Calphostin C对培养神经元缺氧后Bcl-2表达及神经元凋亡的研究

目的探讨蛋白激酶C(PKC)对神经元缺氧凋亡的影响及作用机制.方法建立体外培养孕Wister大鼠皮层神经元模型及培养神经元缺氧模型,在此基础上观察神经元存活率、Bcl-2和凋亡DNA表达的规律;然后用3种不同浓度的PKC催化亚基特异性抑制剂CalphostinC预孵育培养神经元后进行缺血处理,观察神经元上述指标的改变.结果随着缺氧时间的延长和CalphostinC浓度的增加,培养神经元的存活数显著下降、Bcl-2免疫组化阳性细胞数明显减少、TUNEL荧光染色平均荧光强度显著升高.结论(1)PKC和Bcl-2均参与了缺氧神经元凋亡;(2)PKC抑制剂CalphostinC可加重缺氧神经元凋亡;(3)PKC的激活在缺氧神经元的凋亡中起保护作用,且该作用可能是通过促进Bcl-2表达实现的.     

缺血再灌注大鼠脑保护过程中蛋白激酶C同工酶抑制剂的作用

背景：蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)抑制剂能明显减轻缺血性脑损害，但其毒副作用大、价格昂贵。灯盏花素注射液能明显抑制PKC活性，对缺血性脑损害有一定的保护作用。目的:研究局灶脑缺血再灌注大鼠PKC抑制剂灯盏花素缺血脑保护作用的可能机制。设计：完全随机设计，对照实验研究。主要观察指标：采用线栓法制备大鼠局灶脑缺血再灌注模型。于缺血1．5h再灌注4，24，72h观察PKC同工酶γ蛋白表达及神经元凋亡的变化规律。结果：再灌注4hPKCγ及神经元凋亡明显升高，PKCγ在24h达高峰，72h开始下降(P&;lt;0．05)；神经元凋亡的变化规律同PKCγ(P&;lt;0．01)；灯盏花素组再灌注24h前能明显抑制PKCγ及神经元凋亡的表达(P&;gt;0．05)。结论：灯盏花素的缺血脑保护作用可能与其下调PKCγ蛋白表达有关。     

大鼠脊髓损伤后诱导型一氧化氮合酶的表达及动态改变

目的：探讨大鼠急性脊髓损伤后不同时段髓内诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA动态表达。方法：36只SD大鼠抽签法随机分组，任选一组作为对照。采用Allen法制作急性脊髓损伤模型，在损伤后2，6，12，24，48h等时段，以反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)分析：iNOS mRNA表达。在脊髓损伤后24h，用免疫组化方法分析iNOS在脊髓不同类型神经细胞中的表达与分布，并以比色法测定脊髓损伤后血清NOS及一氧化氮的含量。结果：脊髓损伤后，神经元、星形细胞和小胶质中均可见iNOS表达，以神经元表达为主。脊髓损伤后2h可见iNOS表达0．56&;#177;0．02，24h达高峰1．20&;#177;0．05，48h开始降低0．70&;#177;0．06。血清中NOS及一氧化氮的动态改变与损伤组织iNOS mRNA变化趋势相一致。结论：研究资料提示脊髓损伤后脊髓内iNOS表达增高，过量产生的一氧化氮加重了继发性脊髓损伤。     

神经节苷脂QM-1对大鼠急性脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响

目的：研究神经节苷脂GM-1对大脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡的影响。方法：建立全脑缺血再灌注模型，应用二苯胺法和免疫组织化学方法观察脑缺血后3h、6h、24h脑组织DNA裂解率变化及PKC6表达，以及GM-1给药后的变化。结果：随着再灌注时间的延长，DNA裂解率变化明显增加，24h达高峰，PKC5表达于再灌注6h达高峰，以后逐渐呈下降趋势；GM-1给药组相应时间点的DNA裂解率及PKC6表达明显减少。结论：GM-1能抑制脑缺血再灌注后细胞凋亡的发生，并减少PKC6的表达，对脑缺血再灌注损伤具有明显的保护作用。     

丹红注射液对体外神经元N-甲基-D-天冬氨酸损伤后的保护作用

目的：胎鼠原代皮层神经元培养,建立N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导的兴奋性毒性损伤模型。研究丹红注射液对于神经元NMDA损伤后的保护作用。方法：胎鼠原代神经元培养并鉴定。培养至10d时,给予不同浓度NMDA,采用MTT法检测细胞生存率并测定LDH释放率,建立NMDA损伤模型。给予两种剂量的丹红注射液干预,测定细胞生存率及LDH释放率。采用Hoechst染色及TUNEL检测小剂量丹红干预组细胞凋亡情况。结果：随着NMDA浓度的增高,神经元生存率逐步下降,LDH释放率依次增加,以NMDA300μmol·L^-1组损伤最明显。丹红干预组细胞生存率提高,LDH释放率下降。小剂量丹红干预组凋亡细胞百分率减低。结论：丹红注射液可减轻NMDA诱导的体外神经元损伤,抑制神经元凋亡。     

缺血再灌注大鼠脑保护过程中蛋白激酶C同工酶抑制剂的作用

背景蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)抑制剂能明显减轻缺血性脑损害,但其毒副作用大、价格昂贵.灯盏花素注射液能明显抑制PKC活性,对缺血性脑损害有一定的保护作用.目的研究局灶脑缺血再灌注大鼠PKC抑制剂灯盏花素缺血脑保护作用的可能机制.设计完全随机设计,对照实验研究.主要观察指标采用线栓法制备大鼠局灶脑缺血再灌注模型.于缺血1.5 h再灌注4,24,72 h观察PKC同工酶γ蛋白表达及神经元凋亡的变化规律.结果再灌注4h PKCγ及神经元凋亡明显升高,PKCγ在24h达高峰,72h开始下降(P＜0.05);神经元凋亡的变化规律同PKCy(P＜0.01);灯盏花素组再灌注24 h前能明显抑制PKCγ及神经元凋亡的表达(P＞0.05).结论灯盏花素的缺血脑保护作用可能与其下调PKCγ蛋白表达有关.     

缺血预处理对大鼠皮质神经元缺血耐受性和Bcl-2表达的影响

目的：观察缺血预处理对大鼠原代培养神经元缺血耐受性的影响，并探讨缺血预处理对bcl-2表达的影响。方法：体外培养的原代神经元分为对照组和预处理组，对照组给予类缺血30min复氧复糖培养24h；预处理组经类缺血10min预处理后复氧复糖培养24h后，再给予致死性的类缺血30min复氧复糖培养24h，两组细胞均用TUNEL法检测神经元凋亡，并计算存活和凋亡神经元所占百分率。同时用免疫组化法观察两组细胞bcl-2的表达。结果：对照组神经元的凋亡率明显高于预处理组，对照组bcl-2的表达明显低于预处理组，差异有统计学意义。结论：缺血预处理能够诱导神经元的缺血耐受性，预处理可能通过激活bcl-2增加其表达发挥神经保护作用。     

大鼠脊髓损伤后细胞凋亡特点及其与一氧化氮合酶表达的相关性

目的探讨脊髓损伤后细胞凋亡特点与诱生型一氧化氮合酶(iNOS)表达规律及二者之间的关系.方法成年大鼠32只,随机分为8组(每组4只)单纯椎板切除对照组和脊髓损伤后7个时间点处死组(4、8 h和1、3、7、14、21 d).用免疫组化染色检测iNOS、p53阳性细胞,原位末端标记法(TUNEL)标记凋亡细胞.另取大鼠32只进行同样分组,用Western blot analsis法检测iNOS表达.结果免疫组化结果显示单纯椎板切除对照组神经元、神经胶质细胞、室管膜细胞、血管内皮细胞极少量表达iNOS;损伤后8 h上述细胞iNOS表达增加,7 d达高峰,14 d仍较明显,21 d降低.p53表达及TUNEL标记阳性细胞的时间分布特点与iNOS相似,7d达高峰,阳性细胞以白质中胶质细胞为主,主要分布于损伤部及相邻区.iNOS的Western blot灰度扫描数值时间变化曲线与免疫组化阳性细胞率时间变化曲线一致.iNOS表达与神经细胞凋亡指数及p53表达存在正相关(r＝0.854,P＜0.01;r＝0.951,P＜0.01).结论大鼠脊髓损伤后iNOS与p53表达增强,凋亡神经细胞大量出现.iNOS表达与脊髓损伤后神经细胞凋亡指数间存在正相关.     

大剂量甲基强的松龙对大鼠脊髓损伤后诱导型一氧化氮合酶表达及细胞凋亡的影响

背景：甲基强的松龙(MP)具有多方面的神经保护作用，目前广泛应用于治疗急性颅脑和脊髓损伤，但其作用机制尚不完全清楚。目的：探讨大鼠脊髓损伤后应用大剂量甲基强的松龙(MP)对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达及细胞凋亡的影响。设计：采用随机分组、安慰剂对照实验研究。单位：大连医科大学第一附属医院骨科。材料：实验在大连医科大学第一附属医院骨科实验室完成。成年雄性SPF级SD大鼠56只，体质量300～350g。由大连医科大学实验动物中心提供。干预：成年大鼠随机分为脊髓损伤后应用大剂量甲基强的松龙组(A组)和应用生理盐水组(B组)。损伤后不同时间点(4，8h，1，3，7，14，21d)按Tarlov标准评价大鼠双后肢神经功能恢复情况，然后处死。用苏木精一伊红(HE)染色观察损伤脊髓组织病理变化，用免疫组化染色检测iNOS阳性细胞，原位末端标记法(TUNEL法)标记凋亡细胞。主要观察指标：两组大鼠各时相点iNOS表达阳性细胞率，凋亡指数和Tarlor平分。结果：HE染色镜检发现脊髓组织病理学改变甲基强的松龙组明显轻于生理盐水组。两组均发现凋亡细胞及iNOS表达，神经细胞凋亡指数及iNOS表达均为生理盐水组大于甲基强的松龙组(P&;lt;0．01或P&;lt;0．05)。结论：大剂量甲基强的松龙能抑制大鼠脊髓损伤后iNOS表达及细胞凋亡。     

原代缺氧缺糖损伤神经元模型Cdh1及其下游底物的表达

背景：课题组前期实验已证实Cdh1在大鼠海马、皮质均有大量表达,且体外实验发现神经元中Cdh1表达高于神经干细胞,可能与神经干细胞向神经元分化有关。但细胞周期末期促进复合物调节亚基 Cdh1在缺血性神经元损伤中的作用,尚不明确。
　　目的：体外构建原代缺氧缺糖损伤神经元模型,观察Cdh1及其下游底物表达变化。
　　方法：取出生24 h内乳鼠大脑皮质,体外培养原代神经元并通过免疫荧光染色进行鉴定。使用无糖Earle’s 液替代细胞培养液,利用三气培养箱充以氮气建立原代神经元缺氧缺糖模型,缺氧处理1h后复氧。于缺氧前、缺氧缺糖损伤后6 h、1 d,3 d,7 d采用实时荧光定量PCR检测神经元Cdh1及其下游底物Skp2、Cyclin B1的表达。
　　结果与结论：体外缺氧缺糖损伤后,原代神经元Cdh1及其下游底物Cyclin B1表达上调(P<0.05),Skp2表达均下调(P <0.05)。提示,体外缺氧缺糖损伤后神经元Cdh1表达升高,可能通过泛素化降解Skp2参与缺氧性神经元凋亡等病理过程。     

佛波酯诱导的蛋白激酶C活化对扭转蛋白A亚细胞分布的影响

目的 探讨佛波酯激活的蛋白激酶C与扭转蛋白A在亚细胞成分中的表达之间的关系.方法 采用免疫荧光法观察扭转蛋白A在原代培养的神经元和小鼠胚胎成纤维细胞(NIH 3T3细胞)中的分布.运用蛋白质印迹法分析蛋门激酶C和扭转蛋白A在细亚细胞成分中的表达.结果 扭转蛋白A在NIH 3T3细胞中的表达类似于神经元.扭转蛋白A在细胞...     

纳洛酮对体外培养的缺氧大鼠皮质神经元细胞凋亡的影响

目的 :观察缺氧对大鼠皮质神经元细胞凋亡的影响及纳洛酮的保护作用。方法 :取体外培养 12 d的Wistar大鼠皮质神经元细胞 ,随机分为正常对照组、缺氧组、缺氧加纳洛酮组。缺氧 6h后在常氧下继续培养2 4h,用原位末端标记 (TUNEL)法和流式细胞仪检测不同时间段神经元细胞凋亡率。结果 :缺氧能诱导神经元细胞凋亡显著增加 ,纳洛酮可以降低凋亡率 ,与缺氧组相比差异显著 (P<0 .0 1)。结论 :纳洛酮可抑制缺氧诱导的大鼠皮质神经元细胞凋亡 ,对神经元细胞具有保护作用     

纳洛酮对神经元GluR2表达的影响及缺氧损伤保护作用

目的：研究纳洛酮对缺氧损伤神经元膜表面AMPA（amino-3-hyoroxy-5-methylisoxazole-4-propionicacid，α-氨基-3-羟基-5甲基-4-异噁唑丙酸）受体在谷氨酸受体第二亚单位（GluR2，glutamic acid receptor 2）表达的影响及其对神经细胞凋亡的保护作用。方法：取体外培养12d的大鼠海马神经元，建立缺氧再灌注损伤模型，分别采用流式细胞和双重免疫荧光技术定量观察神经元凋亡数量、胞膜表面GluR2含量变化及纳洛酮的调节作用。结果：纳洛酮可上调缺氧损伤后神经元膜GluR2的含量（P〈0.05），减少缺氧诱导的神经元凋亡的数量（P〈0.01）。结论：纳洛酮通过上调神经元膜表面GluR2含量，减少神经元凋亡，减轻继发性脑损害。     

骨髓间充质干细胞神经营养因子的表达及对脊髓神经元的保护作用

研究骨髓间充质干细胞（BMSC）表达脑源性神经营养因子（BDNF）和神经生长因子（NGF），以及BMSC条件培养液对脊髓神经元的保护作用，探讨BMSC冶疗脊髓损伤的机制，为BMSC的临床应用提供依据和指导。方法：取大鼠骨髓培养BMSC，用CD44、CD45和CD71免疫细胞化学染色进行鉴定。提取BMSC mRNA，RT-PCR检测BDNF和NGF表达．ELISA检测BMSC培养液中BDNF和NGF的含量。原代取材培养大鼠脊髓神经元，10d后用不同比例的BMSC条件培养液培养24h，热休克诱导神经元凋亡，流式细胞仪检测凋亡细胞比率。结果：BMSC贴壁生长，免疫细胞化学染色CD44（＋）、CD45（-）和CD71（＋）。BMSC表达BDNF和NGF mRNA，BMSC培养液中含有BDNF和NGF，随培养时间的延长培养液中BDNF和NGF的含量增加。BMSC条件培养液可以减少热休克诱导的脊髓神经元凋亡的比率．并且BMSC条件培养液含量高者有更好的保护作用。结论：BMSC表达神经营养因子BDNF和NGF．对损伤脊髓神经元有保护作用。     

Protein kinase C mediates lipopolysaccharide- and phorbol-induced nitric-oxide synthase activity and cellular injury in the rat colon

The role of protein kinase C (PKC) in lipopolysaccharide (LPS)- and phorbol ester-induced changes in rat colonic cellular integrity and Ca(2+)-independent inducible nitric-oxide synthase (iNOS) activity was investigated. LPS treatment (3 mg kg(-1) i.p.) increased colonic cellular PKC activity within 1 h after administration. The percentage of nonviable cells and iNOS activity in response to LPS were reduced by pretreatment with the selective PKC antagonist GF 109203X (25 ng kg(-1) i.v.). Pretreatment with the selective iNOS inhibitor 1400W (5 mg kg(-1) s.c.) reduced the extent of cellular injury and iNOS activity but did not affect the increase in LPS-mediated PKC activation. Reduction of circulating neutrophils with anti-neutrophil serum reduced cell damage as well as the increases in PKC and iNOS activities in response to LPS. Intracolonic administration of the phorbol ester phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA; 3 mg kg(-1)) increased colonic cellular PKC activity within 2 h after instillation. Cellular iNOS activity did not increase until 6 h after PMA administration. The colonic responses to PMA were eliminated by GF 109203X. The selective iNOS inhibitor 1400W reduced the increase in cell injury but did not affect the PKC activation in response to PMA. LPS treatment also increased in the proteins for PKC-alpha, PKC-delta, PKC-epsilon, and PKC-zeta. PMA treatment resulted in PKC-delta and PKC-epsilon translocation from cytosol to membrane. These data suggest that PKC mediates iNOS activation and subsequent colonic cell injury in response to LPS administration. The delta- and epsilon-isozymes appear to be most closely associated with these responses.     

嗅鞘细胞条件培养液和星形胶质细胞条件培养液对受损海马神经元保护作用的对比研究

目的:观察嗅鞘细胞条件培养液(OECCM)和星形胶质细胞条件培养液(ACM)对受损海马神经元的保护作用。方法:分别采用2种胶质细胞条件培养液预处理受损海马神经元(谷氨酸诱导损伤),对比其对受损海马神经元活力、凋亡率和胞浆内游离钙离子浓度的影响。结果:与谷氨酸组相比,OECCM组神经元活力明显增高(P0.01),ACM组神经元活力增高(P0.05);与OECCM组相比,ACM组神经元活力降低(P0.05)。与谷氨酸组相比,ACM组神经元凋亡率和胞内游离钙浓度降低(P0.05),OECCM组明显降低(P0.01);OECCM组神经元凋亡率和胞内游离钙浓度低于ACM组(P0.05)。结论:OECCM和ACM均可明显提高受损海马神经元活力、降低凋亡率和胞浆内游离钙离子浓度,OECCM的保护作用优于ACM。     

Role of protein kinase C in control of ethanol-modulated beta-endorphin release from hypothalamic neurons in primary cultures

We have previously shown that short-term exposure to ethanol stimulates immunoreactive beta-endorphin (IR-beta-EP) release from hypothalamic neurons and that chronic ethanol exposure decreases the IR-beta-EP release from these neurons. The role of protein kinase C (PKC) in the ethanol-regulated beta-EP release from hypothalamic neurons has not been established. In this study, by using the primary cultures of hypothalamic neurons, we tested the effects of PKC stimulator phorbol ester 4 beta-phorbol 12-myristate-13-acetate (PMA) and PKC inhibitor chelerythrine chloride on ethanol-induced IR-beta-EP release. Additionally, the effects of ethanol with or without PMA on expression and translocation of various PKC isoenzymes from cytosolic to membrane fraction were determined. PMA treatment increased IR-beta-EP release in a time- and dose-dependent manner. Acute ethanol treatment (3 h) increased, while chronic ethanol treatment (24 h) reduced, the magnitude of PMA-induced IR-beta-EP release. The stimulatory effect of acute ethanol on IR-beta-EP release was reduced by chelerythrine chloride. Determination of the effects of ethanol with or without PMA on seven different PKC isoenzymes (PKC-alpha, -beta I, -beta II, -gamma, -delta, -epsilon, and -zeta) revealed that the expression and translocation of only two PKC isoenzymes, PKC-delta and PKC-epsilon, were stimulated by acute treatment with ethanol. Acute ethanol also increased PMA-stimulated expression of these two isoenzymes. Chronic ethanol treatment reduced both basal and PMA-induced increase of PKC-delta and PKC-epsilon expression and translocation. These data provide evidence for the first time that ethanol-regulated IR-beta-EP secretion is controlled by the PKC system, possibly involving PKC-delta and PKC-epsilon isoenzymes.     

Variable expression of protein kinase C epsilon in human melanoma cells regulates sensitivity to TRAIL-induced apoptosis

Protein kinase C (PKC) activation is believed to protect against apoptosis induced by death receptors. We have found however that the effect of activation of PKC on tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-induced apoptosis of melanoma differs between cell lines. Pretreatment with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) led to inhibition of apoptosis in the majority of the melanoma cell lines, but those with relatively low PKC epsilon expression were sensitized to TRAIL-induced apoptosis. Introduction of PKC epsilon into PKC epsilon-low cell lines reversed sensitization of the cells to TRAIL-induced apoptosis by PMA. In contrast, a dominant-negative form of PKC epsilon caused an increase in sensitivity. The changes in sensitivity to TRAIL-induced apoptosis were reflected in similar changes in conformation of Bax and its relocation from the cytosol to mitochondria. Similarly, there were concordant increases or decreases in mitochondrial release of second mitochondria-derived activator of caspase/DIABLO, activation of caspase-3, and processing of its substrates. Activation of PKC seemed to mediate its effects upstream of mitochondria but downstream of caspase-8 and Bid in that pretreatment with PMA did not cause significant changes in the expression levels of TRAIL death receptors, alterations in the levels of caspase-8 activation, or cleavage of Bid. PKC activated the anti-apoptotic extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway, but inhibitors of this pathway only partially reversed the protective effect of PKC against TRAIL-induced apoptosis. These results provide further insights into the variable responses of melanoma to TRAIL-induced apoptosis and may help define responsive phenotypes to treatment of melanoma with TRAIL.