外源性p21WAF1/CIP1基因转染对人胶质瘤细胞生长和细胞周期的影响

目的：探讨外源性p21^WAF1／CIP1基因对胶质瘤细胞生长和细胞周期的影响．方法：采用脂质体介导法将p21^WAF1／CIP1基因质粒转导人人胶质瘤细胞系SHG44细胞，然后用电镜、流式细胞仪等技术对细胞形态、生长及细胞周期进行观察。结果：酶切电泳和斑点杂交显示p21^WAF1／CIP1基因成功的转染至SHG44细胞。转染p21^WAF1／CIP1基因的细胞光镜及电镜下可见凋亡产生；生长速度明显慢于亲代细胞，其倍增时间约是对照细胞的二倍；细胞周期发生明显改变，G1期明显增多，S期明显减少．结论：外源性p21^WAF1／CIP1基因对SHG44细胞的生长和细胞周期有明显的抑制作用，并可诱导细胞凋亡产生。     

重组腺病毒介导P21WAF1/CIP1诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的体外实验研究

目的：研究基因转移P21^WAF1/CIP1过量表达对人脑胶质瘤细胞凋亡的影响。方法：构建缺陷型重组腺病毒载体：在CMV启动子控制下的p21 cDNA(Ad-P21)，其编码人P21蛋白。通过流式细胞仪，RT－PCR进行P21表达检测；应用TUNEL法，荧光显微镜和流式细胞仪进行相关凋亡检测，分析。结果：RT－PCR检测5株亲本胶质瘤细胞表达p21 cDNA，而流式细胞仪未检测到P21表达；Ad-P21转染的胶质瘤细胞株均过量表达P21；在体外通过细胞形态学，分子生物学检测均证实Ad-P21能诱导胶质瘤2细胞向终末分化并诱导细胞凋亡。结论：基因转移P21^WAF1/CIP1为研究基因治疗恶性脑胶质瘤提供了有效的手段。     

miR-18b-5p调控WWOX对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响

目的研究miR-18b-5p对胶质瘤U251细胞增殖、凋亡的影响和潜在的分子机制。方法qRT-PCR检测癌旁组织和胶质瘤组织中miR-18b-5p的表达,MTT法和流式细胞术检测胶质瘤U251细胞增殖和凋亡率,Western blotting检测包含WW域的氧化还原酶基因（WWOX）、Cyclin D1、p21、Bax和Bcl-2蛋白表达,双荧光素酶报告系统验证miR-18b-5p和WWOX的调控关系。结果与癌旁组织相比,胶质瘤组织中miR-18b-5p的表达量升高（P < 0.01）。抑制miR-18b-5p表达可以抑制胶质瘤U251细胞增殖并促进细胞凋亡;miR-18b-5p靶向负调控WWOX的表达;过表达WWOX可抑制U251细胞增殖并诱导细胞凋亡;抑制WWOX表达逆转了抑制miR-18b-5p表达对U251细胞增殖、凋亡的影响（P < 0.01）。结论miR-18b-5p可能通过靶向调控WWOX表达抑制胶质瘤U251细胞增殖并诱导细胞凋亡,miR-18b-5p是胶质瘤潜在的分子靶点。     

HIF—la asODN转染的树突状细胞对胶质瘤细胞生长的影响

目的研究缺氧诱导因子-1a（HIF-1a）反义寡核苷酸（asODN）转染的树突状细胞（DC）与U251胶质瘤细胞融合后的抗胶质瘤活性。方法将HIF-1a asODN利用脂质体包裹转染DC,采用PEG化学融合方法将DC与U251胶质瘤细胞融合,通过MTT法及流式细胞仪检测胶质瘤细胞凋亡率。结果HIF-1a asODN转染DC组与各对照组相比细胞增殖下降,凋亡增加（P〈0．01）。结论HIF-1a asODN转染DC后,再与U251胶质瘤细胞融合能够比单纯使用HIF-1a asODN转染U251细胞或单纯使用DC细胞取得更好的抑制胶质瘤细胞生长及促进其凋亡的效果。     

转染p21^WAF1／CIP1对肾癌细胞系GRC—1促凋亡作用

研究转染ｐｗｑ＾２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１对肾癌失足 凋亡作用。方法：采用脂质体介导的逆录病毒载体将ｐ２１＾ＷＡＦ１／ＣＩＰ１转入无Ｐ２１蛋白表达的肾癌细胞ＧＲＣ－１中,通过是,流式细胞仪,ＤＮＡ梯电泳检测细胞凋亡。结果：电镜检测到凋亡细胞,ＤＮＡ电泳呈梯状。所检测细胞中１５．３％出现凋亡。结论：ｐ２１＾ＷＡＦ１／ＣＩＰ１过表达有促进ＧＲＣ－１细胞凋亡作用。     

脑胶质瘤p16基因转染对细胞生长及放射敏感性的影响

目的　探索p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及p16基因与肿瘤细胞放射敏感性间的关系。方法　将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞株U251、C6,筛选阳性克隆。同时以空载体质粒pCDNA3为对照,免疫组化检测p16基因表达,用MTT法测定细胞生长曲线及肿瘤杀伤率。结果　转染p16基因的U251、C6细胞有外源p16基因的整合及表达,克隆形成率减少,生长速度明显减慢,对辐射的敏感性增强。结论　导入外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖,提高胶质瘤细胞对辐射的敏感性。     

The Effects of Wild-type p5 3Gene Transfection on the Growth and Chemotherapeutic Sensitivity of Human Glioma Cells

In gliomas,p5 3 mutations are among the mostfrequently observed genetic findings[1] .As a tu-mor- suppressor gene,p5 3 mutations can lead touncontrolled cell proliferation[2 ] . It was reportedthat loss of wild- type p5 3 function decreased sensi-tivity of tumor cells to chemotherapy[3 ] . In thisstudy,wild- type p5 3 gene was delivered into hu-man glioma cell line U2 5 1 by using liposome- medi-ated transfection technique to observe the effects ofp5 3 gene treatment and combined treatment of …     

p16基因对脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的影响

目的探索ｐ１６基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及其与脑胶质瘤细胞顺铂化疗敏感性的关系。方法采用脂质转染的方法．将外源野生型ｐ１６基因导入胶质瘤细胞株Ｕ２５１,观察ｐ１６基因长期稳定转染对胶质瘤细胞的作用,并筛选阳性克隆。同时以空载体质粒ＰＣＤＮＡ３为对照。免疫组化、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测ｐ１６基因表达,对转染后细胞生长情况、细胞周期及细胞对顺铂（ｃｉｓ－ｄｉａｍｍｉｎｅｄｉｃｈｌｏｒｏｐｌａｔｉｎｕｍ,ＣＤＤＰ）敏感性的变化进行分析。结果外源ｐ１６基因的高水平表达显著掏了胶质瘤Ｕ２５１细胞的生长,克隆形成率减少,克隆形成率减少,肿瘤细胞发生了Ｇ１期阻滞,同时,细胞对顺铂的敏感性降低,化疗药物诱导的凋亡细胞数减少。结论外源野生型ｐ１６基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖,同时降低Ｕ２５１细胞对顺铂的化疗敏感性。ｐ１６基因转染后对顺铂诱导凋亡作用的抑制可能是其主要机制。     

RNA干扰沉默Bmi-1基因观察胶质瘤细胞凋亡状况的初步研究

目的:初步探讨Bmi-1基因对胶质瘤细胞凋亡状况的影响?方法:采用siRNA技术干扰沉默U251胶质瘤细胞中Bmi-1基因,RT-PCR法检测干扰效果,流式细胞仪检测U251细胞的凋亡状况, one way ANOVA 和t检验进行统计学分析?结果:RT-PCR显示U251细胞RNA干扰组Bmi-1 mRNA凝胶电泳条带呈弱阳性, 阴性对照组和未处理组Bmi-1 mRNA条带呈强阳性,灰度比统计分析,差异具有统计学意义,siRNA可以明显降低U251细胞中Bmi-1基因的表达;流式细胞仪显示干扰组U251细胞的凋亡率为(32.53±6.33)%,高于阴性对照组的凋亡率(21.91±5.63)%,统计分析其差异具有统计学意义?结论:Bmi-1基因可以抑制胶质瘤细胞的凋亡,有可能促进了胶质细胞瘤的发生?发展?     

转染TRIM29-siRNA对胶质瘤U87MG细胞周期和凋亡的影响

目的：探讨转染三结构域蛋白（TRIM）家族成员三结构域蛋白29（TRIM29）-siRNA对胶质瘤U87MG细胞周期和凋亡的影响,阐明TRIM29在胶质瘤发生发展中的作用。方法：将体外培养的U87MG细胞分为对照组（未转染）、NC-siRNA组（转染阴性对照NC-siRNA）和TRIM29-siRNA组（转染TRIM29-siRNA）,采用实时荧光定量PCR法检测3组U87MG细胞中TRIM29 mRNA表达水平,流式细胞术检测3组不同细胞周期U87MG细胞百分率和凋亡率,Western blotting法检测3组细胞中TRIM29、CyclinD1、P21、Bcl-2和Bax蛋白表达水平。结果：3组细胞中TRIM29、CyclinD1、P21、Bcl-2和Bax蛋白表达水平,TRIM29 mRNA表达水平,G₀/G₁期、S期、G₂/M期U87MG细胞百分率及细胞凋亡率比较差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组比较,NC-siRNA组U87MG细胞中TRIM29 mRNA和TRIM29、CyclinD1、Bcl-2蛋白表达水平和G₁/G₀期、S期、G₂/M期U87MG细胞百分率及细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）;与对照组和NC-siRNA组比较,TRIM29-siRNA组U87MG细胞中TRIM29 mRNA和TRIM29、CyclinD1、Bcl-2蛋白表达水平以及S期和G₂/M期U87MG细胞百分率均明显降低（P<0.05）,G₀/G₁期U87MG细胞百分率和细胞凋亡率以及P21、Bax蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。结论：转染TRIM29-siRNA可诱导U87MG细胞周期阻滞和凋亡,其作用机制可能与下调CyclinD1、Bcl-2蛋白表达和上调P21、Bax蛋白表达有关。     

白介素-24抑制胶质瘤细胞生长的体内外实验研究

目的探讨白介素-24基因转染对胶质瘤生长的影响。方法将载有人白介素-24eDNA的新型重组腺病毒（Ad5F35-IL24）感染人胶质瘤细胞系U251，体外观察Ad5F35-IL24对该细胞系生长的影响；建立人胶质瘤动物模型，瘤内注射Ad5F35-IL24，观察肿瘤生长情况；用流式细胞仪检测其凋亡和Bax／Bel-2的表达情况。结果Ad5F35-IL24感染U251细胞和肿瘤组织后，IL-24蛋白高表达，U251细胞和组织的生长受到明显抑制，其凋亡率明显升高，Bax／Bel-2也明显升高。结论白介素-24具有抑制人胶质瘤细胞系U251生长和诱导凋亡作用。Ad5P35-IL24转导白介素-24基因可能是一种有效的胶质瘤基因治疗途径。     

shRNA靶向干扰PRDXⅢ对人胶质瘤细胞株U251的影响

目的探讨PeroxiredoxinsⅢ(PRDXⅢ)基因对人胶质瘤细胞株U251体外增殖和凋亡的影响。方法将U251细胞分为空白对照组、空载体转染组、无关序列转染组和干扰组。利用脂质体将PRDXⅢ干扰片段转染胶质瘤细胞株U251,RT-PCR及Western blot检测转染后PRDXⅢmRNA及蛋白的表达水平,流式细胞仪(FCM)、DNA ladder、PI染色检测转染后细胞的凋亡状况,四甲基偶氮唑盐(MTT)检测转染后U251细胞的生长抑制率。结果转染后干扰组PRDXⅢmRNA及蛋白的表达水平明显降低,抑制率分别为76.0%和63.9%。DNA ladder显示干扰组出现明显梯形电泳条带。PI染色结果显示干扰组细胞核的染色质高度浓染色,部分细胞核裂解为碎块。空白对照组、空载体转染组、无关序列转染组和干扰组细胞凋亡率分别为(2.26±0.64)%、(2.68±0.74)%、(3.54±0.62)%和(35.90±4.85)%,干扰组细胞凋亡率明显高于其他各组(P=0.00)。干扰组U251细胞生长抑制率为44.40%。结论 PRDXⅢ靶向干扰能够显著抑制U251细胞株增殖,增加其凋亡。     

Effect of Wild-type p53 Gene Transfection on the Growth and Radiotherapeutic Sensitivity of Human Glioma Cells

Ingliomas,p53mutationsareamongthemostfrequentlyobservedgeneticfindings[1].Asatumorsuppressorgene,p53mutationcanleadtouncon trolledcellproliferation[2].Itwasreportedthattransfectionofwild typep53genemayenhancetheradiosensitivityoftumorcellscontainingwild typep53[3].Inthisstudy,wild typep53genewasde liveredintohumangliomacelllineU251byusingliposome mediatedtransfectiontechniquetoob servetheeffectofp53genetreatmentandcom binedtreatmentofp53andirradiationtherapyongliomacell.1MATERIALSANDMET…     

反义p21WAF1/CIP1基因转染对肾癌细胞凋亡抑制作用的影响

目的 探讨p21^WAF1/CIP1基因在顺铂诱导的GRC-1肾癌细胞凋亡过程中的作用。方法 使用脂质体转染方法将正义p21^WAF1/CIP1基因及反义p21^WAF1/CIP1基因基因分别导入GRC-1肾癌细胞系中，对所获转染细胞进行形态学观察和流式细胞仪检测。结果 在正义p21^WAF1/CIP1基因基因转染后GRC-1肾癌细胞中，顺铂诱导细胞凋亡的作用增强；在反义p21^WAF1/CIP1基因基因转染后GRC-1肾癌细胞中，顺铂诱导细胞凋亡的作用受到抑制。结论 在GRC-1肾癌细胞中，顺铂诱导的细胞凋亡至少部分是通过p21^WAF1/CIP1基因基因发挥作用。p21^WAF1/CIP1基因基因作为一个与细胞凋亡的相关基因可能参与肾癌细胞凋亡的调控。     

Genistein对胶质瘤细胞株U251MG作用的研究

目的探讨Genistein对胶质瘤细胞株U251MG的作用。方法采用光镜和倒置显微镜观察Genistein对胶质瘤细胞株U251MG生长的影响,并用流式细胞仪检测Genistein对U251MG细胞凋亡的影响。结果 Genistein在25μg/mL和50μg/mL作用48 h后,对U251MG细胞生长均有抑制作用,凋亡率均较对照组显著增加（P〈0.01）,并呈剂量依赖性。结论 Genistein既可以抑制U251MG细胞增殖,又可以诱导其凋亡。     

格尔德霉素对胶质瘤细胞增殖及相关基因表达的影响

目的：研究格尔德霉素（GDM）对肝细胞生长因子（HGF）引起的胶质瘤细胞增殖及相关基因表达的影响。方法：选用人恶性胶质瘤细胞系U251 MG和U87 MG,应用HGF作用24 h后,分别加入不同浓度的GDM再处理48 h。MTT法检测细胞增殖及抑制,分组为：正常细胞组、HGF组、GDM组、HGF+GDM组和紫杉醇组,其中HGF为终浓度30 μg•L^-1,GDM为50、250、500与1 000 nmol•L^-1,紫杉醇为60 μg•L^-1;RT-PCR法检测HGF及c-Met基因的表达,分组如上,GDM为1　000 nmol•L^-1。结果：HGF作用U251 MG与U87 MG细胞24 h后,细胞增殖率分别为0.139±0.070与0.242±0.167,而50、250、500与1 000 nmol•L^-1 GDM对U251 MG和U87 MG生长具有抑制作用,抑制率分别为0.029±0.028、0.027±0.017、0.312 ±0.084和0.339±0.047与0.116±0.069、0.222±0.191、0.269±0.056和0.276±0.031;而紫杉醇对U251 MG和U87 MG细胞的抑制率分别为0.075±0.062与0.071±0.044;RT-PCR结果显示,HGF组HGF与c-Met表达较正常组增加（P<0.05）,而HGF+GDM组则较HGF组明显降低（P<0.05）。结论：GDM能抑制HGF诱导的胶质瘤细胞增殖,并且能从基因水平抑制其表达。     

原发性肝细胞癌中p33ING1b与p53基因间协同功能的研究

目的　探讨 p33ING1b与 p5 3基因间的协同功能对肝癌细胞生长、阻滞细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡及对 p5 3下游基因p2 1WAF1/CIP1表达的影响。方法　采用脂质体方法将 p33ING1b与wtp5 3基因分别转染入HepG2、PLC/PRF/ 5和Hep3B 3株内源性p5 3基因表达状态各不相同的肝癌细胞株 ,同时设转染反义 p33ING1b及反义wtp5 3质粒实验组和转染空载体对照组 ,转染 4 8h后检测各实验组细胞凋亡率及分析细胞周期变化 ,用Western印迹杂交分析各实验组肝癌细胞中 p33ING1b与 p5 3蛋白表达的变化 ,通过分析受 p2 1WAF1/CIP1启动子调控的荧光素酶报道基因表达的强弱 ,观察各实验组中p5 3下游基因 p2 1WAF1/CIP1的活性情况。采用 6 %乙醇为诱导剂作用于各实验组后 ,再次观察上述各指标的变化。结果　在表达内源性wtp5 3基因的HepG2细胞中 ,转染入 p33ING1b基因后 ,与对照组相比 ,细胞凋亡率增强 (2 2 5 3% ) ,细胞周期中停滞于G0 /G1期细胞的比例增多 (6 7 4 5 % ) ,下游基因p2 1WAF1/CIP1启动子的活性 (13 0 8)增强 (P <0 0 1)。对于表达突变型p5 3蛋白的PLC/PRF/ 5细胞 ,联合共转染 p33ING1b与wtp5 3实验组的G0 /G1期细胞比例 (78 16 % )及 p2 1WAF1/CIP1启动子活性(12 99)比单转染 p33ING1b或wtp5 3基因实验组高 (P     

小分子干扰RNA靶向抑制suvivin基因诱导U251细胞凋亡的实验研究

目的 构建靶向survivin基因的小分子干扰RNA（siRNA）表达载体,导入人胶质瘤细胞U251中,研究siRNA靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导作用。方法根据siRNA设计原则,在survivin全长序列中选取设计含19个核苷酸（19nt）靶序列两条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点．形成siRNA的DNA模板并克隆到siRNA表达载体pGenesil-1中,获得靶向抑制survivin基因的siRNA表达载体pGenesil-1／survivin;采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251;分别采用实时荧光定量PCR以及Western bloting从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用Annexin—V／PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡。结果实时荧光定量PCR以及Western blotting显示：survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制：流式细胞仪检测结果显示：survivin基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高。结论靶向survivin基因的重组siRNA干扰载体pGenesi—l／survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达,并明显诱导了U251细胞发生凋亡。     

小鼠4-1BB特异性RNA干扰表达载体的构建及体外瞬时干扰效应的研究

目的 采用小片段RNA干扰(small interference RNA,siRNA)技术,通过构建系列小鼠4-1BB(m4-1BB)基因的特异性siRNA表达载体,体外观察对m4-1BB基因的瞬时沉默作用,筛选具有最佳干扰效果的siRNA表达载体.方法 设计并合成4条针对小鼠4-1BB全长特异性的siRNA寡核苷酸序列,插入真核表达载体(pENTRTM/U6 ),构建m4-1BB序列特异性siRNA 表达载体,根据靶位点分别命名为p336、394、498及763 siRNA,无关干扰质粒为pLacZ siRNA;通过体外m4-1BB真核表达质粒p4-1BB分别与各siRNA表达载体同时转染COS-7细胞,48h后通过RT-PCR和FACS(fluorescence-activated cell sorter,荧光活化细胞分选仪)观测COS-7细胞4-1BB mRNA及蛋白表达水平.结果经测序分析,各m4-1BB siRNA表达载体构建成功;其中p498 siRNA与p4-1BB双质粒转染COS-7 细胞,48h后可观察到细胞表面4-1BB分子明显下调,其胞内mRNA水平也显著降低,与无关干扰组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).其余siRNA载体,几乎无干扰效应,与无关干扰组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论我们所构建的p498 siRNA 真核表达载体,能明显干扰m4-1BB蛋白的瞬时表达,可望用于m4-1BB Lentivirus干扰表达系统的构建,进一步在小鼠原代T淋巴细胞内实现高效4-1BB表达沉默,以深入研究4-1BB对T淋巴细胞的生物学影响.     

RNA干扰沉默CDKL1基因对人胶质瘤U251细胞增殖和凋亡的影响

目的 利用RNA干扰(RNAi)在人胶质瘤U251细胞中沉默CDKL1(cyclin-dependent kinaselike 1)基因的表达,探讨其对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响.方法 构建针对CDKL1基因的短发卡(shRNA)慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒并感染人胶质瘤U251细胞,采用实时定量聚合酶链反应和Western印迹法验证CDKL1基因的mRNA和蛋白的表达,确定其抑制效率.采用甲基噻唑基四唑(MTT)比色法和应用Annexin V染色流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡情况,观察沉默CDKL1基因对U251细胞增殖与凋亡表型的影响.结果 CDKL1-shRNA能有效抑制U251细胞中CDKL1基因的mRNA和蛋白的表达.CDKL1基因沉默后U251各时相的光密度值较感染无义序列的细胞均有降低趋势,第5天时差异有统计学意义(P＜0.05).同时,抑制CDKL1的U251细胞凋亡比例从无义小干扰RNA(siRNA)序列对照组的(9.80±0.21)%上升至(19.26±0.33)%,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 采用RNAi方法 能有效沉默CDKL1基因的表达,同时显著降低U251细胞的增殖能力,促进肿瘤细胞凋亡,表明CDKL1基因可能具有影响胶质瘤发生、发展的作用.