人白细胞介素10的克隆及分泌表达

目的：研究人白细胞介素10（hIL-10)的高效分泌表达。方法：根据Genbank报道的hIL-10基因序列，人工合成hIL-10基因，并将某些稀有密码子替换成E.Coli偏爱密码子，克隆至pUC18质粒中，测序结果与预期一致，将hIL-10基因克隆至PET22b，构建分泌表达克隆PET22b-hIL-10，经IPTG诱导在大肠杆菌BL21（DE3）中表达hIL-10天然蛋白。结果：SDS－PGAE电泳及凝胶密度扫描分析显示，重组蛋白分子量约为18KD和21KD(含信号肽），不同温度条件下重组蛋白的表达状态和表达量不同，结论：18摄氏度重组蛋白hIL-10的表达量为7．6％。     

人白细胞介素-10 cDNA的克隆

目的：克隆人白细胞介素10(hIL-10)cDNA的全长序列，为其分子生物学利用奠定基础。方法：无菌条件抽取正常成人外周血15ml，分离单核细胞，用刀豆素A(ConA)刺激培养24h；离心得到一定量细胞，加入变性液，一步法提取细胞总RNA；反转录合成IL-10的第1条链，用自己设计的特异性上下游引物进行PCR扩增，得到期望分子量的PCR产物；酶切后插入PcDNA3载体，转染感受态细胞进行筛选制备，并行酶切鉴定和测序。结果：外周血单核细胞经ConA刺激后IL-10转录水平增加，从提取的RNA反转录产物中容易扩增出期望分子量的PCR产物，酶切鉴定证明得到的IL-10cDNA分子量与基因库报告的相近，测序结果表明得到的IL-10cDNA序列与基因库报告的序列完全一致。结论：人的IL-10cDNA全长序列被成功克隆。     

人白细胞介素-10在大肠杆菌中的表达

目的克隆人IL-10 cDNA的全长序列，构建原核表达载体并诱导其表达。方法无菌条件下静脉采取正常人外周血10ml。加入等体积的生理盐水稀释后，加入淋巴细胞分离液，离心收集细胞，提取细胞总RNA。以细胞总RNA为模板，进行RT—PCR，克隆出IL-10 cDNA，经双酶切后插入表达载体pMon中，用pMon—IL10重组体转染大肠杆菌DH5a。用萘啶酮酸诱导使重组人IL-10在大肠杆菌中表达，对表达产物进行SDS—PAGE电泳及Western—blot分析。结果人外周血单核细胞经ConA刺激后，IL—10转录水平增加，有利于IL-10 cDNA的克隆；克隆的IL-10 cDNA经测序证实与基因库报告的序列完全一致，插入pMon载体后经萘啶酮酸诱导能够在大肠杆菌DH5a表达；表达的蛋白质能与兔抗人IL—10特异性结合。结论人IL-10 cDNA被成功克隆并能够在大肠杆菌中表达。     

人分泌型白细胞介素2受体α链基因的克隆及其在真核细胞中的表达

删除人白细胞介素－２受体α链ｃＤＮＡ中编码胞质内１３个氨基酸及跨膜区１９个氨基酸残基的ＤＮＡ片段后，接上人工合成的终止寡核苷酸片段，改建后的ｃＤＮＡ与真核表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ重组成质粒ｐＣＭＶ／ｒｓＩＬ２Ｒ。用电打孔及磷酸钙法将此质粒转染ＣＨＯ细胞，经Ｇ４１８筛出表达Ｎｅｏ基因的克隆２０株，通过ｍＲＮＡ狭缝杂交及ＥＬＩＳＡ检测，有５株能稳定表达分泌型α链ｍＲＮＡ及蛋白，其中４株细胞培养上清中的ＩＬ２Ｒα链的含量达１４００Ｕ／ｍｌ以上。     

人分泌型白细胞介素2受体α链基因的克隆及其在真核细胞…

删除人白细胞介素－２受体α链ｃＤＮＡ中编码胞质内１３个氨基酸及跨膜区１９个氨基酸残基的ＤＮＡ片段后，接上人工合成的终止寡核苷酸片段，改建后的ｃＤＮＡ与真核表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ重组成质粒ｐＣＭＶ／ｒｓＩＬ２Ｒ。用电打孔及磷酸钙法将此质粒转染ＣＨＯ细胞，经Ｇ４１８筛出表达Ｎｅｏ基因的克隆２０株，通过ｍＲＮＡ狭缝杂交及ＥＬＩＳＡ检测，有５株能稳定表达分泌型α链ｍＲＮＡ及蛋白，其中４株细胞培养上清中的Ｉ     

人重组白细胞介素—10在大肠杆菌中的表达纯化与鉴定

目的：为人白细胞介素－１０（ｒＩＬ－１０）的理论研究得档应用研究提供材料。方法：利用基础工程技术，将ｈＩＬ－１０ｃＤＮＡ克隆在大肠杆菌表达载体中，在大肠杆菌中高效表达含凝血酶识别序列的ｈＩＬ－１０的融合蛋白。表达蛋白经凝血酶消化后，可去除ＭＳ２细菌蛋白。结果：获得高纯度的非融合型ｒｈＩＬ－１０。结论：活性分析表明ｒｈＩＬ－１０具有抑制ＬＰＳ刺激的外周血单个核细胞产生ＩＬ－６的能力。     

重组人白细胞介素10的融合表达及鉴定

目的 研究重组人白细胞介素10(rhIL—10)载体在大肠杆菌B121(DE3)pLyse细胞中的表达，为进一步研究IL-l0在动脉粥样硬化中的作用机制奠定基础。方法 用构建成功的IL-l0—PCRT7/NT-TOPO质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLyse细胞，并通过SDS-PAGE鉴定融合表达蛋白。结果 PCRT7/NT—TOPO质粒载体成功载入rhIL-l0基因；在异丙基硫代—β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下表达的蛋白质主要以包涵体形式存在。结论 在IPTG诱导下，重组的IL-l0—PCRT7/NT—TOPO质粒载体在大肠杆菌BL2l(DE3)pLyse细胞内成功表达。     

重组人白细胞介素10单克隆抗体的制备

目的 制备重组人白细胞介素１０（ｒｈＩＬ－１０）单克隆抗体。方法 应用鼠－鼠 瘤技术建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系,ＥＬＩＳＡ检测朵交瘤细胞培养上清、腹水效价,双向免疫扩散试验进行亚类鉴定,Ｇｉｅｍｓａ染色镜下计数杂交瘤染色体数目。结果获得了２株能分泌抗ｒｈＩＬ－１０单克隆抗体的杂交瘤细胞系（１Ｄ３、２Ａ３）,无血清培养液效价为１：５１２、１：２５６,腹水效价１：１０＾４、１：１０＾４。ＵＪＦ     

人重组白细胞介素-10在大肠杆菌中的表达纯化与鉴定

为人白细胞介素-10（hIL-10）的理论研究和临床应用研究提供材料。方法：利用基因工程技术，将hIL-10cDNA克隆在大肠杆菌表达载体中，在大肠杆菌中高效表达含凝血酶识别序列的hIL-10的融合蛋白。表达蛋白经凝酶消化后，可去除MS2细菌蛋白。结果：获得高纯度的非融合型rhIL-10。结论：活性分析表明rhIL-10具有抑制LPS刺激的外周血单个核细胞产生IL-6的能力。     

大鼠白细胞介素—10cDNA的克隆

目的：克隆大鼠白细胞介素－10（IL－10)cDNA的全长序列，为其分子生物学利用奠定基础，方法：无菌条件下切取大鼠的脾脏，收集脾细胞，用脂多糖（LPS）刺激培养4h离心得到一定量细胞，加入变性液，一步法提取细胞总RNA；逆转录合成IL－10的第1条链，用自己设计的特异性上下游引物进行PCR扩增，得到期望相对分子质量的PCR产物；酶切后插入pcDNA3载体，转染感受态细胞进行筛选制备，并行PCR、酶切鉴定和测序。结果：脾细胞经LPS刺激后IL－10转录水平增加，从提取的RNA转录产物中容易扩增出期望相对分子质量的PCR产物，酶切和PCR鉴定证明所得IL－10cDNA相对分子质量与其因库报告的相近，测序表明得到的IL－10cDNA充阢与基因库报告的序列完全一致，结论，大鼠的IL－10cDNA全长序被成功克隆。     

人白细胞介素-18真核表达载体的构建及测序分析

目的：构建含有人白细胞介素—18(IL-18)基因的真核表达载体，并对其进行测序分析。方法：通过分子克隆技术，将IL-18基因插入真核表达载体pVAX1中，构建真核表达载体pVAXl—IL—18，并经BamHI／EcoRI双酶切及测序鉴定。利用Blast程序，搜索NCBI GenBank中与重组质粒(pVAX1—IL—18)中编码IL-18基因同源的序列。结果：人IL—18基因成功地克隆至真核表达载体pVAX1中，pVAX1—IL—18中编码IL—18的序列与GenBank中所报道的IL-18编码序列完全—致。结论：成功地构建人IL—18基因真核表达载体，为其作为核酸疫苗的细胞因子佐剂奠定了基础。     

A versatile cloning vector facilitates target gene expression in prokaryotic and eukaryotic cells

Objective

To facilitate manipulation of gene expression in different host cells, we used pEGFP-Nl as backbone to construct a versatile vector that can drive foreign gene expression in prokaryotic and eukaryotic cells.

Methods

A cloning and expression vector, pEGFP-Nl-lac, was constructed by inserting the prokaryotic lac promoter of pUC19 into the eukaryotic expression vector, pEGFP-Nl, between the eukaryotic PCMV promoter and enhanced green fluorescent protein (EGFP) open reading frames. To assess the function of pEGFP-Nl-lac, the nucleotide sequence encoding the hepatitis C virus (HCV) core protein was cloned into the multiple cloning sites. Western blotting analysis was used to detect the expression of the HCV core protein in Escherichia coli DH5a and HepG2 cells.

Results

Restriction enzyme digestion and sequence analysis indicated that pEGFP-N1-lac was successfully constructed and the HCV core gene was cloned into this vector. The Western blotting results showed that pEGFP-N1-lac promoted expression of HCV core gene in prokaryotic E. coli DH5 and eukaryotic HepG2 cells. Conclusion: The pEGFP-N1-lac vector has been successfully constructed and functions in both prokaryotic and eukaryotic cells. The EGFP reporter can be used as an insert-inactivation marker for clone selection or as an expression tag. This vector can be used for cloning and expression of genes in both prokaryotic and eukaryotic cells, making gene cloning, expression and functional studies convenient as well as time- and labor-efficient.     

人中性粒细胞多肽1,3真核表达载体的构建与鉴定

目的：扩增人中性粒细胞多肽1，3(HNP1，3)基因片段，构建真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1，3。方法：从健康人中性粒细胞中提取总RNA，用RT-PCR方法扩增出HNP1，3基因完整的cDNA片段，应用TA克隆插入pMD18-T载体，经酶切鉴定及序列分析确证后，将其亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中。结果：从人中性粒细胞中克隆出人HNPl1，3基因，经测序分析与GenBank公布的人HNP1，3核苷酸序列同源性为100％，成功地构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1，3。结论：真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1，3的成功构建，为后续重组基因的真核／表达及其对HIV-1抑制作用的研究奠定了实验基础。     

人白细胞介素－2基因真核表达载体pDORIL－2的构建

目的：构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体．方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆人表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ．结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆人ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲＩＬ－２．结论：用ＰＣＲ扩增目的基因片断，有快速、获得量大、可改变酶切位点等优点；ｐＤＯＲＩＬ－２的构建成功，为开展基因治疗的研究打下了基础。     

人可溶性白细胞介素—6受体基因在昆虫细胞内的克隆与表达

目的：在昆虫细胞中表达人可溶性白细胞介素－6受体（sIL-6R)基因。方法：将人sIL-6R cDNA克隆至杆状病毒转移载体pAcGP67B中,再将重 组转移载体质粒与野生病毒AcNPV DNA共转染昆虫细胞sf9;经同源重组后,以终点稀释和斑点杂交法筛选重组杆状病毒;采用空斑分析法纯化重组的病毒,然后以纯化的重组病毒感染昆虫细胞Sf9。结果：斑点杂交实验证实,纯化得到的重组病毒含有人sIL-6R基因,SDS－PAGE结果显示,表达产物sIL-6R相对分子质量为47000左右,Western blot和受体配基结合实验表明,表达产物具有与其配基特异性地结合的能力,结论,杆状病毒－昆虫细胞能分泌表达sIL-6R,表达产物具有免疫活性和生物活性。     

人LIF基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆白血病抑制因子(LIF)基因,测定其序列,构建带LIF基因的真核表达载体.方法:通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从正常妊娠的子宫蜕膜组织中克隆LIF基因,与T载体连接,再酶切T-LIF载体,获得LIF基因,然后将其与质粒PCDNA3.1( )连接,构建PCDNA3.1( )-LIF真核表达载体.结果:经酶切和DNA测序证明LIF基因序列正确,载体构建成功.结论:成功克隆了LIF基因,构建了PCDNA3.1( )-LIF真核表达载体,为LIF在相应真核细胞内表达及LIF蛋白的分离纯化奠定了基础.     

人IL-26的基因克隆及其真核表达载体的构建

基因，构建其真核表达载体并探讨在真核细胞中的表达。方法：提取人外周血单个核细胞总RNA，逆转录 聚合酶链反应（RT PCR）扩增hIL 26基因；目的片段与pMD18 T载体连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α,菌落PCR、酶切分析和DNA序列分析鉴定重组克隆。用SalⅠ和EcoRⅠ将目的片段切下，插入pIRES2 EGFP的相应位点，构建表达载体pIRES2 EGFP/hIL 26并进行酶切鉴定。将重组质粒用非脂质体试剂Fugene 6转染至COS7细胞中。结果：重组克隆载体pMD18 T/hIL 26内插入片段序列与GenBank上报道的hIL 26基因序列完全一致；pIRES2 EGFP/hIL 26经酶切鉴定与预期结果一致；荧光显微镜观察可见转染后的细胞有荧光出现，Western blotting 鉴定证明hIL 26基因得到了有效表达。结论：成功构建了hIL 26基因的真核表达载体并在真核细胞中获得了有效表达。     

CDH22基因克隆及其真核表达载体的构建与表达

目的克隆人CDH22基因并构建其真核表达载体。方法设计CDH22特异性引物,提取人大肠癌细胞系SW480总RNA,用RT-PCR方法获取人CDH22cDNA,经T-A克隆,通过双酶切及测序鉴定,将CDH22克隆至pCDNA3/HA,构建人CDH22基因的真核表达载体pCDNA3/HA-CDH22,转染HEK293A细胞,用WesternBlot及免疫荧光细胞化学技术检测目的蛋白的表达。结果成功扩增出人CDH22全长cDNA,双酶切鉴定证实成功构建pCDNA3/HA-CDH22真核表达载体,测序结果表明CDH22全长cDNA与GeneBank中CDH22序列完全一致,转染HEK293A细胞后,可检测出Mr约为86KD的目的蛋白,而免疫荧光细胞化学技术也检测到蛋白表达。结论获得人CDH22基因全长cDNA并成功构建了CDH22真核表达载体,证实pCDNA3/HA-CDH22转染HEK293A细胞后可表达HA-CDH22蛋白,为深入研究CDH22基因在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。