人CD4和IHLA-DR0401表达载体转化扩增及其在L929细胞中的表达

背景：转基因小鼠的开发已成为类风湿关节炎动物模型的必然趋势，HLA—DR是通过何种分子机制导致类风湿关节炎的发病是目前研究热点。 目的：拟对含有人CD4基因质粒pcDNA3-CD4和含HLA—DR0401基因质粒pLNCX2-DR＊0401进行体外转化扩增，并观察其在小鼠成纤维细胞内的表达。 设计、时间及地点：开放性实验，于200706／2008-01在南方医科大学中医药学院实验中心、南方医科大学动物实验中心分步完成。 材料：含人CD4基因载体pcDNA3-CD4和含HLA-DR0401基因载体pLNCX2-DR＊0401分别由美国宾西法尼亚大学微生物学系和马里兰巴尔的摩县大学生物化学系惠赠。大肠杆菌DH5α为北京天根生化科技有限公司产品。小鼠成纤维细胞（L929）细胞株为南京凯基生物科技发展有限公司产品。 方法：取pcDNA3-CD4和pLNCX2-DR＊0401质粒转化DH5α感受态菌，再接种到含氨苄青霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选培养，挑取阳性克隆菌落进行培养后抽提质粒，并取样进行限制性内切酶鉴定和测序。采用脂质体转染L929细胞，通过流式细胞仪和直接免疫荧光法对人CD4和HLA—DR0401的表达进行检测。 主要观察指标：①质粒扩增情况。②质粒酶切及测序鉴定。③质粒转染L929细胞后的表达。 结果：经转化扩增后，pcDNA3，CD4、pLNCX2-DR＊0401质粒的纯度及浓度均较高。人CD4表达载体经酶切鉴定和测序证实目的基因插入正确且与GenBank一致，HLA—DR0401表达载体酶切鉴定正确，测序鉴定HLA—DRα基因正确。流式细胞仪检测转pcDNA3-CD4载体的细胞约61％呈阳性，直接免疫荧光结果显示人CD4在转基因细胞中得到表达，分布于胞膜及胞质内。流式细胞术检测仅有1％的转pLNCX2-DR＊0401载体的细胞呈阳性，直接免疫荧光无特异性荧光检出。结论：成功转化并扩增了人CD4和HLA，DR0401表达载体，并转染小鼠成纤维细胞系L929，为下一步转基因鼠模型的构建奠定了实验基础。     

人CD4和HLA-DR0401表达载体转化扩增及其在L929细胞中的表达

背景:转基因小鼠的开发已成为类风湿关节炎动物模型的必然趋势,HLA-DR是通过何种分子机制导致类风湿关节炎的发病是目前研究热点.目的:拟对含有人CD4基因质粒pcDNA3-CD4和含HLA-DR0401基因质粒pLNCX2-DR*0401进行体外转化扩增,并观察其在小鼠成纤维细胞内的表达.设计、时间及地点:开放性实验,于2007-0612008-01在南方医科大学中医药学院实验中心、南方医科大学动物实验中心分步完成.材料:含人CIM基因载体pcDNA3-CD4和含HLA-DR0401基因载体pLNCX2-DR*0401分别由美国宾西法尼亚大学微生物学系和马里兰巴尔的摩县大学生物化学系惠赠.大肠杆菌DH5α为北京天根生化科技有限公司产品.小鼠成纤维细胞(L929)细胞株为南京凯基生物科技发展有限公司产品.方法:取pcDNA3-CD4和pLNCX2-DR*0401质粒转化DH5α感受态菌,再接种到含氨苄青霉素的LB琼脂培养板进行抗性筛选培养,挑取阳性克隆菌落进行培养后抽提质粒,并取样进行限制性内切酶鉴定和测序.采用脂质体转染L929细胞,通过流式细胞仪和直接免疫荧光法对人CD4和HLA-DR0401的表达进行检测.主要观察指标:①质粒扩增情况.②质粒酶切及测序鉴定.③质粒转染L929细胞后的表达.结果:经转化扩增后,pcDNA3-CD4、pLNCX2-DR*0401质粒的纯度及浓度均较高.人CD4表达载体经酶切鉴定和测序证实目的基因插入正确且与GenBank一致,HLA-DR0401表达载体酶切鉴定正确,测序鉴定HLA-DRα基因正确.流式细胞仪检测转pcDNA3-CD4载体的细胞约61%呈阳性,直接免疫荧光结果显示人CD4在转基因细胞中得到表达,分布于胞膜及胞质内.流式细胞术检测仅有1%的转pLNCX2-DR*0401载体的细胞呈阳性,直接免疫荧光无特异性荧光检出.结论:成功转化并扩增了人CD4和HLA-DR0401表达载体,并转染小鼠成纤维细胞系L929,为下一步转基因鼠模型的构建奠定了实验基础.     

人Regucalcin cDNA真核表达载体的构建及表达

目的构建人regucalcin（RGN）全长cDNA的真核表达载体，观察其在人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2细胞）中表达。方法用RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA，将扩增的产物连接入pMD18-T克隆载体上。将重绢质粒转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，再用双酶切方法将RGN基因定向连接到真核表达载体DECFP-NI中，构成pEGFP-RGN，将pEGFP-RGN转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确。再用双酶切方法将RGN基因与EGFP定向连接到真核表达载体pcDNA3．1（＋）-zeocin中，构建真核表达pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo的重组体。将pcDNA3．1-RGN．EGFP-zeo转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，用脂质体转染入HK-2细胞。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo表达情况。结果RGNcDNA全长是897bp。以此构建的pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo真核表达载体，经DNA测序与GenBank中的人RGNcDNA序列一致。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察到pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo转染的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。结论本实验成功构建了pcDNA3．1-RGN．EGFP．zeO真核表达质粒，并在HK-2细胞中表达。     

S100A4基因载体的构建及其在人胃癌细胞系中的表达

目的 克隆S100A4 cDNA,构建pcDNA3.1-S100A4重组表达载体,转染胃癌细胞系MKN1,观察S100A4在胃癌细胞中的表达情况。方法 Trizol法提取人胃上皮细胞GES-1的总RNA,逆转录反应获得含S100A4基因的cDNA。聚合酶链反应GenBank获得S100A4基因序列,并设计引物,利用聚合酶链反应(PCR)扩增出分子量为327 bp的产物。构建pMD18-T simple-S100A4重组质粒,转化JM109菌。菌液测序成功后,提取质粒,进行BamHⅠ/HindⅢ双酶切,酶切产物回收纯化,连接表达载体pcDNA3.1,构建pcDNA3.1-S100A4真核表达载体。利用脂质体介导转染方法将纯化的表达载体转染到胃癌细胞系MKN1中,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后MKN1细胞中S100A4 mRNA表达水平。结果 PCR产物连接克隆载体的测序结果与GenBank公布的无突变序列一致,HindⅢ/BamHⅠ双酶切可以成功构建真核表达载体pcDNA3.1-S100A4;在胃癌细胞系MKN1中转染pcDNA3.1-S100A4表达载体,以转染pcD...     

人骨形成蛋白2真核表达载体的构建和体外表达

背景：骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP-2）是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子，被认为是最具有前途的骨诱导物质。目的：构建人骨形成蛋白2真核表达载体并观察其体外表达情况。设计、时间及地点：自身对照实验，于2005-07／2006-05在华中科技大学同济医学院分子生物中心实验室完成。材料：pcDNA3．1（＋）载体由华中科技大学同济医学院左石博士惠赠；成骨肉瘤组织由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科提供。方法：从人成骨肉瘤细胞中提取细胞总RNA，利用反转录．聚合酶链反应方法扩增获得人BMP-2基因cDNA，将基因片断重组到pGEM-T质粒中构建pGEM．T-hBMP-2重组质粒载体，转化到大肠杆菌DH5n后筛选阳性克隆，利用限制性酶切和DNA序列分析鉴定重组质粒。分别用RcoRI和NotI双酶切pGEM-T-hBMP-2质粒和pcDNA3．1真核表达载体，将克隆载体中人骨形成蛋白2基因重组到pcDNA3．1真核表达载体，提取质粒作酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序后，用脂质体体外转染小鼠骨髓基质细胞，反转录-聚合酶链反应检测BMP．2的表达。主要观察指标：①人骨肉瘤细胞总RNA反转录-聚合酶链反应结果。②重组质粒pGEM．T-hBMP-2和pcDNA3．1-hBMP-2的构建和酶切鉴定。③BMP-2在小鼠骨髓基质细胞内的表达。结果：人骨肉瘤细胞总RNA经反转录-聚合酶链反应扩增后，获得1．2kb条带。经酶切电泳、聚合酶链反应鉴定及DNA测序证实实验成功克隆BMP-2基因，重组质粒pcDNA3．1-hBMP-2构建正确；该重组质粒能在体外培养的小鼠骨髓基质细胞中有效表达BMP-2。 结论：实验成功克隆人骨形成蛋白2基因并构建了此基因的真核表达载体。     

VEGF反义RNA促骨髓瘤细胞凋亡及抑制内皮细胞形成血管作用的体外研究

本研究探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）反义RNA对人多发性骨髓瘤细胞系U266增殖、凋亡及内皮细胞ECV304体外血管形成的影响和以VEGF反义RNA进行多发性骨髓瘤（MM）基因治疗的可行性。将VEGF121反向克隆入真核表达质粒pIRES2-EGFP构建重组质粒AS-VEGF，酶切、测序鉴定。用此真核表达重组质粒转染人骨髓瘤细胞系U266，G418筛选获得阳性克隆。RT-PCR、Westernblot法分别检测阳性克隆中VEGFmRNA和蛋白的表达；利用MTT法、流式细胞术检测转染细胞增殖、凋亡的变化；利用基质胶中内皮细胞ECV304的网络形成检测血管形成。结果表明：获得了携带反义VEGF基因的真核表达重组质粒AS-VEGF；VEGF121反义RNA部分阻断了U266细胞中VEGF的表达，转染重组质粒的U266细胞VEGFmRNA和蛋白表达都较对照组细胞有明显减少，细胞的增殖受到抑制，凋亡增加。转染重组质粒的细胞培养上清在基质胶中作用ECV304细胞后的血管形成较对照组亦有明显减少。结论：VEGF反义RNA可以下调VEGF表达，从而抑制骨髓瘤细胞系U266增殖，增加其凋亡并抑制血管形成。     

白细胞新单克隆抗体ZCH-2Ba的表达谱分析及其意义

ZCH-288a（IgG2a）是作者研究室最近采用髓细胞性白血病细胞系KG1a作为免疫原自行研制的鼠抗人造血细胞分化抗原的单克隆抗体，已提交第8届国际人类白细胞分化抗原协作组会议（HLDA8）鉴定。根据HL-DAB总部反馈信息表明，该抗体识剐的抗原性质不明，后者属国际上尚未认识的血细胞膜新的分化抗原。本研究旨在分析ZCH-288a单克隆抗体与正常人外周血细胞成分、骨髓及G-CSF动员的外周血CD34^＋造血干／祖细胞和血液肿瘤细胞系的反应规律及其意义。采用多参数流式细胞术分析288a抗体与正常及恶性肿瘤细胞表面的反应性，每种细胞成分重复实验3次，以阳性细胞数I〉20％为阳性。结果表明：288a抗原在外周血B细胞上表达（3／3例，平均阳性细胞数为26．29％），而在T淋巴细胞和NK细胞上不表达（0／3例）；在粒细胞和单核细胞上阳性表达均为2／3例，平均阳性细胞数分别是23．72％和59．84％；在DC细胞、红细胞和血小板上均不表达（0／3例）。288a抗原在骨髓CD34^＋细胞上的阳性表达是3／3例，平均阳性细胞数39．33％，而在G-CSF动员的外周血CD34^＋细胞上的阳性表达仅1／3例，平均阳性细胞数为1．25％。288a抗原在B系细胞系Raji、SMS-SB、Nalm-6和Nall-1上的平均阳性细胞数分别为98．78％、98．61％、94．93％和5．68％；在T系细胞系Molt-3上的平均阳性细胞数为31．40％，而在Molt-4、JM和CCRF-CEM细胞上不表达；在髓系细胞系U937、Meg-01、HL-60、K562、KG1a和HEL92．1．7上的平均阳性细胞数分别为67．78％、33．40％、29．70％、28．19％、16．23％和8．02％；在神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH、KCNR、BE、LAN-1和SK-N-As细胞以及结肠癌细胞系HR8348细胞上均不表达，而在羊膜细胞系FL细胞上呈一定的阳性表达，平均阳性细胞数为45．03％。结论：在正常外周血，288a抗体主要与B淋巴细胞和单核巨噬细胞反应，在骨髓和外周血CD34^＋造血干／祖细胞中也有不同程度的反应性；在细胞系上，288a抗体主要与B系细胞系、单核巨噬细胞系及上皮性肿瘤细胞系反应，提示该抗体有可能用于上述肿瘤的免疫学诊断与治疗。     

类似人弥漫型大B细胞淋巴瘤小鼠模型的免疫学特征

本研究建立类似人弥漫型大B细胞淋巴瘤的BALB／c小鼠模型并探索其免疫学特征。将鼠源性B淋巴瘤细胞株（A20细胞）接种于同源BALB／c小鼠以建立B细胞淋巴瘤鼠模型。实验分为3组：成瘤小鼠组,未成瘤小鼠组和正常小鼠组（对照组）。用流式细胞术检测肿瘤细胞CD抗原表达及成瘤小鼠、未成瘤小鼠和对照正常小鼠的外周血和脾脏的T／B淋巴细胞亚群比例。结果表明：在成功构建病理学形态类似人弥漫大B细胞淋巴瘤的BALB／c鼠模型肿瘤组织中,检测到CD3、CD4、CD8、CD19、CD30阳性细胞的比例分别为（49．27±23．75）％,（6．07±3．65）％,（51．2±23．1）％,（67．06±16．39）％,（37．93±17．03）％,与接种前A20细胞相比,其CD3和CD8阳性细胞比例显著升高,CD19阳性表达比例显著下降（P〈0．05）。成瘤小鼠外周血淋巴细胞亚群阳性表达比例较正常小鼠有显著差异,其CD3和CD4阳性细胞比例显著降低（P〈0．05）。未成瘤小鼠脾脏淋巴细胞亚群的阳性表达比例与正常小鼠相比,CD3、CD4、CD8阳性细胞比例降低,而CD19阳性细胞比例升高（P〈0．05）。结论：本研究为在有免疫功能的小鼠体内进行B细胞淋巴瘤相关研究提供了免疫相关实验依据。     

LRP16基因对慢性髓系白血病K562细胞促增殖作用的研究

本研究探讨超表达LRP16基因对人慢性髓系白血病K562细胞增殖的影响。采用RT—PCR法扩增人LRP16基因开放阅读框（open reading frame,ORF）片段,将其连接到pGEM—T质粒以构建LRP16基因ORF—pGEM—T重组载体。再将测序鉴定过的LRP16基因ORF插入pcDNA3．1^＋质粒以构建LRP16基因ORF—pcDNA3．1^＋重组表达质粒,转染K562细胞,建立稳定超表达LRP16基因的K562细胞系。用M1Tr法测定细胞存活率并绘制生长曲线,流式细胞术检测细胞周期。结果表明：成功扩增出人LRP16基因ORF片段,并构建LRP16基因ORF—pcDNA3．1^＋重组表达质粒;建立稳定超表达LRPl6基因的K562细胞系;超表达LRPl6基因具有促进K562细胞增殖的作用,且这种促增殖作用部分是通过促进细胞由G0期进入S期而实现的。结论：超表达LRP16基因可促进K562细胞增殖。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因重组真核表达载体的构建及在烫伤大鼠皮肤组织中的表达

目的：构建单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV—tk）基因重组真核表达载体pcDNA3．1／HSV—tk，并观察其在烫伤大鼠皮肤中的表达。方法：实验于2003～07／12在解放军第一军医大学热带卫生学系实验室进行。在原核表达质粒pUChHyTk基础上，利用分子克隆技术，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1／HSV—tk。取20只Wistar大鼠，全麻后背部浸入95℃水浴锅中，烫伤12s，造成30％Ⅲ度烫伤，烫伤后随机分为两组（n=10）：①pcDNA3．1／tk组：烫伤后当天及第1，2，3，4周后于大鼠左后背部创面边缘（距创面边缘0．5cm）皮下注射脂质体和重组质粒的混合物192μL[3．6μg pcDNA3．1／tk（2μL）＋10μL脂质体＋180μL生理盐水】。②pcDNA3．1组：注射时间和方法同前，脂质体和质粒混合物为3．0μg pcDNA3．1（2μL）＋10μL脂质体＋180μL生理盐水。伤后5周断头处死大鼠，取注射点附近皮肤，用反转录-聚合酶链反应法检测HSV—tk基因的表达。结果：20只大鼠全部进入结果分析。大鼠重组质粒经酶切鉴定与预期结果一致，DNA测序结果表明tk基因已正确插入到pcDNA3．1质粒，说明了重组真核表达载体pcDNA3.1／HSV—tk已成功构建。反转录-聚合酶链反应结果显示脂质体介导的HSV—tk基因转移可在创面成纤维细胞中出现阳性表达。结论：应用分子克隆技术成功地构建了重组真核表达载体pcDNA3．1／HSV—tk，并在烫伤大鼠皮肤中得到了阳性表达。     

肺表面活性物质相关蛋白C真核表达载体的构建及体外表达

目的 克隆人肺表面活性物质相关蛋白C(SP-C)基因,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/SP-C,并检测其在体外的表达,为SP-C的批量生产提供可靠的方法.方法 提取肺癌手术患者病灶周围正常肺组织总RNA,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术获得SP-C cDNA序列.用NotI和XhoI内切酶双酶切SP-C cDNA序列和质粒pcDNA3.1(+),胶回收后体外连接.酶切和测序后,用脂质体包裹转染人乳腺癌细胞株MCF-7,采用RT-PCR和蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测SP-C的表达.结果 能够正确克隆人SP-C基因并插入至质粒pcDNA3.1(+)中;重组质粒体外转染MCF-7细胞后可以表达SP-C蛋白.结论 采用体外重组技术,成功构建了人SP-C真核表达载体 pcDNA3.1(+)/SP-C,并能在体外表达SP-C,为下一步构建人SP-C乳腺特异表达载体,利用乳腺生物反应器大量生产SP-C奠定了基础.     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景：阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于β-淀粉样多肽的异常。目的：构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株。方法：采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞（SH-SY5Y）的总cDNA中,扩增出约1.0kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达。结果与结论：人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株。     

酸敏感离子通道蛋白与组织型激肽释放酶相互作用的研究

目的：观察酸敏感离子通道蛋白（ASIC1a、ASIC2a）与组织型激肽释放酶（TK）之间是否存在相互作用。方法：RTPCR分别获得小鼠TK、ASIC1a、ASIC2a全长cDNA,将其克隆人真核表达载体pcDNA3．1／Myc—his中,脂质体法分别将pcDNA3．1-TK和pcDNA3．1-ASIC1a、pcDNA3．1-TK和pcDNA3．1-ASIC2a共转染至人胚胎肾细胞（HEK293T）,免疫共沉淀分别用抗Myc及抗TK抗体观察两者间有无相互作用。将ASICs融合蛋白与TK（100μg／mL）共孵育,SDS—PAGE分别用抗Myc及抗TK抗体检测蛋白表达。结果：pcDNA3．1TK和pcD—NA3．1-ASIC1a、pcDNA3．1-TK和pcDNA3．1-ASIC2a共转染后,SDS—PAGE显示抗TK抗体检测后在转染细胞内见有56kDa的TK条带出现,但抗Myc抗体作用未见ASICs目的条带出现。纯化的ASIC1a、ASIC2a融合蛋白与TK共孵育后,SDS—PAGE显示抗Myc抗体检测后在约66kDa处有融合蛋白表达条带,但抗TK抗体检测后在56kDa处无条带出现。结论：TK与ASIC1a、TK与ASIC2a之间无相互作用。     

人乳头瘤病毒16型L1基因真核表达载体的构建及表达

目的从感染人乳头瘤病毒（HPV）的新鲜宫颈癌组织中扩增HPV16型晚期蛋白L1基因全长，构建表达载体，并验证目的蛋白的表达。方法根据基因全长设计一对特异引物，用PCR的方法从宫颈癌组织DNA，中获得L1基因，以pMD18T为克隆载体，构建重组质粒进行亚克隆，再以pcDNA3．1（＋）为载体构建表达质粒，转染至人肝细胞系H7702，提取蛋白，采用Western Blot方法检测HPV16-L1蛋白的表达。结果从长春地区宫颈癌临床标本克隆到的HPV16型L1蛋白编码序列与Genebank报道序列高度同源，其真核表达产物与特异性抗体能够特异性结合。结论成功构建重组表达质粒pcDNA3．1（＋）-HPV16-L1，为进一步研制HPV预防性疫苗创造基础条件。     

人FOXC2真核表达载体的构建及稳定转染C-33A细胞系的建立

目的构建人FOXC2真核表达载体,并转染人宫颈癌C-33A细胞,建立稳定转染的细胞系。方法应用PCR方法从人FOXC2克隆中扩增其cDNA编码区序列,并将其构建于pcDNA3.1（-）真核表达载体。经PCR和测序鉴定后,利用脂质体进行宫颈癌C-33A细胞的转染,应用G418筛选出稳定表达FOXC2的细胞系,通过RT-PCR及Westernblot法检测FOXC2的表达情况。结果成功构建pcDNA3.1（-）/FOXC2真核表达载体,建立稳定转染FOXC2的C-33A细胞系,并鉴定了FOXC2目的基因在C-33A细胞中的过表达。结论FOXC2真核表达载体的成功构建为进一步研究FOXC2基因在宫颈癌中的功能奠定了良好的实验基础。     

丙肝核心抗原-CD40L胞外段真核表达载体的构建及其免疫原性分析

目的构建丙肝核心抗原-CD40L胞外段融合蛋白真核表达载体,并探讨其免疫原性。方法应用基因重组技术在原有载体的基础上构建真核表达载体pcDNA3.1-core-CD40L并加以鉴定。该表达质粒肌肉内注射免疫小鼠,ELISA法检测小鼠外周血中抗丙肝核心抗体,流式细胞仪检测小鼠外周血T淋巴细胞亚型,real time PCR法检测外周血单个核细胞内细胞因子,CTL杀伤实验检测小鼠脾淋巴细胞的杀伤活性。结果构建了真核表达载体pcD-NA3.1-core-CD40L,该载体能诱发小鼠产生高滴度的抗丙肝核心抗原的抗体,流式和real time结果证实该质粒能诱使小鼠T淋巴细胞由T0期向Th1和Th2转换,并以Th1为主,CTL杀伤结果显示该表达质粒能诱使小鼠产生高水平的细胞杀伤能力。结论成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-core-CD40L,该质粒能够在小鼠体内正确表达,并能诱发高水平的细胞杀伤活性。     

重组人单链白细胞介素12融合基因的构建、真核表达及生物学活性测定

目的 探讨用生物学技术获取具有生物学活性的重组人白细胞介素１２（ｒｈＩＬ－１２）的方法。方法 从经佛波醇酯（ＰＤＢｕ）刺激的ＥＢ病毒转化的人Ｂ淋巴母细胞株ＮＣ－３７中提取ｍＲＮＡ,经逆转录－聚合酶链反应分别获得ｈＩＬ－１２ｐ４０和ｐ３５亚单位编码序列的ｃＤＮＡ,运用重组聚合酶链反应技术。将两段基因通过多肽接头（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ＤＮＡ序列连接后进行基因重组,构建了重组人单链ＩＬ－１２融合基因（ｒｈ－ｓｃＩＬ－１２）。进一步将ｒｈｓｃＩＬ－１２融合基因插入ｐｃＤＮＡ３．１（＋）真核表达载体中,构建ｒｈｓｃＩＬ－１２真核表达载体「ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－ｒｈｓｃＩＬ－１２」,转染ＣＯＳ－７细胞,结果 经Ｇ４１８筛选获ＣＯＳ－ｒｈｓｃＩＬ－１２融合蛋白稳定表达株,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示该融合蛋白相对分子质量为７     

转染VEGF-C cDNA对NB4细胞增殖、分化与凋亡的影响

目的探讨转染血管内皮生长因子(VEGF)-C cDNA 对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞增殖、全反式维甲酸(ATRA)诱导分化及化疗药物介导的细胞凋亡作用的影响。方法采用脂质体法将重组表达载体(pcDNA3.1-VEGF-C)和 pcDNA3.1转染 NB4细胞建立稳定细胞株;采用MTT 法及集落形成实验分析转染 VEGF-C cDNA 对 NB4细胞增殖的影响;NB4/VEGF-C 细胞经 ATRA诱导后涂片经瑞特-姬姆萨染色作形态学分析,实时荧光定量 PCR 检测调控粘细胞分化基因 C/EBPα相对表达水平,同时以流式细胞术检测细胞表面的 CD11b 表达量;Annexin V/PI 双染流式细胞术检测NB4/VEGF-C 细胞经鬼闩乙叉甙(Vp16)诱导的细胞凋亡;并以实时荧光定量 PCR 检测 bcl-2基因相对表达水平,均以 NB4/pcDNA3.1细胞为对照。结果成功转染获得稳定表达 VEGF-C 的细胞株 NB4/VEGF-C,其增殖能力显著高于 NB4/pcDNA3.1细胞;NB4/VEGF-C细胞对抗 ATRA 介导的早幼粒细胞分化成熟,CD11b 表达量低于对照组,C/EBPα基因含量仅为对照组的1/32;NB4/VEGF-C 细胞经Vp16介导后 bcl-2基因表达约为 NB4/pcDNA3.1细胞的2.28倍,而凋亡的 NB4/VEGF-C 细胞百分率(7.20±2.52)%明显低于凋亡的 NB4/pcDNA3.1细胞的(16.07±3.58)%(P=0.005)。结论 VEGF-C 通过 VEGF 受体3(VEGFR-3)信号途径促进白血病细胞增殖,抑制分化诱导剂介导的 NB4 细胞分化及化疗药物介导的细胞凋亡,推测 VEGF-C/VEGFR-3信号途径在白血病疾病进展中发挥重要作用并可望作为白血病治疗的靶点。     

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆及其重组表达载体的构建意义

目的构建MAGE-3基因重组真核表达质粒pcDNA3.1/MAGE-3,制备肿瘤DNA疫苗,为提高患者生存期内生活质量选择更优秀的治疗措施。方法从人黑色素瘤细胞株中提取总RNA,进行RT-PCR扩增出全长cDNA,并克隆入PUC19载体,经DNA测序证实序列无误后,将MAGE-3基因克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体。结果经RT-PCR扩增出大小约950bp的基因片段,成功克隆入PUC19载体,经DNA测序证实为MAGE-3,编码MAGE-3基因全部947bp序列,读框正确,进一步亚克隆获得携有MAGE-3基因的重组质粒pcDNA3.1/MAGE-3。结论成功构建了MAGE-3真核表达质粒,为其作为新型DNA疫苗用于肿瘤免疫治疗奠定了基础,对提供有效治疗方案,提高患者的生存率和延长患者的生存期产生正面意义。     

外源性子宫珠蛋白基因对宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨人子宫珠蛋白（UG）基因对宫颈癌Hela细胞系细胞增殖及凋亡的影响。方法构建真核细胞表达载体pcDNA3．1-UG（＋），以脂质体介导法稳定转染体外培养的人宫颈癌Hela细胞，同时转染空载体pcDNA3．1质粒，以未转染细胞为对照，转染成功后分别命名为pcDNA3．1-UG（＋）／Hela组、pcDNA3．1／Hela组、Hela组。应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、Western blot方法分析目的基因表达，并采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和流式细胞术检测细胞增殖和细胞凋亡。结果pcDNA3，1-UG（＋）／Hela组UGmRNA及UG蛋白出现明显的高表达，与对照组细胞相比差异有统计学意义（P〈0．05）；pcDNA3．1UG（＋）／Hela组细胞生长速度明显慢于未转染Hela细胞，其细胞凋亡率与未转染Hela细胞相比差异也有统计学意义；然而pcDNA3．1／Hela组细胞生长速度和凋亡率均无明显变化。结论转染UG基因能诱导Hela细胞凋亡及抑制Hela细胞生长。