Wnt/β连环蛋白信号在人真皮成纤维细胞表型转化中的作用及机制

目的 了解Wnt/β连环蛋白信号在人正常真皮Fb向肌成纤维细胞(MFb)表型转化中的作用及机制.方法 采用酶消化法分离培养人正常皮肤真皮Fb.(1)实验1.按随机数字表法将细胞分为4组:对照组,采用无血清DMEM培养液(以下简称培养液)培养;TGF-β1组,用含10 ng/mL重组人TGF-β1(浓度下同)的培养液培养;Wnt3a组,用含150 ng/mL重组人Wnt3a(浓度下同)的培养液培养;TGF-β1+Wnt3a组,用含重组人TGF-β1和重组人Wnt3a的培养液培养.48 h后,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法,检测Fb β连环蛋白和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA及蛋白表达水平.(2)实验2.按照随机数字表法将细胞分为4组:对照组、TGF-β1组,处理方法均同实验1;SB415286(糖原合酶激酶3β阻断剂)组,用含10 μmol/L SB415286(浓度下同)的培养液培养;TGF-β1+ SB415286组,用含重组人TGF-β1和SB415286的培养液培养.48 h后,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测Fb α-SMA的mRNA和蛋白表达水平;用免疫荧光细胞化学法检测α-SMA阳性表达情况.各项检测重复3次,对数据进行方差分析及LSD-t检验.结果 (1)实验1.①β连环蛋白的mRNA表达水平:对照组、TGF-β1组、Wnt3a组和TGF-β1+Wnt3a组Fb组间比较,差异无统计学意义(F=0.302,P=0.823).②β连环蛋白的蛋白表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=16.713,P=0.001).与对照组表达水平(0.34±0.11)相比,TGF-β1组、Wnt3a组均显著上调(0.73±0.12、0.82±0.17,t值分别为3.028、3.727,P＜0.05或P＜0.01).TGF-β1+Wnt3a组(1.23±0.21)显著高于其余3组(t值分别为6.911、3.883、3.184,P值均小于0.01).③α-SMA mRNA表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=31.830,P=0.001);与对照组相比,TGF-β1组显著上调,Wnt3a组下调(t值分别为6.759、2.535,P＜0.05或P＜0.01);TGF-β1+Wnt3a组低于TGF-β1组(t=4.532,P＜0.01).④α-SMA蛋白表达水平:对照组、TGF-β1组、Wnt3a组、TGF-β1+ Wnt3a组分别为0.83±0.17、1.43±0.20、0.53±0.12、0.89±0.14(F=16.597,P=0.001).与对照组相比,TGF-β1组显著上调,Wnt3a组下调(t值分别为4.582、2.291,P＜0.05或P ＜0.01);TGF-β1 +Wnt3a组低于TGF-β1组(t =4.123,P＜0.01).(2)实验2.①α-SMA mRNA表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=34.101,P=0.001).SB415286组明显低于对照组(t =2.511,P＜0.05),TGF-β1+SB415286组明显低于TGF-β1组(t=3.587,P＜0.01).②α-SMA蛋白表达水平:4组细胞比较,差异有统计学意义(F =11.381,P=0.003).SB415286组显著低于对照组(t=2.364,P＜0.05),TGF-β1+ SB415286组低于TGF-β1组(t=2.556,P＜0.05).③免疫荧光细胞化学法检测显示,对照组Fb α-SMA表达微弱;TGF-β1组α-SMA表达较对照组显著增强(t =11.198,P＜0.01);SB415286组表达较对照组减少,TGF-β1+ SB415286组表达较TGF-β1组显著减少(t=5.902,P＜0.01).结论 Wnt/β连环蛋白信号可能参与Fb细胞表型转化,并且对TGF-β1所介导的促转化效应起负性调控作用.     

转化生长因子-β1诱导小鼠同种异体气管移植物纤维增生的研究

目的 用小鼠异位气管移植观察核因子(NF)-κB是否激活转化生长因子(TGF)-β1基因参与诱导气管移植物纤维增生,探讨闭塞性细支气管炎(OB)的发病机制.方法 将小鼠气管移植分成同基因组和异基因组,在术后7、14、21 d取材算管腔闭塞率;对移植物行TGF-β1免疫组织化学染色;凝胶电泳迁移率改变法(EMSA)测定NF-κB活性;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TGF-β1的mRNA水平;Western blot检测TGF-β1蛋白表达.结果 和同基因组比较,异基因组气管移植物在术后14 d开始纤维增生,术后21 d管腔闭塞率达(78±9)%,呈典型OB改变;NF-κB的转录活性在术后7 d明显升高,术后14、21 d维持较高水平;OB的气管移植物TGF-β1染色阳性;TGF-β1 mRNA及蛋白表达在移植术后14、21 d明显升高,在术后7 d差异无统计学意义(P＞0.05).结论 NF-κB转录活性增强,激活TGF-β1促进纤维增生,是造成OB的重要原因.     

高糖通过转化生长因子β信号诱导肾小球内皮细胞向肌成纤维细胞转分化

目的 探讨高糖(HG)能否通过转化生长因子β(TGF-β)途径诱导大鼠肾小球内皮细胞向肌成纤维细胞转分化(EndMT).方法 体外培养大鼠肾小球内皮细胞(GEnC),分为正常对照组(NG,5.5 mmol/L)、高糖组(HG,15、30 mmol/L)、TGF-β抑制剂组(HG+LY36,30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L LY364947)以及高渗对照组(M,5.5 mmol/L葡萄糖+25.5 mmol/L甘露醇)和溶剂对照组(D,5.5 mmol/L葡萄糖+1 ml/LDMSO).采用Western印迹法检测各组细胞内皮细胞标志物claudin5和肌成纤维细胞标志物α-SMA表达变化;实时定量PCR法检测细胞TGF-β1和TGF-β2 mRNA表达改变;免疫荧光法观察细胞形态学变化以及血管内皮细胞标志物VE-cadherin和肌成纤维细胞标志物α-SMA的表达.结果 与NG组比较,HG组claudin5蛋白的表达量随葡萄糖浓度增加而降低(P＜0.05),α-SMA蛋白表达量随葡萄糖浓度增加而升高(P＜0.05),TGF-β1和TGF-β2 mRNA表达均升高(P＜0.05).与HG组比较,TGF-β抑制剂组claudin5蛋白表达量升高(P＜0.05),α-SMA蛋白表达降低(P＜0.05).高渗对照组和溶剂对照组改变差异无统计学意义.激光共聚焦免疫荧光结果显示,高糖处理可引起细胞形态由卵圆形向梭形改变,VE-cadherin表达减少,α-SMA表达增加;TGF-β抑制剂组细胞形态无明显改变.与HG组比较,TGF-β抑制剂组VE-cadherin表达增加,α-SMA表达降低(P＜0.05).结论 高糖诱导大鼠肾小球内皮细胞TGF-β表达增加及内皮细胞-肌成纤维细胞转分化.抑制TGF-β可抑制高糖引起的转分化,提示TGF-β参与了高糖引起的肾小球内皮细胞转分化过程.     

兔化疗栓塞术后肝纤维化形成中转化生长因子-β1的动态变化

目的 观察经兔肝动脉化疗栓塞(TACE)术后不同时间点肝组织转化生长因子(TGF)-β1的表达水平,探讨TGF-β1在肝纤维化形成中的作用.方法 将35只新西兰白兔随机分为3组:对照组(n=5)经胃十二指肠动脉注入生理盐水1 ml,实验1组(n=15)和实验2组(n=15)注入平阳霉素1 mg+碘油0.2 ml,2周后实验2组再次化疗栓塞.分别于第1、2、4、8周取材,并行苏木素-伊红(HE)、VG染色和TGFβ1免疫组织化学染色,进行半定量分析.结果 肝纤维化分级在第1周时实验组与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),在第2、4、8周时差异有统计学意义(P＜0.01);在第4、8周时实验2组肝纤维化的级别高于实验1组(P＜0.01).实验1组肝组织TGF-β1表达水平在第4周时最高,第8周时下降;实验2组在第2周时上升,持续到第8周实验结束,实验2组肝组织TGF-β1表达水平高于实验1组(P＜0.05).结论 经兔肝TACE术可引起肝纤维化,纤维化的程度与次数有关,肝组织TGF-β1的表达水平在TACE术后不同时间点呈动态变化.     

肝细胞生长因子下调Smurf2拮抗肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化

目的 通过观察肝细胞生长因子( HGF)对正常大鼠肾上皮细胞(NRK-52E)转化生长因子β1( TGF-β1)诱导的Smad泛素化调节因子2(Smurf2)表达的影响,探讨HGF拮抗肾小管上皮细胞-间充质细胞转分化(EMT)的分子机制.方法 以NRK-52E细胞为研究对象,给予TGF-β1(5μg/L)处理0～24 h;或部分细胞经HGF(20 μg/L)预处理30 min后,再予TGF-β1(5μg/L)处理1h或48 h;另外部分细胞予以Smurf2质粒表达载体或Smurf2 siRNA 转染24 h后,再予HGF处理24 h.应用Western印迹及间接免疫荧光染色方法检测Smurf2、SnoN、E钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤连蛋白(FN)的表达.结果 与对照组相比,TGF-β1处理后迅速上调NRK-52E细胞中Smurf2蛋白表达(P＜0.01);同时显著诱导FN和α-SMA蛋白表达,并下调E-cadherin表达.而予HGF预处理细胞后,可快速抑制TGF-β1诱导的Smurf2表达上调(P＜0.01);并逆转TGF-β1介导的SnoN(P＜0.01)、E-cadherin(P＜0.05)、α-SMA(P＜0.01)和FN(P＜0.01)表达变化.此外,在NRK-52E细胞中过表达Smurf2蛋白可部分抑制HGF诱导的SnoN蛋白上调;而抑制Smurf2表达则可进一步促进HGF诱导的SnoN蛋白表达.结论 在肾小管上皮细胞中,HGF可能通过下调Smurf2表达抑制SnoN蛋白发生泛素-蛋白酶体依赖性降解,进而拮抗TGF-β1介导EMT形成.     

HGF拮抗TGF-β1诱导腱鞘成纤维细胞α-SMA及细胞外基质合成

目的 研究HGF能否阻抑TGF-β1诱导的腱鞘成纤维细胞α-SMA及细胞外基质过度合成.方法 选取成年新西兰大白兔7只,体重3.75～4.00 kg,无菌切取前肢中趾趾深屈肌腱,进行腱鞘成纤维细胞的分离和培养,待细胞生长成单层后,以胰蛋白酶消化传代.取第3代成纤维细胞用于实验,当细胞达到70%融合时,培养液中加入TGF-β1(5 ng/ml)及HGF(10～40 ng/ml).培养72 h后,利用Westernblot检测α-SMA表达;ELISA测定细胞Ⅰ型胶原及纤维结合素的表达.结果 TGF-β1能显著诱导α-SMA表达,半定量分析提示,TGF-β1作用后的成纤维细胞α-SMA表达量是对照组的1.8倍.随HGF的同时加入,α-SMA的表达则明显受抑制(P＜0.05),且随HGF浓度的升高其阻抑作用呈逐渐增强趋势.TGF-β1同样能诱导Ⅰ型胶原及纤维结合素的表达(P＜0.01),而HGF则可以有效地阻抑其表达,其效应呈剂量依赖性(P＜0.05).结论 HGF可以有效阻抑TGF-β1诱导的腱鞘成纤维细胞α-SMA、Ⅰ型胶原及纤维结合素的表达,这为利用HGF预防和治疗屈指肌腱损伤后粘连及瘢痕在细胞和分子水平提供了依据.     

RhoA/Rho激酶信号通路在TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化中的作用

目的 观察TGF-[1对人皮肤成纤维细胞表型转化的作用是否受到RhoA/Rho激酶信号通路的影响,以探究该通路是否参与了人皮肤成纤维细胞的表型转化。方法 原代培养人皮肤成纤维细胞,将第4代细胞用TGF-β1( 10 ng/ml)刺激后,分不同作用时间(0、3、6、24h)提取细胞内总蛋白。BCA法测定总蛋白浓度,Western -blot检测α-SMA的表达水平;并用相同的方法检测不同浓度TGF-β1(0、2、10、50 ng/ml)刺激人皮肤成纤维细胞后,α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达水平。用RhoA/Rho激酶信号通路阻断剂Y-27632处理后,再用TGF-β1刺激,作为实验组,将未作处理的正常细胞作为空白对照组,Y-27632（10 μmol/L）组作为阴性对照组,只用TGF-β1( 10 ng/ml)刺激组作为阳性对照组,分别检测α-SMA的表达差异。使用ANOVA对蛋白表达量进行统计学分析,P ＜0.05为差异有统计学意义。结果 10 ng/ml TGF-β1按不同作用时间刺激人皮肤成纤维细胞后,α-SMA的表达量分别为：0h为1.0,3h为1.9+0.2、6h为2.1±0.1,24 h为3.1±0.1。24 h较其他3个时间点α-SMA表达量明显上升（n=4,P＜0.05）。不同浓度TGF-β1刺激人皮肤成纤维细胞后,α-SMA的表达量分别为：0 ng/ml为1.0,2 ng/ml为1.4±0.2,10 ng/ml为3.2±0.1,50 ng/ml为3.1±0.2。10 ng/ml表达量明显高于0 ng/ml和2 ng/ml(n =4,P ＜0.05),较50 ng/ml差异无统计学意义(n=4,P＞0.05)。用Y-27632（10 μmol/L）处理后,再用TGF-β1刺激,细胞的表型转化明显受到抑制,实验组α-SMA的表达量(1.2±0.2)较阳性对照组(2.9±0.1)明显降低(n=5,P ＜0.05),与空白对照组(1.0)和阴性对照组(1.1±0.1)相比差异均无统计学意义(n=5,P＞0.05)。结论 RhoA/Rho激酶信号通路参与了 TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化过程。     

己酮可可碱对大鼠胰腺纤维化及TGF-β1、α-SMA、MMP-1、TIMP-1表达的影响

目的探讨己酮可可碱(PTX)对大鼠胰腺纤维化及TGF-β1、α-SMA、MMP-1、TIMP-1表达的影响。方法通过胰管内注射2%三硝基苯磺酸的方法制备大鼠胰腺纤维化模型。随机分为对照组、模型组、PTX干预组。PTX干预组于术后第2天给予PTX腹腔注射,6mg/(kg·d),4周后收集各组胰腺标本。免疫组化SABC法检测各组胰腺组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)的表达同时做组织胶原纤维染色。部分胰腺组织液氮冻存,以Westernblot方法检测α-SMA的表达。结果模型组发生胰腺纤维化,PTX干预组有轻度纤维化。PTX干预组α-SMA、TGF-β1、TIMP-1的表达均低于模型组(P<0.01)。MMP-1的表达无明显差异。PTX干预组胶原面积百分比明显低于模型组(P<0.01)。结论PTX抗大鼠胰腺纤维化的作用可能与其降低TGF-β1、α-SMA、TIMP-1表达有关。     

川芎嗪联合丹参延缓肾移植大鼠慢性移植肾肾病进程的作用

目的 研究川芎嗪(TMP)联合丹参延缓肾移植大鼠慢性移植肾肾病进程的作用及机制.方法 以Fisher 344大鼠和Lewis大鼠分别作为肾移植的供、受者进行原位肾移植,并建立CAN模型.按随机数字表法将受鼠分为5组:环孢素A(CsA)组(A组),TMP+ CsA组(B组)、丹参+ CsA组(C组)、TMP+丹参+CsA组(D组)及空白对照组(E组,术使用任何药物).分别于术后2、4、6、8和12周,处死每组5只受鼠,取移植肾进行移植肾组织病理学变化,采用免疫组织化学法检测移植肾组织转化生长因子β1(TGF-β1)的表达,采用荧光定量聚合酶链反应法检测移植肾组织TGF-β1 mRNA的表达.结果　术后空白对照组受鼠的存活时间均未超过2周.A组于术后4周时最早出现CAN病理改变,B组和C组出现CAN病理改变的时间较A组晚,D组出现CAN病理改变的时间最晚,且病理改变程度最轻.术后各组Banff评分均呈现明显的上升趋势,相同时间点,A组明显高于其他3组(P＜0.05和P＜0.0 1),D组明显低于与B组和C组(P＜0.05),而B组与C组间无显著差异(P＞0.05).随着术后时间的推移,各组TGFβ1表达强度呈逐渐增加的趋势,相同时间点,A组TGF-β1表达强度最高,与其他3组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05和P＜0.01),D组明显低于B组和C组(P＜0.05),B组与C组间无明显差异(P＞0.05).各组TGF-β1 mRNA表达的变化趋势及组间差异与TGF-β表达强度的情况相一致.结论 TMP或丹参均具有通过下调TGF-β1 的表达延缓肾移植大鼠CAN进程的作用,当两者联合应用时作用更为明显.     

TGF-β/Smad介导上皮细胞间质转化在气管移植后移植体狭窄中的机制研究

目的探讨TGF-β/Smad信号通路介导的上皮细胞间质转化在气管移植后移植体狭窄中的作用机制。方法将50只体重180~220 g雄性大鼠随机均分为2组,取未移植大鼠气管为对照组,实验组为经体重匹配的Wistar-SD大鼠行气管原位移植术后大鼠。两组分别于术后第3、7、10、14、35、90天处死大鼠,获取移植体标本。应用HE染色测量计算纤维化率检测气管狭窄程度;应用免疫组织化学染色检测移植体内上皮细胞间质转化相关分子上皮粘附分子(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达量以及移植体内上皮细胞间质转化信号通路磷酸化(p-Smad2/3)蛋白表达量和相关转录因子(ZEB1)、Snail1表达量。结果 HE染色示对照组气管纤维化率为0.171±0.020,移植组术后气管纤维化率显著高于对照组(0.537±0.013,P0.01)。免疫组织化学提示移植组术后移植体中vimentin表达阳性的上皮细胞显著增多(P0.05),上皮细胞中E-cadherin表达量明显减少(P0.05)。移植组术后移植体内TGF-β1较对照组表达量明显增多(P0.05),术后p-Smad2/3表达量较对照组明显增加(P0.05),转录因子ZEB1、Snail1在移植体内高表达(P0.05)。结论气管移植后移植体在术后第3 d即出现狭窄,其狭窄的机制可能与上皮细胞间质转化有关,同时其受到TGF-β/Smad信号通路以及转录因子ZEB1、Snail1的调节。     

γ-干扰素对梗阻性积水肾间质纤维化的治疗作用

目的 探讨γ干扰素(IFN-γ)对梗阻性肾积水肾间质纤维化的抑制作用及其可能的机制.方法 将65只雄性SD大鼠随机分成4组:治疗组(20只)、模型组(20只)、药物对照组(20只)、假手术组(5只).在建模和给药后的第3、7、14、21、28天,每组各随机处死动物4只(假手术组1只).采用苏木素-伊红(HE)和Masson染色观察病变肾脏间质纤维化的情况;采用聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测肾组织中转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)的mRNA表达情况;免疫组织化学法观察以上三种蛋白的变化.结果 模型组大鼠术后肾间质逐渐出现纤维化改变,并随梗阻时间的延长逐渐加重,TGF-β1、α-SMA和Col-Ⅰ的mRNA和蛋白表达亦逐渐升高.第14天,模型组TGF-β1和α-SMA的表达量达到高峰,28 d时各指标的表达均达到最高,TGF-β1、α-SMA和Col-Ⅰ分别为51.84%、72.59%和68.73%.治疗组各指标在不同时间点均低于模型组,第28天时,三项指标依次为33.84%、32.59%和48.73%,与模型组比较P＜0.05.Banff评分显示治疗组间质纤维化程度明显减轻(P＜0.01).其余两组未见肾间质纤维化改变.结论 IFN-γ具有减轻积水后肾间质纤维化程度的作用,该作用与其下调TGF-β1的表达、抑制肌成纤维细胞(MyoF)激活和减少Col-Ⅰ生成有关.     

丹参抑制转化生长因子-β1诱导的肌源性干细胞向肌成纤维母细胞分化

目的 观察丹参对失神经骨骼肌肌源性干细胞(MDSCs)向肌成纤维母细胞分化的抑制作用.方法 采用差速贴壁法分离出大鼠失神经骨骼肌MDSCs,加入转化生长因子-β1(TGF-β1)和丹参进行干预,将细胞分为3组:A:对照组;B:10 μg/L TGF-β1组;C:10 μg/L TGF-β1+ 150 mg/L丹参组.荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot检测各组细胞在干预后5个时间点α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白(Vimentin) mRNA和蛋白表达.结果 与A组比较,B组和C组细胞α-SMA、Vimentin的mRNA在干预后第2、3、5、7天均明显升高(P＜0.05),其蛋白表达在干预后第3、4、6、8天亦显著升高(P＜0.05);与B组比较,C组细胞α-SMA、Vimentin的mRNA和蛋白在对应时间点均明显降低(P＜0.05).结论 丹参能抑制TGF-β1诱导的失神经骨骼肌MDSCs向肌成纤维母细胞的分化.     

Smad核转录共抑因子在人近端小管上皮细胞转分化中的表达及作用

目的：观察Smad核转录共抑因子（SnoN）在TGF-β1致人近端小管上皮细胞转分化过程中的表达,探讨SnoN蛋白对TGF-β1所致的小管上皮细胞转分化的作用。方法：体外培养的人近端小管上皮细胞（HK-2）,随机分为正常对照组、TGF-β1（5ng/ml）组和TGF-β1（5ng/ml）＋MG-132（5μmol/ml）组。Western-blot检测细胞中SnoN蛋白水平的改变和Smad2/3磷酸化水平的改变;半定量RT-PCR方法观察细胞中SnoN mRNA表达的改变。免疫荧光检测间充质细胞标记物α-SMA的表达。结果：Western-blot的结果显示：（1）TGF-β1作用于细胞,SnoN蛋白表达迅速减少,10min为对照组的38%,并呈时间依赖进行性减少,60min较0min降低89%（P〈0.01）,24h有所恢复但仍较0min明显降低（P〈0.01）;TGF-β1＋MG-132组中SnoN蛋白表达与对照组差异无统计学意义,与TGF-β1组相比,SnoN蛋白水平明显上调。（2）半定量RT-PCR显示：TGF-β1作用于细胞后,与SnoN蛋白表达不同,SnoN mRNA迅速升高,60min其表达增高近1倍（与0min比较,P〈0.01）;TGF-β1＋MG-132组中SnoNmRNA的表达与TGF-β1组差异无统计学意义。（3）TGF-β1诱导细胞10min即可引发Smad2/3磷酸化（与0min比较,P〈0.01）,随着作用时间的延长,细胞中磷酸化的Smad2/3蛋白表达水平逐渐升高,TGF-β1＋MG-132组中,Smad2/3磷酸化蛋白的表达减少80%（P〈0.01）。（4）TGF-β1作用于细胞24h后免疫荧光检测到重新表达的α-SMA,TGF-β1＋MG-132组α-SMA的表达被抑制。结论：TGF-β1可诱导SnoNmRNA表达上调,但SnoN蛋白的表达遭遇泛素系统的降解显著减少,SnoN蛋白水平的下调可能是TGF-β1导致小管上皮细胞纤维化作用的必要条件。     

TGF-β1mRNA与大鼠小肠同种异体移植急性排斥反应的关系

目的:研究TGF-β1mRNA与大鼠小肠同种异体移植急性排斥反应的关系.方法:试验分2组,Ⅰ组:Wistar→SD小肠移植;Ⅱ组Wistar→SD小肠移植 CsA.术后3,5,7d观察病理学改变并用半定量RT-PCR方法检测IFN-γ、IL-2、TGF-β1mRNA.结果:病理改变:Ⅰ组术后3d出现排斥反应,7d最重,Ⅱ组术后7d部分出现轻度排斥反应.Ⅰ组IFN-γ、IL-I mRNA术后明显增高,Ⅱ组术后略升高,两者相比差异有统计学意义(P＜0.01).Ⅰ组TGF-β1mRNA术后增高,Ⅱ组TGF-β1mRNA术后增高大于Ⅰ组,两者差异有统计学意义(P＜0.01).结论:TGF-β1mRNA转录水平增高可抑制大鼠小肠移植急性排斥反应.     

UC001kfo对肝癌细胞细胞骨架蛋白表达的调控效应

目的 观察新基因UC001 kfo对肝癌细胞细胞骨架蛋白表达的调控效应.方法 以肝癌细胞株HepG2为细胞模型,采用脂质体转染技术分别将UC001kfo-pCDNA和pCDNA转染至HepG2细胞内,分为UC001 kfo-pCDNA、pCDNA、HepG2组,每组设3个复孔,实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测UC001 kfo、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA表达,免疫组织化学及积分吸光度(IA)分析α-SMA的表达.结果 Real-time PCR结果显示48 h后UC001kfo表达量在UC001 kfo-pCDNA组、pCDNA组、HepG2组分别为1 924.14±238.69、1.87 ±0.43、1.00±0.29,UC001 kfo-pCDNA组与阴性对照组和空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);α-SMA表达量分别为6.81 ±1.39、0.82±0.14、1.00±0.54,UC001 kfo-pCDNA组与阴性对照组和空白对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.01).48 h UC001kfo-pCDNA、pCDNA、HepG2组IA值分别为972.53±59.10、623.11±57.66、697.98±51.29,UC001 kfo-pCDNA组与阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),与空白组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 UC001 kfo上调α-SMA的表达,促进肝癌细胞的侵袭转移.     

骨成形蛋白-7在大鼠肾小管间质损害中的作用

目的观察单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠中骨成形蛋白-7(BMP-7)在肾小管间质中的表达部位、动态变化及其与肾小管间质损害的关系。方法60只Wistar大鼠随机分为正常大鼠组、假手术组和单侧输尿管梗阻组,分别于术后1d、3d、7d、14d处死。采用RT-PCR方法检测BMP-7mRNA、TGF-β1.mRNA表达水平,免疫组化方法检测肾小管间质中BMP-7、TGF-β1、α-SMA的蛋白定位、表达及其与输尿管梗阻后肾小管间质损害的关系。结果与对照组相比,BMP-7mRNA于术后第1天即出现表达下降并随梗阻时间延长递减;而TGF-β1mRNA则随梗阻时间延长而递增(P均<0.05)。BMP-7蛋白在对照组中高度表达,主要分布在肾小管及肾间质,肾小球内基本无表达。在梗阻组随着肾间质损害的加重,BMP-7蛋白表达呈进行性下降,第14天表达量最弱,几乎没有明显的阳性表达,而TGF-β1、α-SMA蛋白表达则逐渐增加(P均<0.01)。BMP-7与TGF-β1蛋白表达阳性面积成显著负相关(r=-0.875,P<0.05)。BMP-7与α-SMA蛋白表达阳性面积亦成显著负相关(r=-0.843,P<0.05)。结论BMP-7于肾小管间质病变早期即出现表达下调,早于肾间质纤维化的出现,其表达量与肾间质TGF-β1、α-SMA表达负相关且随间质病变进展进行性下降。BMP-7表达下调可能参与介导肾小管间质损害的发生发展。     

肿瘤坏死因子-α对急性肝衰竭小鼠肠黏膜通透性的影响及微生态制剂的保护作用

目的 研究急性肝衰竭小鼠生化指标及肠黏膜通透性改变,并探讨双歧杆菌乳杆菌三联活菌对肠黏膜通透性影响的机制及其对肝脏的保护作用.方法 采用数字表法将30只健康清洁级6～8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为对照组、急性肝衰竭(ALF)组和微生态制剂双歧杆菌乳杆菌三联活菌干预组(干预组),每组各10只.干预组予双歧杆菌乳杆菌三联活菌(900 mg·kg-1·d-1)灌胃,对照组及ALF组予等量等渗盐水灌胃(9 mL·kg-1 ·d-1).2周后ALF组和干预组腹腔注射D-氨基半乳糖(3.0 g/kg),建立肝衰竭模型.注射后9h处死小鼠,留取血清、血浆观察生化指标.采用实时荧光定量PCR检测肝组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA和回肠组织紧密连接蛋白(ZO)-1 mRNA的表达,采用免疫印迹检测回肠组织中ZO-1蛋白的表达.采用单因素方差分析或Kraskal-Wallis秩和检验比较各组间生化指标、TNF-α mRNA、ZO-1 mRNA以及ZO-1蛋白表达的差异,并采用Pearson检验分析ZO-1蛋白与血清TNF-α和血浆内毒素之间的相关性.结果 ALF组小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、TNF-α及血浆内毒素水平均明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01);干预组上述指标均较ALF组明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01).ALF组小鼠肝组织TNF-α mRNA表达明显高于对照组,差异有统计学意义(Z =4.038,P＜0.01);干预组表达量较ALF组明显下降,差异有统计学意义(Z =3.780,P＜0.01).ALF组小鼠回肠ZO-1mRNA/蛋白表达均明显低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01);干预组表达量较ALF组明显增加,差异有统计学意义(P＜0.01).各组小鼠回肠ZO-1蛋白与血清TNF-α和血浆内毒素水平均呈负相关(r=-0.946和-0.919,P＜0.01).结论 TNF-α可能是导致肠黏膜通透性升高的原因之一.双歧杆菌乳杆菌三联活菌既能通过减轻内毒素对肝脏的损害而发挥保肝作用,又能上调回肠ZO-1蛋白的表达以改善肠黏膜通透性.     

CIP4对转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化的影响

目的 观察骨架调节蛋白CIP4（Cdc42 interacting protein 4）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化（EMT）的影响,并探讨其产生的机制。 方法 10 ?滋g/L TGF-β1刺激72 h诱导人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）向间充质转分化。Western印迹法检测各组细胞内E-cadherin和α-SMA蛋白的表达。倒置显微镜观察细胞形态的变化。根据GenBank人CIP4的完全cDNA序列,设计1条特异性干扰CIP4表达的RNA片段（CIP4-siRNA）和含野生型CIP4的重组真核表达质粒（pcDNA3.1-hCIP4）,利用lipofactamine 2000将其转染HK-2细胞。Western 印迹法检测对照组、TGF-β1刺激组、CIP4-siRNA转染组、pcDNA3.1-CIP4转染组细胞内CIP4、E-cadherin和α-SMA蛋白的表达,共聚焦显微镜观察 E-cadherin和α-SMA蛋白的分布改变;用PI3K-Akt特异性抑制剂渥曼青霉素（wortmannin） 1 μmol/L干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,Western 印迹法检测对照组和干预组CIP4表达的变化。 结果 TGF-β1干预后HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,细胞形态由典型的上皮细胞向肌成纤维细胞转变,表明TGF-β1诱导肾小管上皮细胞EMT模型成功。CIP4-siRNA抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞表达CIP4后,E-cadherin蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,部分逆转了上述TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT。pcDNA3.1-hCIP4转染使CIP4高表达后,HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,诱导了肾小管上皮细胞EMT。用渥曼青霉素干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,CIP4可能蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）。 结论 TGF-β1通过PI3K-Akt途径上调CIP4表达,CIP4可能进一步参与TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT过程。     

血管紧张素1-7对糖尿病大鼠肾小管间质纤维化的影响

目的 研究血管紧张素1-7(Ang1-7)对糖尿病大鼠肾小管间质纤维化的影响及其可能机制.方法 32只雄性Wistar大鼠被随机分为4组:健康对照组(NC组)、模型组(DM组)、替米沙坦组(TM组)、治疗组(T组).建模成功后第9周末检测各组大鼠24 h尿蛋白量、尿NAG/Cr、血糖、血胰岛素、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、BUN、Scr、血K+及血Na+ ;PAS染色观察肾脏病理改变 ;实时定量PCR法检测各组大鼠肾脏组织中转化生长因子β1(TGF-β1)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA水平 ;Western印迹法检测PPARγ、α-SMA、TGF-β1蛋白表达.结果 (1)第9周末,DM组大鼠血压、尿蛋白量、肾质量/体质量较NC组显著升高(P＜0.05),TM组及T组较DM组显著降低(P＜0.05),且T组变化更明显.(2)DM组第9周末肾间质损伤指数显著高于NC组(P＜0.05),TM组及T组则低于DM组(P＜0.05).(3)实时定量PCR结果显示,DM组TGF-β1、α-SMAmRNA水平显著升高(P＜0.05),PPARγ mRNA水平显著下降(P＜0.05),TM组及T组较DM组TGF-β1、α-SMA mRNA水平均显著下降(P＜0.05),PPARγ mRNA水平显著上升(P＜0.05),且T组变化更明显.(4)Western印迹结果显示,DM组TGF-β1、α-SMA蛋白水平显著升高(P＜0.05),PPARγ蛋白水平显著下降(P＜0.05),TM组及T组较DM组TGF-β1、α-SMA蛋白水平均显著下降(P＜0.05),PPARγ蛋白水平显著上升(P＜0.05),且T组变化更明显.结论 Ang1-7在体内可通过上调PPARγ表达,抑制α-SMA表达,对糖尿病大鼠肾小管间质纤维化可能具有抑制作用.     

并发闭塞性细支气管炎的移植气管组织中核因子κB和肿瘤坏死因子的表达及意义

目的 探讨小鼠移植气管组织中核因子κB(NF-κB)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达及其在闭塞性细支气管炎(OB)中的作用.方法 实验分为实验组和同系移植对照组,实验组受者为C57BL/6小鼠,同系移植对照组受者为Balb/c小鼠,供者均为Balb/c小鼠.将2支供者气管分别移植于受者两侧背部,术后7、14、21 d 2组分别处死受者7只,取移植气管,于光学显微镜下观察并计算移植气管截面的管腔闭塞率.用免疫组织化学法和Western印迹法检测移植气管组织中NF-κB和TNF-α的表达;用凝胶电泳迁移率改变法检测NF-κB的转录活性;用逆转录聚合酶链反应法检测TNF-α mRNA的表达.结果 实验组移植后14 d和21 d时的管腔闭塞率分别为(31±7)%和(80±17)%,并可见移植气管发生OB病理改变,而同系移植对照组未见此改变.免疫组织化学法和Western印迹法结果均显示.实验组各个时点移植气管组织中NF-κB和TNF-α的表达均高于同系移植对照组.实验组移植后7、14和21 d时,NF-κB基冈的转录活性分别为1.35±0.52、1.72±0.43和2.43±0.33,均高于同时点同系移植对照组的转录活性(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05);实验组各时点TNF-α mRNA的表达均高于同系移植对照组(P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05).结论 发生OB的小鼠移植气管组织中NF-κB出及其下游靶基因TNF-α的表达升高.