直接PCR法检测血液中伊氏锥虫感染

为建立伊氏锥虫动基体DNA(KinetoplastDNA,kDNA)的PCR扩增技术,血液直接PCR法检测伊氏锥虫的感染,本文以伊氏锥虫kDNA片段为靶扩增DNA设计引物,确定最适PCR反应条件,建立kDNA片段的PCR扩增技术,应用直接扩增缓冲液(Ampdirect)从感染小鼠的滤纸血标本直接PCR检测伊氏锥虫。结果发现,PCR扩增伊氏锥虫kDNA片段分子量为364bp,能检测的最小DNA量是0·06pg,与布氏锥虫、活动锥虫没有交叉反应。应用直接扩增缓冲液不需进行样本的DNA抽提,直接PCR能检测感染小鼠的早期滤纸血样本,敏感性高于镜检法。本实验建立的直接PCR法检测伊氏锥虫具有较高的敏感性和特异性,方法快捷,可进一步应用于伊氏锥虫病的早期诊断以及现场调查。     

用PCR扩增tim基因检测蓝氏贾第鞭毛虫

采用聚合酶链反应(PCR)对蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)的磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase,缩写为tim)基因进行特异性扩增,结果扩增出1条683bp的DNA片段.此方法的特异性可高达100%,而其它DNA样本,如日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、旋毛虫(Trichinella spiralis)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis),以及人体血细胞等均未出现扩增反应.本法的敏感性也很高,可检测到0.4pg贾第虫包囊的DNA.13株来自不同地理位置和/或宿主的贾第虫DNA样本在PCR中均各产生1条长为683bp的目的片段.上述结果表明本实验建立的检测贾第虫的PCR方法有效.     

用PCR扩增tim基因检测蓝氏贾第鞭毛虫

采用聚合酶链反应(PCR)对蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)的磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase,缩写为tim)基因进行特异性扩增,结果扩增出1条683bp的DNA片段.此方法的特异性可高达100%,而其它DNA样本,如日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、旋毛虫(Trichinella spiralis)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis),以及人体血细胞等均未出现扩增反应.本法的敏感性也很高,可检测到0.4pg贾第虫包囊的DNA.13株来自不同地理位置和/或宿主的贾第虫DNA样本在PCR中均各产生1条长为683bp的目的片段.上述结果表明本实验建立的检测贾第虫的PCR方法有效.     

用PCR扩增tim基因检测蓝氏贾第鞭毛虫

采用聚合酶链反应 (PCR)对蓝氏贾第鞭毛虫 (Giardialamblia)的磷酸丙糖异构酶 (triosephosphateisomerase ,缩写为tim)基因进行特异性扩增 ,结果扩增出 1条 6 83bp的DNA片段。此方法的特异性可高达10 0 % ,而其它DNA样本 ,如日本血吸虫 (Schistosomajaponicum)、刚地弓形虫 (Toxoplasmagondii)、微小隐孢子虫 (Cryptosporidiumparvum)、溶组织内阿米巴 (Entamoebahistolytica)、旋毛虫 (Trichinellaspiralis)和阴道毛滴虫 (Trichomonasvaginalis) ,以及人体血细胞等均未出现扩增反应。本法的敏感性也很高 ,可检测到0 4pg贾第虫包囊的DNA。 13株来自不同地理位置和 或宿主的贾第虫DNA样本在PCR中均各产生 1条长为 6 83bp的目的片段。上述结果表明本实验建立的检测贾第虫的PCR方法有效     

日本血吸虫真核表达重组质粒PcDNA3-Sj26的构建及其在树突状细胞中的表达

本研究构建日本血吸虫2 6kDa谷胱苷肽转移酶(Sj2 6 )基因的真核表达重组质粒(pcDNA3 Sj2 6 ) ,并探讨其在树突状细胞(DC)中的表达。采用PCR扩增Sj2 6基因片段,定向克隆至真核表达载体pcDNA3中,阳性克隆经双酶切、PCR扩增鉴定后,双脱氧链末端终止法进行序列测定。用脂质体介导DNA转染法将pcDNA3- Sj2 6转染DC ,G4 18加压筛选获得阳性克隆并传代培养,用RT PCR检测Sj2 6mRNA的转录水平,用SDS- PAGE、Westernblot和间接免疫荧光法检测Sj2 6蛋白在DC中的表达。结果PCR扩增得到特异的Sj2 6基因片段,双酶切及PCR鉴定表明获得正确的pcDNA3 -Sj2 6重组质粒;测序结果表明,核苷酸序列和推导的氨基酸序列与GenBank报道的Sj2 6的一致性均为99% ;RT PCR结果显示pcDNA3- Sj2 6转染的DC中有Sj2 6基因mRNA的表达,SDS -PAGE和Westernblot、间接免疫荧光法显示pcDNA3- Sj2 6转染的DC中有Sj2 6的表达。结果证实构建的真核表达重组质粒pcDNA3- Sj2 6成功的转染至DC中并在DC中获得表达。     

血吸虫重组BCG—Sj26GST疫苗对小鼠血清NO浓度的影响

目的研究血吸虫重组 BCG- Sj2 6 GST疫苗对小鼠血清 NO浓度的影响。方法第 1次实验用 10 6 和 10 8CFU疫苗分别皮下注射免疫 BAL B/C鼠 ,免疫后 8周用日本血吸虫尾蚴攻击 ,感染后 6周剖杀小鼠 ,同时设有 PBS对照组 ;第 2次实验用 10 6 CFU疫苗皮下和静脉分别注射免疫鼠 ,于免疫后 0、4、8、10、14和 16周各剖杀 4只 ,分离血清 ,用 NO试剂盒检测小鼠血清 NO浓度。结果发现疫苗免疫 ,尾蚴攻击后血清 NO浓度降低 ;疫苗皮下和静脉注射免疫后 4～ 16周血清 NO浓度升高 ,分别于免疫后 10周或 16周达最高水平。结论血吸虫重组 BCG- Sj2 6 GST疫苗能降低感染鼠血清 NO浓度 ,提高宿主抗血吸虫感染的保护力。     

寄生虫学

抗恶性疟原虫重组谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定；恶性疟原虫MESA基因的克隆和测序；海南省恶性疟原虫氯喹抗性相关基因Pfmdr1多态性分析；间日疟原虫MSPIC端基因亚克隆及在大肠埃希菌中的融合表达；NO在IL-12诱导抗伯氏疟原虫感染免疫效应中的作用；IL-12对伯氏疟原虫红内期感染小鼠Th1／Th2细胞因子表达水平的影响；儿童先天性病残与弓形虫感染关系的研究；宫内感染弓形虫影响儿童生长发育的观察；弓形虫表面抗原P22基因片段的克隆、表达及鉴定；弓形虫和乙型肝炎病毒混合核酸疫苗的研究Ⅱ．pcDNA3-HBsAg-GRA1在COS-7细胞中的表达及鉴定；弓形虫GRA7基因在大肠埃希菌中的表达；小鼠过继转移致敏小肠IEL抗弓形虫感染；弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区在大，肠杆菌中的表达；卡氏肺孢子虫肺炎动物模型的实验观察；丝虫特异IgG4检测试剂盒的研制；日本血吸虫FKBP12基因的原核克隆表达及表达产物的纯化；日本血吸虫中国大陆株雌性特异性DNA片段及重复序列的分离与鉴定；左旋咪唑防御日本血吸虫尾蚴感染的实验研究；核酸疫苗VR1012／Sj31粘膜免疫诱导小鼠抗攻击感染的研究；日本血吸虫染色体核型及其G带带型分析；蚯蚓与日本血吸虫间共同抗原的初步研究；致弱日本血吸虫尾蚴感染小鼠皮肤组织中CD11c分子的动态表达；日本血吸虫副肌球蛋白T细胞表位的预测和鉴定；日本血吸虫Sj14FABP与细胞因子IL-12重组质粒的构建和表达；Mago nashi：一个日本血吸虫性别决定基因的发现与鉴定；CpG ODN对B本血吸虫感染小鼠Th1／Th2细胞因子表达水平的影响；日本血吸虫Sj16基因重组杆状病毒的构建和鉴定；日本血吸虫精蠹酸酶基因启动子序列的扩增及序列分析；日本血吸虫天然抗原分子的柱纯析分离纯化与鉴定；铜锈环梭螺（Bellamya aeruginosa）作为广州管圆线虫中间宿主的发现；抗华支睾吸虫代谢抗原单克隆抗体的制备及鉴定研究；华支睾吸虫病大鼠肝细胞凋亡的实验研究；猪囊尾蚴液、固相多种抗原对囊虫病免疫诊断效果评价。     

日本血吸虫卵壳蛋白基因的筛选及EST序列测定

目的 通过对日本血吸虫(Sj)成虫cDNA库的核酸杂交筛选，分离出Sj卵壳蛋白相关基因的cDNA克隆，并进一步探讨该基因的结构与功能关系。方法 用地高辛标记的特异性寡核苷酸探针对Sj成虫cDNA库进行膜原位杂交筛进，挑选出阳性克隆，用通用引物进行PCR扩增，获得cDNA插入片段，采用PCR直接序列测定法，对其部分序列进行测定，而后将EST序列输入GENEBANK进行同源性检索和分析。结果 本实验从Sj cDNA库筛选到9个不同的阳性克隆，用通用引物扩增出9十分子量大小不同的单一条带，其中两个为已知序列，其余7个为新的EST序列。结论 用寡核苷酸标记探针对Sj库中进行校酸杂交筛选是寻找特定目的基因的有效方法。     

日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST—Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pET32α-Sj26GST—Sj32,分析该质粒在大肠埃希菌BL21（DE3）中的表达情况。方法超声粉碎日本血吸虫成虫提取总RNA,通过RT—PCR扩增获得Sj26GST和Sj32抗原编码基因,然后采用基因拼接法（geneSOEing）剪接Sj26GST和Sj32,得到Sj26GST—Sj32融合基因,克隆至原核表达载体pET32α（＋）,构建重组质粒pET32α一Sj26GST—Sj32,转化人大肠埃希菌BL21（DE3）,经异丙基硫代-β—D．半乳糖苷（IPTG）诱导表达后用SDS—PAGE和Westem—blot对表达产物进行分析和鉴定。结果基因拼接法扩增出约1991bp的Sj26GST—Sj32融合基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST—Sj32融合基因成功插入pET32α（＋）中,SDS—PAGE分析显示表达产物为分子质量约82000Mr的重组蛋白．与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的22％：Western—blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pET32α一Sj26GST—Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原一件     

聚合酶链式反应非特异性扩增抑制因子的发现以及全血直接PCR检测G6PD基因外显子3—4突变

目的（1）研究消除PCR反应非特异性扩增新技术。（2）研究全血直接PCR能否用于葡萄糖6-磷酸脱氢酶基因突变检测。方法（1）将新鲜全血混合基因组DNA进行PCR扩增,看全血能否抑制基因组DNA非特异性扩增。将新鲜人血清混合基因组DNA进行PCR扩增,看新鲜人血清能否抑制基因组DNA非特异性扩增。（2）将1μl全血加入PCR反应液,98℃变性后转入PCR循环,使用Taq（Fermentas）扩增G6PD基因外显子3—4,取扩增产物50μl进行DNA双向自动测序,使用ClustalX软件将测序结果与基因库中标准G6PD基因外显子3—4序列进行比对分析。结果（1）发现新鲜全血能抑制基因组DNA非特异性扩增,进一步研究发现是新鲜人血清抑制了基因组DNA非特异性扩增。（2）全血直接PCR加上DNA测序找到一例G6PD突变g．13503A〉G。结论（1）新鲜人血清中存在PCR非特异性扩增抑制因子。（2）使用TaqDNA聚合酶（Fermentas）能进行全血直接PCR扩增,加上DNA测序可用于G6PD基因突变研究。