0.05);两株细胞的增殖均受到抑制,HKC及786-O G0/G1期细胞比例分别增加9.75％和16.54％(P均＜0.01).结论 Notch信号抑制剂DAPT可能通过抑制c-myc的表达而抑制肾正常及肿瘤细胞的增殖.     

连翘苷调节相关信号通路对地塞米松诱导的成骨细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨连翘苷(phillyrin, PHN)调节磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸激酶(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对地塞米松(dexamethasone, DEX)诱导的成骨细胞自噬和凋亡的影响。方法 将MC3T3-E1细胞分为对照组(NOR组)、DEX组(10μmol/L DEX处理MC3T3-E1细胞)、L-PHN组(5μmol/L PHN处理MC3T3-E1细胞)、M-PHN组(10μmol/L PHN处理MC3T3-E1细胞)、H-PHN组(20μmol/L PHN处理MC3T3-E1细胞)、ZSTK474组(用20μmol/L PHN和2μmol/L的PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂ZSTK474处理MC3T3-E1细胞);MTT法检测细胞毒性和细胞活力;流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡;透射电子显微镜(TEM)观察自噬小体;Western blot法检测MC3T3-E1细胞中自噬、凋亡和PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达;ALP活性及ALP染色检测MC3T3-E1细胞分化能力。结果 0～80μmol/L PHN对...     

p53凋亡刺激蛋白2对饥饿诱导的大肠癌HCT116 p53-/-细胞自噬和凋亡的影响

目的 探讨p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 0f p53,ASPP2)对饥饿诱导的大肠癌HCT116 p53-/-(p53缺失)细胞自噬和凋亡的影响.方法 实验分3组:(1)绿色荧光蛋白腺病毒(green fluorescent protein adenovirus,rAd-GFP)感染组(对照组);(2)自噬抑制剂LY294002处理组;(3) ASPP 2腺病毒(ASPP2 adenovirus,rAd-ASPP2)感染组.无血清培养基分别培养0、24、48 h诱导细胞自噬和凋亡.利用calcein/PI吸收试验观察各组细胞凋亡水平.细胞转染红色荧光蛋白自噬质粒Lc3(cerise fluorescent protein autophagy plasmid Lc3,CFP-Lc3),在荧光显微镜下观察各组细胞自噬水平.结果 rAd-GFP感染组饥饿24h细胞的自噬水平升高显著(0 h:1.04±0.24;24 h:12.17 ±0.86,P＜0.05),而凋亡水平改变差异无统计学意义(0 h:2.01％±0.06％;24 h:3.23％±0.34％,P＞0.05);饥饿时间延长至48 h,自噬水平(0 h:1.04±0.24;48 h:21.09±3.32)和凋亡水平(0h:2.01％±0.06％;48 h:30.20％±3.18％)升高,差异均具有统计学意义(均P＜0.05).使用LY294002抑制细胞自噬,饥饿24 h细胞凋亡显著增多(rAd-GFP组:3.23％±0.34％;LY294002组:15.68％±1.24％,P＜0.01),而饥饿48 h凋亡显著减少(rAd-GFP组:30.20％±3.18％;LY294002组:25.44％±3.01％,P ＜0.05).rAd-ASPP2感染组饥饿24 h自噬显著降低(rAd-GFP组:12.17±0.86;ASPP2组:1.45±0.45,P＜0.01),而凋亡显著升高(rAd-GFP组:3.23％±0.34％;ASPP2组:10.45％ ±0.81％,P＜0.05);饥饿48 h自噬(rAd-GFP组:21.09 ±3.32;ASPP2组:29.93±3.48)和凋亡(rAd-GFP组:30.20％±3.18％;ASPP2组:36.72％±2.74％)水平均显著升高(均P＜0.05).结论 ASPP2通过对自噬的双向调节促进饥饿诱导的大肠癌HCT116 p53-/-细胞凋亡.     

细胞程序性死亡因子10调控Notch1信号介导胶质瘤细胞的迁移

目的探讨程序性细胞因子10(PDCD10)介导胶质瘤迁移的分子机制。方法采取慢病毒感染法构建沉默PDCD10的U251胶质瘤细胞系, 同时采用Notch信号通路抑制剂DAPT处理细胞, 观察沉默PDCD10细胞对胶质瘤细胞行为的影响;采用免疫荧光染色、实时定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹法分别检测胶质瘤细胞系对照组和沉默组PDCD10和Notch1的表达, 探讨PDCD10调控Notch1蛋白水平的机制。两组间比较采用t检验, 多组间均数比较采用多因素方差分析。结果免疫荧光染色结果显示, 胶质瘤细胞的PDCD10表达水平随着胶质瘤级别的提高而降低, 划痕试验和Transwell实验表明沉默PDCD10促进肿瘤细胞的迁移[(100±28)%比(152±25)%比(113±9)%、(100±3)%比(115±2)%比(99±2)%, F=7.15、88.30, P<0.01], 而这可被Notch信号通路抑制剂DAPT抑制[(152±25)%比(113±9)%、(115±2)%比(99±2)%, P<0.01]。进一步研究显示, 下调PDCD10的表达不改变Notch1的转录水平...     

原儿茶酸对人胶质瘤细胞株U251MG增殖、凋亡的影响及其机制

目的探讨原儿茶酸(PCA)对人胶质瘤细胞株U251MG增殖、凋亡的影响及相关分子机制。方法常规培养人胶质瘤细胞株U251MG。应用噻唑蓝(MTT)技术检测0、2.5、5.0、10.0、20.0μmol/L浓度PCA干预后各组细胞的活性。流式细胞术(FCM)检测PCA对U251MG细胞周期和凋亡的影响。应用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测U251MG在药物干预前后增殖凋亡相关基因和的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路蛋白的变化,组间比较采用t检验。结果0μmol/L的PCA干预48 h后细胞活性为0.881±0.079、2.5μmol/L为0.757±0.077、5.0μmol/L为0.600±0.101、10.0μmol/L为0.532±0.056(F=35.131,P<0.01),差异有统计学意义。RT-qPCR和Western blot结果显示,随PCA浓度增加,增殖细胞核抗原(PCNA)的mRNA表达水平为1.172±0.153、0.756±0.059、0.601±0.061、0.390±0.059、0.236±0.036(F=55.618,P<0.01),差异有统计学意义;蛋白的表达水平分别为0.934±0.071、0.781±0.053、0.650±0.045、0.384±0.046、0.174±0.019(F=113.681,P<0.01),差异有统计学意义。FCM结果显示,PCA组U251MG细胞的G0/G1期比例[(71.033±8.570)%]高于对照组[(52.057±6.735)%,t=3.015,P<0.05],差异有统计学意义,G2/M比例[(18.833±7.639)%]低于对照组[(36.910±5.328)%,t=-3.362,P<0.05],差异有统计学意义;Western blot结果显示,增殖相关蛋白Cyclin A、Cyclin D1、Cyclin E表达在PCA组低于对照组(0.405±0.047比1.217±0.101、0.673±0.070比1.166±0.110、0.604±0.085比1.286±0.085,t=-12.625、-6.549、-9.827,P<0.01),而p21、p27表达在PCA组高于对照组(1.206±0.096比0.575±0.046、0.990±0.086比0.481±0.045,t=10.267、9.083,P<0.01)。FCM结果显示,PCA组U251MG细胞凋亡率(29.971±7.572)%高于对照组[(10.264±3.121)%,t=4.168,P<0.05];Western blot结果显示,凋亡相关蛋白bcl-2、pro-Caspase-3、pro-Caspase-9表达在PCA组低于对照组(0.337±0.024比1.198±0.113、0.430±0.044比1.150±0.098、0.486±0.049比1.278±0.107,t=-12.909、-11.609、-11.656,P<0.01),bax、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9表达在PCA组高于对照组(1.312±0.097比0.471±0.051、1.173±0.140比0.460±0.052、1.245±0.089比0.606±0.080,t=13.292、8.269、9.249,P<0.01)。Westernblot结果显示,PCA组U251MG细胞MAPK信号通路中p-ERK表达明显低于对照组(0.591±0.047比0.989±0.084,t=-7.162,P<0.01)。结论PCA能通过调控MAPK信号通路中p-ERK的活性而抑制胶质瘤细胞U251MG的增殖,并促进凋亡。     

神经干细胞条件培养基对氧化应激损伤小鼠皮层神经元的作用

目的:观察神经干细胞条件培养基对氧化应激损伤小鼠皮层神经元的保护作用。方法:分离培养C57BL/6新生鼠神经干细胞及皮层神经元,随机分为4组:对照组(Control组)使用神经元培养基持续培养;单纯氧化应激实验组(H2O2组)加入1 mmol/L H2O2孵育1 h后更换神经元培养基;神经干细胞条件培养基干预组(H2O2+NSC-CM组)加入1 mmol/L过氧化氢孵育1 h后,更换半量神经干细胞条件培养基及半量神经元培养基;神经干细胞普通培养基干预组(H2O2+NSC-FM组)在加入H2O2孵育1 h后,更换半量未培养细胞的神经干细胞培养基及半量神经元培养基。各组实验24 h后使用CCK8法观察细胞活性,使用Hoechest33342对细胞核染色,根据核固缩水平检测细胞凋亡,测量神经突长度及数量,使用ROS试剂盒检测活性氧生成情况。结果:H2O2组神经元细胞活性为(23.60±4.78)%,H2O2+NSC-FM组为(25.00±5.92)%,均较Control组[(100.00±1.41)%]明显减少(P0.05),而H2O2+NSC-CM组[(45.40±8.99)%]较H2O2组则有明显提升(P0.05)。H2O2组细胞凋亡比例为(69.00±5.43)%,H2O2+NSC-FM组为(62.20±9.31)%,均较Control组[(13.40±2.70)%]明显增加(P0.05),而H2O2+NSC-CM组[(38.40±9.61)%]较H2O2组则有明显减少(P0.05)。最长神经突长度在H2O2组为(28.15±4.16)μm,H2O2+NSC-FM组为(27.05±4.67)μm,均较Control组[(45.20±4.01)μm]明显缩短(P0.05),而H2O2+NSC-CM组[(35.00±2.99)μm]较H2O2组则有明显增加(P0.05);使用Sholl模块发现,距离神经元胞体10、20、30、40、50μm范围H2O2组和H2O2+NSC-FM组神经突数量较Control组明显减少(P0.05),H2O2+NSC-CM组神经突数量较H2O2组则有一定增加(P0.05)。H2O2组活性氧生成为(69.00±5.43)%,H2O2+NSCFM组为(62.20±9.31)%,均较Control组[(13.40±2.70)%]明显增加(P0.05),而H2O2+NSC-CM组[(38.40±9.61)%]活性氧生成较H2O2组则有明显减少(P0.05)。结论:神经干细胞条件培养基能够一定程度抑制小鼠皮层神经元氧化应激损伤。     

KIF1A过表达对氧糖剥夺-再灌注损伤PC12细胞的作用机制研究

目的:研究Kinesin-3家族成员蛋白(Kinesin-3 family member1A,KIF1A)对氧糖剥夺-再灌注诱导的PC12细胞活力、自噬和凋亡的影响,为进一步研究KIF1A在脊髓缺血再灌注损伤治疗方面提供理论依据。方法:PC12细胞(美国ATCC公司)分为四组:A组,对照组,无处理;B组,氧糖剥夺再灌注(oxygen glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)组,PC12细胞用无糖DMEM培养基,于含混合气体(95%N2和5%CO2)的37℃恒温箱内密闭缺氧培养4h;C组,pcDNA3.1空质粒组,PC12细胞转染pcDNA3.1空质粒48h,进行OGD/R处理;D组,pcDNA3.1-KIF1A质粒组,PC12细胞转染pcDNA3.1-KIF1A质粒48h,进行OGD/R处理。B、C、D组经OGD/R处理后,更换常规培养基,正常孵育24h,收集细胞总RNA及蛋白质,进行实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT PCR)和Western blot检测KIF1A mRNA和蛋白的表达情况;CCK8检测细胞存活率变化;凋亡ELISA及Caspase-3活性检测试剂盒检测细胞凋亡及Caspase-3活性;Western blot检测各组自噬相关基因LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路的蛋白表达变化。结果:与A组(1.00±0.00)相比,B组细胞KIF1A mRNA(0.41±0.05)和蛋白表达水平(0.52±0.07,P<0.05)显著下调;细胞活力[(51.60±7.35)%,P<0.05]显著降低。与B组(1.00±0.00)相比,C组空质粒对KIF1A mRNA(0.91±0.13)及蛋白质(1.08±0.08)表达,细胞活力[(51.60±7.35)%vs(47.30±4.16)%],细胞凋亡(1.95±0.18 vs 2.08±0.16,P>0.05)等无显著影响。而D组KIF1A过表达后能显著上调KIF1A mRNA(2.63±0.16)以及蛋白表达(2.51±0.18,P<0.05),显著缓解OGD/R引起的细胞存活率下降[(51.60±7.35)%vs(86.40±9.03)%]及凋亡[1.95±0.18 vs 1.36±0.12,P<0.05];与B组相比,D组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值(1.68±0.14 vs 1.19±0.09,P<0.05)及pmTOR的表达(1.00±0.00 vs 1.26±0.02,P<0.05)显著受抑制,P62表达显著升高(0.53±0.05 vs 0.89±0.09,P<0.05)。结论:KIF1A过表达可促进缺血再灌注损伤诱导的PC12细胞存活、抑制细胞自噬与凋亡,其机制可能与抑制mTOR通路相关。     

雄激素剥夺条件下阻断自噬增加LNCaP细胞凋亡

目的 探讨雄激素剥夺条件下阻断自噬后LNCaP细胞凋亡变化与半胱天冬酶(caspase)激活的关系.方法 应用激光共聚焦显微镜、RT-PCR方法观察雄激素剥夺致细胞自噬增加后,利用DAPI染色观察细胞凋亡变化及药物抑制caspase后对凋亡的影响.结果 ①雄激素去除后LNCaP细胞自噬体增加,标准培养基(CM)培养下LNCaP细胞自噬体数量为1.90分;无血清培养基(SF)中细胞自噬体数量增高为2.64分;加入双氧睾酮(SFA组)后细胞自噬体下降至1.85分(P<0.01).CM中LNCaP细胞LC3 mRNA表达率为23%,血清饥饿12 h后,LC3表达量上调至100%,而SFA组LC3 mRNA表达量为86%;血清饥饿24 h后,SF组LC3 mRNA表达量为62%,SFA组为35%.②SF组和SFA组LNCaP细胞基础凋亡率分别为(3.19±1.09)0A和(3.01±0.33)%,加入3-甲基腺嘌呤(3-MA)阻断自噬24 h后,SF组凋亡率为(10.90±2.91)%,SFA组为(4.63±1.69)%.SF+3-MA组中加入Z-VAD-FMK后,细胞凋亡减至(1.16±0.52)%.组间差异有统计学意义(P<0.01).结论 剥夺雄激素后LNCaP细胞中自噬明显增加,阻断自噬后凋亡发生率增加.     

索拉非尼通过调节Beclin-l的表达诱导肝癌细胞自噬的实验研究

探讨索拉非尼诱导肝癌细胞自噬的作用及机制。选取人肝癌HepG2细胞,随机分为对照组、2.5μmol/L组、5μmol/L组和10μmol/L组,其中2.5μmol/L组、5μmol/L组和10μmol/L组分别给予2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L索拉非尼,采用MTT法检测细胞增殖,倒置荧光显微镜观察自噬小体,Western blot检测LC3-Ⅱ、Beclin-l表达。2.5μmol/L组、5μmol/L组和10μmol/L组培养24、48和72 h时吸光度(A)值明显低于对照组(P<0.05),其中10μmol/L组培养24、48和72 h时A值分别为0.289±0.097、0.310±0.100和0.411±0.103,明显低于2.5μmol/L和5μmol/L组(P<0.05);2.5μmol/L组、5μmol/L组和10μmol/L组自噬小体形成数明显高于对照组(P<0.05),其中10μmol/L组自噬小体形成数为(37.40±4.45)个,明显高于2.5μmol/L组和5μmol/L组(P<0.05);2.5μmol/L、5μmol/L组和10μmol/L组LC3-Ⅱ、Beclin-1相对表达量明显高于对照组(P<0.05),其中10μmol/L组LC3-Ⅱ、Beclin-1相对表达量为1.022±0.105和0.562±0.102,明显高于2.5μmol/L组和5μmol/L组(P<0.05)。索拉非尼可抑制肝癌细胞增殖,促进自噬小体生成,可能与调控Beclin-1表达有关。     

大黄素对精索静脉曲张缺氧模型精原细胞的保护作用

目的观察大黄素对精索静脉曲张缺氧模型精原细胞的保护作用。方法选用小鼠GC-1精原细胞,设置对照组(A组)、对照+大黄素组(B组)、模型组(C组)、模型+大黄素组(D组)。C组和D组加入氯化钴(CoCl2)至终质量浓度为100μmol/L,然后培养细胞24 h构建精索静脉曲张缺氧模型。B组和C组加入大黄素至终质量浓度为40μmol/L。采用细胞计数试剂-8(CCK-8)法及流式细胞仪测定细胞凋亡水平,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase-3)和B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bax)的蛋白质表达水平,采用实时定量反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测细胞Caspace-3和bax的基因表达水平,组间比较采取t检验。结果CCK-8实验示C组和D组细胞存活率低于A组[(51.70±3.52)%、(77.84±5.18)%比(100.00±0.00)%,t=23.767、7.410,P值均<0.05],差异有统计学意义,且D组细胞存活率高于C组[(77.84±5.18)%比(51.70±3.52)%,t=7.229,P<0.05],差异有统计学意义。流式实验示D组凋亡细胞比例低于C组[(10.54±0.68)%比(21.23±1.01)%,t=15.207,P<0.05],差异有统计学意义。Western blot结果示D组Caspace-3和bax蛋白表达水平低于C组(0.713±0.020、0.819±0.022比1.134±0.025、1.271±0.019,t=22.722、26.813,P值均<0.05),差异有统计学意义。RT-qPCR结果示D组Caspace-3和bax表达水平低于C组(1.52±0.18、1.80±0.21比3.53±0.23、4.27±0.31,t=11.920、11.426,P值均<0.05),差异有统计学意义。结论大黄素通过抑制细胞凋亡对精索静脉曲张缺氧模型的精原细胞起保护作用。     

维纳托克在肝癌细胞中的抗肿瘤活性及其机制

目的探讨维纳托克(Venetoclax)在HepG2、Hep3B 2个肝癌细胞株的抗癌活性。方法对人肝癌细胞株HepG2、Hep3B细胞株进行体外培养,采用不同浓度的Venetoclax(0、3、10、30μmol/L)处理肝癌细胞,以细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活性,0,3,10和30μmol/L Venetoclax作用细胞48 h,锥虫蓝拒染法检测细胞的死亡,0,5μmol/L Venetoclax,作用24 h,流式细胞学检测细胞凋亡率,蛋白质印迹法(Western blot)检测Venetoclax诱导半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3活化,聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)裂解。组间比较采用t检验。结果Venetoclax对HepG2、Hep3B细胞株均有较强活性抑制作用。不同浓度的Venetoclax处理肝癌细胞48、72 h,Venetoclax在HepG2细胞株中取得的半数细胞活性抑制率(IC50)值分别为46.5μmol/L和14.2μmol/L;在Hep3B细胞的IC50值分别为24.6μmol/L和11.2μmol/L。处理24 h,30.0μmol/L的Venetoclax在HepG2和Hep3B细胞株中诱导57%[对照组、实验组凋亡率分别为(4.00±1.00)%、(56.67±8.51)%,t=-10.650,P<0.01]和54%[对照组、实验组凋亡率分别为(5.67±1.53)%、(54.33±9.87)%,t=-8.440,P<0.01]的肝癌细胞发生凋亡,并能诱导肝癌细胞的Caspase-3活化,PARP裂解,差异均有统计学意义。用0、3、10和30μmol/L的Venetoclax处理48 h,在HepG2细胞株中可诱导3%(3.26±1.71)%,12%[(12.36±1.99)%,(t=-12.36,P<0.05)],32%[(32.38±4.57)%,(t=-10.350,P<0.01)]和67%[(66.71±6.29)%,(t=-16.86,P<0.01)]的细胞死亡,差异均有统计学意义;在Hep3B细胞株诱导2%(1.91±0.68)%,16%[(15.72±3.40)%,(t=-6.890,P<0.05)],42%[(42.39±6.86)%,(t=-10.180,P<0.01)]和73%[(73.32±2.69)%,t=-44.490,P<0.01]的细胞死亡,差异均有统计学意义。应用半胱氨酸蛋白酶(Caspase)抑制剂预处理,Venetoclax对HepG2和Hep3B细胞的死亡率分别从56%(56.71±6.29)%降低至11%(10.70±1.43)%,(t=12.350,P<0.01)和68%(68.05±10.16)%至12%(12.7±6.12)%,(t=8.080,P<0.01),差异有统计学意义。结论Venetoclax能够通过诱导Caspase的活化,诱导肝癌细胞发生凋亡,并对肝癌细胞进行杀伤。     

氯喹对肝癌细胞体内外生长的影响及其与自噬的关系

背景与目的:氯喹是一种广泛应用于疟疾、类风湿性疾病治疗的药物,同时还是一种自噬抑制剂,而且多项研究表明,氯喹能抑制包括肝癌在内的多种肿瘤细胞的生长。本研究在体外细胞实验与荷瘤鼠模型上进一步观察氯喹对肝癌的抑制作用及其与自噬的关系。方法:不同浓度的氯喹(0、25、50 μmol/L)体外作用于肝癌Huh7细胞后,用MTT法检测细胞的增殖情况。将75只裸鼠皮下接种Huh7细胞建立肝癌裸鼠移植瘤模型后,随机均分为3组,于接种后7 d(均已成瘤)分别腹腔注射生理盐水(对照组)、25 mg/kg氯喹(低剂量氯喹组)、50 mg/kg氯喹(高剂量氯喹组),1次/d,连续30 d。期间记录各组肿瘤生长情况,实验结束时,收集移植瘤标本,分别用免疫组化与Western blot法检测移植瘤内自噬相关蛋白(LC3、p62)的表达。结果:MTT检测结果显示,与对照组比较(0 μmol/L),两个浓度氯喹均能明显抑制肝癌Huh7细胞的增殖,并呈明显的时间、浓度效应(均P0.05)。荷瘤鼠模型中,两个剂量氯喹组的肿瘤生长均较对照组明显抑制,且高剂量氯喹组较低剂量氯喹组的肿瘤生长抑制更为明显(均P0.05);免疫组化与Western blot结果显示,两个剂量氯喹组肿瘤组织中LC3、p62的表达水平均较对照组明显升高,且高剂量氯喹组的升高水平明显大于低剂量氯喹组(均P0.05)。结论:氯喹体外与体内均能抑制肝癌细胞的生长,其作用机制可能与其调节自噬相关蛋白的表达抑制肝癌细胞自噬有关。     

Notch信号通路参与肝癌细胞侵袭迁移的机制分析

目的:探讨Notch信号通路在肝癌细胞侵袭迁移过程中的相关机制。方法:体外培养肝癌细胞系Hep G2、Huh-7和正常非肿瘤肝细胞系HL-7702,利用Transwell小室检测细胞的侵袭迁移能力,Western blot方法检测Notch1、Snail、E-cadherin、MMP-2、MMP-9的蛋白表达。采用1μmol/L和5μmol/L的DAPT(γ-分泌酶抑制剂)阻断Notch信号通路,与对照组(空培养基)比较对细胞的侵袭迁移能力以及Snail、E-cadherin、MMP-2、MMP-9表达量的影响。结果:Notch1、Snail、E-cadherin、MMP-2、MMP-9参与了肝癌细胞侵袭迁移过程,DAPT能显著上调E-cadherin和下调Snail、MMP2、MMP-9的表达(P0.05)。结论:Notch信号通路在肝癌细胞侵袭迁移过程中起着非常重要的作用,其机制初步认为与Snail、E-cadherin、MMP-2、MMP-9的表达有关。     

自噬在镉致小鼠睾丸血-睾屏障损伤中的作用

目的:探究自噬在氯化镉致小鼠睾丸血-睾屏障(BTB)损伤中的作用。方法:将20只4周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组[0 mg/(kg·d)]、低剂量组[0.5 mg/(kg·d)]、中剂量组[1.0 mg/(kg·d)]和高剂量组[2.0 mg/(kg·d)],腹腔注射氯化镉，连续28 d。采用HE染色法分析睾丸组织形态学变化，生物示踪法观察BTB的完整性，Western印迹检测BTB组分ZO-1和N-Cadherin蛋白的表达。采用0、2.5、5和10μmol/L CdCl₂处理睾丸支持细胞株(TM4细胞)24 h, Western印迹检测ZO-1和N-Cadherin蛋白，以及自噬相关蛋白LC3II和p62的变化情况。在含CdCl₂(10μmol/L)的细胞培养液中分别加入自噬抑制剂氯喹(CQ)(5μmol/L)或自噬激动剂雷帕霉素(Rap)(50 nmol/L)处理细胞24 h, Western印迹检测LC3II、p62、ZO-1和N-Cadherin蛋白表达。结果:与对照组小鼠相比，镉染毒组小鼠的生精小管间隙增大、生精细胞内空...