炎性细胞因子对色素上皮细胞衍生因子表达的影响

目的 观察肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素（IL）-6、IL-8等炎性细胞因子对视网膜色素上皮细胞衍生因子（PEDF）表达的影响。方法 原代培养人视网膜色素上皮 (RPE）细胞，取3～5代细胞分别以浓度为20.00、2.00 、0.20 、0.02 ng/ml的TNF-α、IL-6、IL-8干预6、12、24、48 h，蛋白免疫印迹方法检测培养液中PEDF蛋白质的表达水平。 结果 TNF-α、IL-6、IL-8对人RPE细胞PEDF的分泌均有抑制作用，并且其抑制作用随着3种炎性细胞因子浓度的增加和作用时间的延长而增强；在浓度0.02 ng/ml、作用时间6 h（F=7.14，P＜0.05)，浓度2.00ng/ml、作用时间48 h（F=14.05，P＜0.01)，浓度20.00ng/ml、作用时间24 h（F=11.53，P＜0.01) 3种作用条件下,对PEDF分泌抑制作用的差异具有统计学意义，其中TNF-α干预组PEDF的表达量最低，对人RPE细胞PEDF的分泌抑制作用最明显（F＝14,P＜0.01）。结论 TNF-α、IL-6、IL-8能够下调体外培养的人RPE细胞PEDF蛋白质的表达。     

曲安奈德对缺氧条件下培养人RPE细胞HIF-1α及VEGF表达的影响

目的 探讨曲安奈德(TA)对体外缺氧培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)及血管内皮生长因子(VEGF)合成的影响.方法 研究人RPE细胞分别在150 μmol/L CoCl2 0 μh/mL TA(0μg/mL TA组)、150μmol/L CoCl2 50 μg/mL TA(50μg/mL TA组)和150 μmol/L CoCl2 200斗g/mL TA(200μg/mL TA组)的培养条件下,通过RT-PCR检测HIF-1α及VEGF mRNA的表达,使用Western blot检测其蛋白水平.结果 与0μg/mL TA组相比,50μg/mL TA组及200μg/mL TA组中VEGF mRNA及蛋白的表达明显下降,差异均具有统计学意义(P＜005),但HIF-1α mRNA及蛋白的表达无明显变化,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TA对缺氧条件下人RPE细胞HIF-1α表达无影响,但能有效地抑制VEGF的表达,对缺血性视网膜病变新生血管形成具有防治作用.     

沉默SIAH1基因对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的影响

目的:探讨沉默SIAH1基因对H 2O 2诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的影响。方法:将培养的人晶状体上皮细胞系HLE-B3分为正常组、H 2 O 2组(用含400μmol/L H 2O 2的培养液培养)、H 2O 2+siR-SIAH1组(转染SIAH1干扰序列后用含400μmol/L H 2O 2培养液培养)和siR-NC组(转染阴性对照序列后用含400μmol/L H 2O 2培养液培养),采用实时荧光定量PCR技术检测细胞中SIAH1基因表达,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测细胞中p38 MAPK、p-p38 MAPK、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果:H 2O 2组、siR-NC组和H 2O 2+siR-SIAH1组细胞中SIAH1 mRNA相对表达量均高于正常组,而H 2O 2+siR-SIAH1组细胞中SIAH1 mRNA相对表达量低于H 2O 2组和siR-NC组(均P<0.05)。H 2O 2组、siR-NC组和H 2O 2+siR-SIAH1组细胞凋亡率均高于正常组,而H 2O 2+siR-SIAH1组细胞凋亡率低于H 2O 2组和siR-NC组(均P<0.05)。H 2O 2组、siR-NC组和H 2O 2+siR-SIAH1组细胞中p38 MAPK和Bcl-2蛋白表达量低于正常组,而p-p38 MAPK和Bax蛋白表达量高于正常组,H 2O 2+siR-SIAH1组细胞中p38 MAPK和Bcl-2蛋白表达量高于H 2O 2组和siR-NC组,而p-p38 MAPK和Bax蛋白表达量低于H 2O 2组和siR-NC组(均P<0.05)。结论:下调SIAH1基因表达可抑制H 2O 2诱导的人晶状体上皮细胞凋亡,其机制可能与抑制p38 MAPK信号通路活化有关。     

曲安奈德对体外培养的人视网膜色素上皮细胞HSP47表达的影响

目的 探讨曲安奈德(TA)对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞热休克蛋白47(HSP47)表达的影响.方法 研究RPE细胞分别在0、50、200μg/mL TA的培养条件下,通过RT-PCR检测HSP47 mRNA的表达,使用Western blot检测其蛋白水平.结果 与0μg/mL TA组比较,50μg/mL及200μg/mL TA组HSP47 mRNA和蛋白的表达量明显下降(P<0.05),蛋白水平亦明显下降(P<0.05).结论 HSP47对胶原的成熟起着重要作用,TA能有效抑制人RPE细胞HSP47的表达,可能是其防治增生性玻璃体视网膜病变(PVR)及增生型糖尿病视网膜病变(PDR)的一个重要机制.     

人RPE细胞表达整合素α5的调节研究

目的 探讨人视网膜色素上皮(RPE)细胞中整合素α5表达的调节机制.方法人RPE细胞原代、传代培养,RT-PCR及流式细胞术观察血清组、PD98059组和对照组整合素α5mRNA和蛋白的表达,Western blot法检测各组人RPE细胞中MAPK磷酸化水平.结果与对照组相比,血清组能促进整合素α5mRNA和蛋白的表达,而PD98059(20μmol/L)组可抑制此促进作用;流式细胞仅显示培养24 h后3组整合素α5荧光强度分别为1.94±0.22,4.56±0.25,2.39±0.14,差异有统计学意义(P<0.05).Western blot结果显示30 min后血清组ERK1/2磷酸化激活水平最高,PD98059组抑制ERK1/2的磷酸化激活,对照组ERK1/2的磷酸化激活作用很弱.结论 10%小牛血清能促进人RPE细胞表达整合素α5,ERK1/2的磷酸化激活参与此过程.     

枸杞多糖对LPS诱导的人视网膜色素上皮细胞炎性反应的影响及机制

目的:探索枸杞多糖(LBP)对细菌脂多糖(LPS)诱导的人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞的炎性反应的影响及其可能介导的信号通路。方法:通过LPS刺激体外培养的ARPE-19细胞构建炎性反应模型。将细胞随机分为5组,空白组使用完全培养基培养,LPS组给予含10μg/mL LPS的完全培养基刺激24h,低、中、高浓度LBP组分别给予0.1、0.5、1mg/mL LBP完全培养基孵育24h后给予含10μg/mL LPS的完全培养基刺激24h。应用CCK-8观察细胞存活率、实时荧光定量PCR检测相关炎性因子的mRNA表达量及Western-blot检测NF-κB/MAPK信号通路相关磷酸化蛋白表达量的变化。结果:与正常细胞相比,LPS刺激后,ARPE-19的存活率下降。同时,随着外源性LBP浓度增加,ARPE-19的细胞存活率升高,且细胞内炎性因子IL-1β、IL-6和MCP-1的表达量降低,并伴随NF-κB/MAPK通路的相关磷酸化蛋白(p-p65、p-IκBα、p-JNK、p-ERK及p-p38)的表达下降。结论:枸杞多糖通过抑制胞内炎性因子及NF-κB/MAPK通路相关因子的磷酸化,从而阻止LPS诱导人视网膜色素上皮细胞产生的炎性反应。     

杞精明目汤颗粒剂对肿瘤坏死因子-α刺激下结膜松弛症成纤维细胞MAPK信号通路的影响

目的　观察肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）刺激下,杞精明目汤颗粒剂对结膜松弛症（conjunctivochalasis,CCH）结膜成纤维细胞表达丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）的影响,探讨CCH的发病机制及有效治疗策略。方法　体外培养CCH结膜成纤维细胞,分为CCH组、CCH+TNF-α组及CCH+TNF-α+杞精明目汤组。CCK-8确定杞精明目汤颗粒剂有效浓度,用含10^-2 mg·L^-1的TNF-α刺激培养的成纤维细胞,加入杞精明目汤颗粒剂干预48 h,分别采用ELISA、Western Blot和RT-PCR检测MAPK信号通路相关蛋白及mRNA的表达,并行统计学分析。结果　CCK-8确定杞精明目汤颗粒剂有效浓度为1.61 g·L^-1。三组MAPK信号通路相关分子细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase,ERK）、c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase,JNK）、p38 MAPK及其磷酸化水平的吸光度（A₄₅₀）值总体差异均有统计学意义（均为P<0.05）,且TNF-α可明显上调CCH表达ERK1/2、JNK1/2、p-JNK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK（均为P<0.05）,而杞精明目汤可显著下调TNF-α刺激后的CCH成纤维细胞表达ERK1/2、p-ERK1/2、JNK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK（均为P<0.05）。三组p-ERK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白总体差异均有统计学意义（均为P<0.05）,且TNF-α可明显上调CCH成纤维细胞p-ERK1/2、p-JNK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白的表达（均为P<0.05）,杞精明目汤可显著下调TNF-α刺激后的CCH成纤维细胞表达p-ERK1/2、p38 MAPK（均为P<0.05）。三组ERK1/2、p38 MAPK mRNA表达总体差异均有统计学意义（均为P<0.05）,且TNF-α可明显上调CCH成纤维细胞ERK1/2、p38 MAPK mRNA的表达（均为P<0.05）,杞精明目汤可显著下调TNF-α刺激后的CCH成纤维细胞p38 MAPK mRNA表达（P<0.05）。结论　TNF-α可上调CCH成纤维细胞MAPK信号通路的表达,导致CCH的发生发展,而杞精明目汤颗粒剂在一定程度上可下调MAPK信号通路的表达从而发挥治疗作用。     

高糖对人视网膜色素上皮细胞VEGF及PEDF表达的影响

目的 探讨高糖对人视网膜色素上皮(RPE)细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)及色素上皮源性生长因子(PEDF)的干预作用.方法 采用HRPE细胞株,将细胞分为正常对照组(NG,5.6 mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG,15、20、30 mmol/L葡萄糖)、高渗组(HM,24.4 mmol/L甘露醇+5.6 mmol/L葡萄糖).应用逆转录PCR(RT-PCR)技术检测VEGF及PEDF mRNA的表达.用ELISA技术检测细胞上清液中VEGF蛋白的表达.结果 高糖作用下VEGFmRNA和蛋白表达显著增高,PEDFmRNA的表达受到显著抑制.结论 高糖可从转录水平及蛋白水平诱导HRPE细胞VEGF的表达,并抑制PEDF的表达.     

氧化损伤对体外培养人视网膜色素上皮细胞PEDF的影响

目的研究氧化损伤对人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞表达色素上皮细胞衍生因子(pigment epithelium derived factor,PEDF)的影响。方法体外培养人RPE细胞,加入浓度为600μmol.L-1H2O2分别作用不同时间(2h、8h、24h),采用免疫细胞化学法检测PEDF蛋白的表达,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测PEDF mRNA。结果免疫细胞化学染色对照组即有PEDF的阳性表达,而氧化损伤2h、8h、24h PEDF蛋白阳性表达量逐渐减少,染色由棕黄色变为黄色。各时间段两组结果比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测PEDF mRNA量与PEDF蛋白表达变化一致。结论氧化损伤能促使人RPE细胞PEDF表达下调,并在一定范围内与作用时间有关。     

金黄色葡萄球菌培养上清液对中性粒细胞及RPE细胞炎性相关因子表达的影响

目的 观察金黄色葡萄球菌培养上清液对中性粒细胞及视网膜色素上皮细胞(RPE)炎性相关因子IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平的变化.方法 实验研究.分离入外周血中性粒细胞,与人RPE细胞株D407共培养,加入无菌体的金黄色葡萄球菌ATCC29213培养上清液.其中细菌上清液分为50μl、100μl、250μl、500μl以及空白组、脑心浸萃液态培养基对照组6组;中性粒细胞数量分为空白组、1 ×104、5 ×104、5×105,4组.在6、12、24、48、72 h等时间点搜集培养液上清,应用酶联免疫吸附试验检测培养液中IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平的变化.结果 当不同剂量金黄色葡萄球菌上清液单独作用RPE细胞时,培养液中IL-1β水平随着细菌上清液剂量增加而上升、亦随着作用时间的延长而增加;但IL-6水平500μl组高于空白组,仅在24h[(23.17±3.16)ng/L;(7.61±1.53) ng/L]及48 h[ (35.00 ±4.37) ng/L;(13.17±3.27)ng/L]时差异具有统计学意义(P =0.001;P =0.026).RPE细胞在100μl细菌上清液作用下,加入不同数量中性粒细胞共培养,5×105组培养液中IL-1β水平在6 h[ (236.62±8.20) ng/L]及12 h[ (447.42±35.13)ng/L]均高于其余各组,差异具有统计学意义(6 h:P =0.000,P=0.000,P=0.002;12 h:P =0.000,P=0.000,P=0.000);培养液中IL-6的水平在12 h时5×105组[( 46.96±2.72) ng/L]亦高于其余各组,差异具有统计学意义(P =0.000,P=0.000,P=0.000).在各时间点培养液中均检测不到明显的TNF-α表达.结论 中性粒细胞及RPE细胞共培养体系在金黄色葡萄球菌上清液的刺激下可检测到IL-1β和IL-6表达;其中IL-1β表达在早期出现,且高水平状态维持较长.金黄色葡萄球菌的毒力因子含量及中性粒细胞数量对引发IL-1β和IL-6的高表达起重要作用.     

白皮杉醇对青光眼大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的 观察白皮杉醇对青光眼大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的保护作用并探讨其可能的机制.方法 将40只大鼠随机分为对照组、模型组、白皮杉醇低剂量组和白皮杉醇高剂量组.采用光凝法建立青光眼大鼠模型,白皮杉醇低、高剂量组分别给予100 mg·kg-和200 mg·kg-1白皮杉醇灌胃.测量各组大鼠眼压;荧光金逆行标记各组大鼠RGCs并计数;HE染色观察各组大鼠视网膜组织病理形态;免疫印迹法检测各组大鼠视网膜组织中磷酸化原癌基因蛋白Jun(proto oncogene protein Jun,c-Jun)氨基末端激酶(phosphorylation c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)、磷酸化c-Jun(phosphorylation c-jun,p-c-Jun)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phosphorylation extracellular regulated protein kinases,p-ERK)、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶p38 (phosphorylation mitogen activated protein kinases p38,p-p38 MAPK)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)蛋白表达.结果 模型组眼压、p-JNK、p-c-Jun、p-ERK、p-p38 MAPK和TNF-α蛋白表达均显著高于对照组(均为P＜0.05),RGCs低于对照组(P＜0.05),视网膜组织结构可见空泡和水肿样改变.与模型组相比,白皮杉醇低剂量组和白皮杉醇高剂量组大鼠RGCs显著增多(P =0.003、P=0.002),视网膜组织水肿和空泡样状况改善,p-JNK、p-c-Jun、p-ERK、p-p38 MAPK和TNF-α蛋白表达明显减少(均为P＜0.05),且高剂量组的改善作用更为显著.结论 白皮杉醇具有保护青光眼大鼠RGCs的作用,其作用机制可能与抑制MARK信号通路有关.     

细胞因子对人视网膜色素上皮细胞syndecan-1表达的影响

目的 检测细胞因子对人视网膜色素上皮（RPE）细胞syndecan-1表达的影响，并探讨其作用的信号转导途径。 方法 体外培养人RPE细胞，采用逆转录聚合酶链反应和免疫荧光法检测正常细胞syndecan-1 mRNA、蛋白的表达；免疫荧光法定性、定量观察不同刺激因子作用下syndecan-1的表达变化，包括：7、35 ng/ml肿瘤坏死因子(TNF)-α刺激24 h，1、6 μg/ml脂多糖（LPS）刺激11 h, 7 ng/ml TNF-α刺激不同时间（0～24 h，每2 h为1个时间点，共13个时间点)，30%单核/巨噬细胞株（THP-1细胞）上清液刺激3、14、43 h；细胞外信号调节激酶(ERK)1/2通路特异性阻断剂PD098059预处理2 h后对30% THP-1细胞上清液作用的调节；30% THP-1细胞上清液刺激细胞3 h后0.25%胰酶作用5 min，噻唑蓝法检测细胞贴壁情况。 结果 在正常RPE细胞中可检测到syndecan-1 mRNA和蛋白的表达；未受刺激的RPE细胞细胞膜、细胞浆及核仁呈强的黄绿色荧光，细胞核呈浅绿色荧光；随TNF-α、LPS浓度及时间增加，荧光强度呈减弱趋势(P<0.01); 30% THP-1细胞上清液刺激后细胞荧光强度明显减弱(P<0.001)。50 μmol/L PD098059预处理2 h后可部分阻断30% THP-1细胞上清液的下调作用。与对照组相比，THP-1细胞上清液作用3 h后贴壁细胞数下降（P<0.05）。 结论 TNF-α和LPS可下调体外培养的人RPE细胞syndecan-1的表达；30% THP-1细胞上清液可下调RPE细胞syndecan-1的表达、促使细胞脱壁，且该作用至少通过了ERK 1/2信号转导通路。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 113-116)     

姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞中核因子-κB相关炎性因子表达的抑制作用

背景 白细胞介素-1β(IL-1β)是增生性玻璃体视网膜病变(PVR)早期释放的重要炎性因子,研究证实姜黄素能抑制IL-1β诱导的兔视网膜色素上皮(RPE)细胞的增生,但其是否能够对PVR发挥抗炎作用尚不清楚. 目的 观察姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞移行的影响,探讨姜黄素对IL-1β诱导的RPE细胞中炎性因子表达的影响.方法 采用对数生长期原代培养的第4代兔RPE细胞进行实验,在无血清DMEM培养基中分别添加0、0.1、1.0和10.0 μg/L的IL-1β作用于细胞24 h,分别采用Western blot和逆转录PCR法检测细胞中环氧合酶-2(COX-2)蛋白和mRNA的表达以筛选IL-1β最佳质量浓度.将培养的RPE细胞分为IL-1β组和姜黄素+IL-1β组,分别在无血清培养基中添加1.0 μg/L IL-1β和1.0μg/L IL-1β联合10 μg/ml姜黄素作用于细胞24、48和72 h,仅用无血清培养基培养的细胞作为对照组.培养的细胞行苏木精-伊红染色,于光学显微镜下计算进入损伤区的细胞数,比较各组细胞的移行能力;分别采用Western blot法和逆转录PCR法检测各组RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量,采用Western blot法检测并比较各组细胞中核因子-κBp65(NF-κBp65)蛋白和核因子κB抑制蛋白-α(IκB-α)的相对表达量;采用免疫化学染色法检测NF-κBp65、IκB-α和COX-2在各组RPE细胞中的表达和定位. 结果 初分离的兔RPE细胞呈球形,细胞中可见大量黑色素颗粒;第4代细胞色素颗粒明显减少,接近融合的细胞形态为长梭形,呈拉网状分布.免疫细胞化学染色法结果显示,细胞角蛋白(AE1/AE3)在细胞质呈阳性表达.对照组在培养24、48和72 h移行的细胞数分别为(31.93±1.21)、(36.27±2.50)和(38.33±2.40)个,IL-1β组分别为(45.73±2.30)、(71.13±1.92)和(80.60±1.71)个,而姜黄素+IL-1β组分别为(13.13±2.20)、(14.93±1.10)和(12.60±1.51)个,各时间点IL-1β组细胞移行细胞数均明显高于对照组,而姜黄素+IL-1β组移行细胞数均明显低于对照组和IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β质量浓度为1.0 μg/L时,RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量达峰,以1.0 μg/L IL-1β的剂量进行后续实验.细胞培养后24、48和72 h,姜黄素+IL-1β组细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量均明显低于IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β作用于细胞后48 h,细胞中NF-κBp65蛋白的相对表达量最高,与IL-1β组相比,各时间点姜黄素+IL-1β组细胞中NF-κBp65蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β组药物作用于细胞后48 h细胞中IκB-α降至最低,各时间点姜黄素+IL-1β组细胞中IκB-α值均明显高于IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).免疫细胞染色结果显示,IL-1β组RPE细胞的细胞核及细胞质中NF-κBp65呈强阳性表达,对照组表达较弱,姜黄素+ IL-1β组细胞中NF-κBp65的表达强度较IL-1β组明显降低;与对照组相比,IL-1β组细胞的细胞质中IκB-α表达强度明显减弱,而COX-2表达明显增强;与IL-1β组比较,姜黄素+IL-1β组细胞中IκB-α表达明显增强,而COX-2表达明显减弱.结论 姜黄素可抑制IL-1β引起的兔RPE细胞的移行,IL-1β通过激活NF-κB信号通路刺激细胞中COX-2的表达,姜黄素可通过阻断这一途径而抑制炎性因子的表达,从而发挥抗炎作用.     

二十二碳六烯酸对人视网膜色素上皮细胞中血红素氧合酶-1表达的诱导作用

背景 氧化应激是年龄相关性黄斑变性发生的重要机制.研究表明,二十二碳六烯酸(DHA)在视网膜光感受细胞的发育中发挥重要作用,并可上调血红素氧合酶1(HO-1)的表达,从而发挥抗氧化效应,但DHA是否能影响人视网膜色素上皮(RPE)细胞表达HO-1尚未阐明. 目的 观察DHA对体外培养的RPE中HO-1表达的影响及其分子机制. 方法 对人RPE细胞系ARPE-19进行培养,分别用30、50、100和120 μmol/L DHA作用4～24 h,以不含DHA培养的细胞作为对照组.采用乳酸脱氢酶(LDH)法检测DHA对细胞的毒性;分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测各组细胞中HO-1 mRNA及其蛋白的相对表达;采用比色法分析各组细胞中HO-1酶活性变化情况;采用荧光探针H2DCFDA检测细胞中活性氧簇(ROS)的相对比例,并采用免疫荧光技术检测各组培养细胞中核转录因子-E2相关因子2(Nrf2)的核转位情况;分别采用ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)干预法和Nrf2小干扰RNA(siRNA)转染法作用于培养的细胞,采用Western blot法检测细胞中Nrf2蛋白的表达,并观察其对细胞中HO-1蛋白表达量的影响. 结果 0、30、50、100和120 μmol/L DHA作用于ARPE-19细胞后24 h,培养上清液中LDH漏出率的总体比较差异有统计学意义(F=8.14,P＜0.05),其中120 μmol/L DHA作用后细胞中LDH漏出率明显高于0、30、50、100 μmol/L DHA组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).不同浓度DHA作用ARPE-19细胞后8h,HO-1mRNA及其蛋白的相对表达量以及HO-1的酶活性总体比较差异均有统计学意义(F=16.24,P＜0.05;F=11.34,P＜0.05;F=11.81,P＜0.05),其中30、50、100 μmol/L DHA组细胞中HO-1 mRNA及其蛋白的相对表达量以及HO-1的酶活性均明显高于0μmol/L DHA组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).不同浓度DHA作用ARPE-19细胞后4h细胞内ROS相对荧光强度、细胞核Nrf2阳性细胞比例的总体比较差异均有统计学意义(F=11.08,P＜0.05;F=16.42,P＜0.05),其中30、50和100μmol/L DHA组细胞中ROS相对荧光强度、细胞核Nrf2阳性细胞比例均明显高于0μmol/L DHA组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).100 μ.mol/L DHA处理条件下,NAC预处理后细胞中HO-1蛋白的相对表达量和细胞核Nrf2阳性细胞比例均明显低于单纯100μmol/L DHA组,Nrf2 siRNA转染组细胞中HO-1的相对表达量和细胞核Nrf2阳性细胞比例均明显低于空白siRNA转染组,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 低于100 μmol/L的DHA可能通过ROS/Nrf2途径诱导RPE细胞表达HO-1,从而发挥对细胞的保护作用.     

The role of Bcl-xL in mouse RPE cell survival

PURPOSE. Retinal pigment epithelial (RPE) cell survival plays a critical role in normal physiology and in retinal diseases, such as age-related macular degeneration (AMD) and proliferative vitreoretinopathy (PVR). We have previously demonstrated that Bcl-x(L) is an important cell survival protein in human RPE (hRPE) cells. Herein, we determined the role of Bcl-x(L) as a survival protein in mouse RPE (mRPE) cells. METHODS. Survival factor gene expression and Bcl-x(L) protein distribution were determined using qRT-PCR and immunohistochemistry, respectively. Cultured mRPE cells were transfected with two modified 2'-O-methoxyethoxy antisense oligonucleotides (ASOs): Bcl-x(L)-mismatched control and Bcl-x(L)-specific. Bcl-x(L) protein levels were analyzed using Western blot. To determine the effects of survival factor regulation in mRPE cells, cultured cells were treated for 24 hours with mouse TNF-α, human IL-1β, and human TNF-α. RESULTS. Bcl-x(L) was the most highly expressed survival factor in both mouse eyecup and cultured mRPE cells, whereas Bax was the most highly expressed antisurvival factor. Bcl-x(L) was expressed in the RPE layer, and the distribution among the retinal layers was similar to that observed in human eyecups. IL-1β and TNF-α had minimal effect on Bcl-x(L) and Bax expression and strongly upregulated Traf-1. Transfection with Bcl-x(L)-specific ASO resulted in markedly diminished Bcl-x(L) gene expression, Bcl-x(L) protein levels, and cell number. CONCLUSIONS. Bcl-x(L) is the most highly expressed survival gene in mRPE cells and is essential for mRPE cell survival. Our data suggest that mouse tissue is an appropriate model for investigations of RPE survival factor genes.     

shRNA抑制人RPE细胞中HIF-1α表达下调后IGF-1对VEGF表达的影响

背景 增生性玻璃体视网膜疾病(PVD)是一组眼底视网膜血管性疾病,主要由视网膜色素上皮( RPE)细胞增生所致,胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和血管内皮生长因子(VEGF)与RPE细胞的异常增生和病理性新生血管生成有关,但其信号机制及功能尚不完全明了. 目的 探讨利用小发卡环核糖核酸( shRNA)使人RPE细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)基因沉默后,IGF-1对VEGF表达的影响. 方法 收集健康男性供体眼球4只,分离、收集、培养RPE细胞,用SABC法行抗人角蛋白免疫细胞化学染色进行鉴定.用体外转录法合成针对HIF-1α mRNA序列靶点的shRNA,对3～5代RPE细胞的HIF-1α进行干扰后再经50 μg/L IGF-1处理24 h,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测人RPE细胞中HIF-1α及VEGF mRNA的表达,采用Western blot法检测人RPE细胞中HIF-1α及VEGF蛋白的水平.结果 分离培养的细胞呈扁平不规则多角形,97％的细胞对人角蛋白呈阳性反应.50 μg/L IGF-1作用后,人RPE细胞HIF-1α mRNA表达量(1.49±0.18)与0 μg/L IGF-1组(1.46±0.17)比较差异无统计学意义(t=0.335,P=0.743),而HIF-1α蛋白表达量(1049.86±172.54 vs 0.00±0.00)、VEGF mRNA(0.95±0.15 vs 0.35±0.07)及VEGF蛋白(391.98±56.77 vs 214.36±37.15)表达量均明显增高,差异均有统计学意义(t=16.098、9.935、6.928,P＜0.05).shRNA干扰HIF-1α mRNA表达后,RNAi转染组HIF-1α、VEGF mRNA及其蛋白水平较RNAi空白对照组及RNAi-C转染组明显下降,3个组间各指标的总体比较差异均有统计学意义(F=68.679、89.904、21.770、6.205,P＜0.05). 结论 IGF-1可通过促进人RPE细胞中HIF-1α蛋白的累积诱导VEGF的表达,是导致PVD重要的细胞因子之一.     

内质网应激对光照诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的促进作用

背景 视网膜色素上皮(RPE)细胞的光损伤模型是多种视网膜变性类疾病的研究工具,光诱导RPE细胞损伤的主要病理基础是凋亡及炎症反应,但是内质网应激(ERS)反应是否参与其病理机制的研究国内外少有报道. 目的 探讨ERS对光损伤诱导的人RPE细胞凋亡的作用及其机制.方法 体外培养人RPE细胞株(ARPE-19),将培养的细胞分为正常对照组及光照3、6、12和24 h组,各光照组在培养箱内以(2 000± 500) lx的白色荧光灯光照细胞建立光损伤模型,正常对照组细胞在暗环境中培养且不给予光照射,筛选实验最适光照时间.将细胞分为正常对照组、光照组(光照12h)和苯基丁酸(4-PBA)预处理+光照组,4-PBA预处理+光照组先用ERS抑制剂4-PBA培养细胞30 min,然后光照细胞12h.采用流式细胞仪检测各组人RPE细胞的凋亡率和细胞内活性氧(ROS)的荧光强度;采用ELISA法检测各组细胞上清液中炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)质量浓度;分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测人RPE细胞中ERS标志物活化转录因子-6(ATF-6)、C/增强结合蛋白同源蛋白(CHOP)和细胞凋亡标志物半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(caspase-12) mRNA及其蛋白的表达. 结果 光照后细胞形态呈长梭形改变,边界不清,细胞质脱颗粒,细胞碎片增多,且随光照时间的延长而加重.流式细胞仪检测发现,随光照时间的延长,人RPE细胞内ROS含量逐渐增加,细胞凋亡率逐渐升高,差异均有统计学意义(F=763.00、119.30,均P＜0.01).ELISA法检测发现,与正常对照组比较,光照后6h细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显升高,12h达峰.实时荧光定量PCR和Western blot检测显示,与正常对照组比较,光照后人RPE细胞中ATF-6、CHOP和caspase-12 mRNA及其蛋白的相对表达量均明显升高,均于光照后12h达峰或升高,故选择光照12 h为最适光照时间作为后续研究.4-PBA预处理+光照组细胞中ATF-6、CHOP和caspase-12 mRNA的相对表达量均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=281.69、473.88、308.45,均P＜0.01);ATF-6、CHOP和caspase-12蛋白的相对表达量均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=47.86、57.93、106.59,均P＜0.01);细胞凋亡率、细胞上清液中IL-1β和TNF-α质量浓度均明显低于光照组,差异均有统计学意义(F=88.64、245.47、101.01,均P＜0.01). 结论 (2 000±500)lx的光照可诱导人RPE细胞内ROS增加,并激活细胞的ERS反应,导致RPE细胞凋亡及炎症反应.ERS抑制剂4-PBA可抑制光损伤导致的ERS反应,进而降低RPE细胞凋亡率并抑制炎症反应过程.     

二甲双胍对炎症状态下人视网膜血管内皮细胞生物学行为的保护作用及其机制

背景 研究表明炎性过程参与糖尿病视网膜病变(DR)的发生和发展,而炎症作用的靶细胞为视网膜血管内皮细胞(RVECs).二甲双胍是临床上常用的降血糖药物,近年来表明其可发挥保护心血管、预防肿瘤和保护血-脑屏障等多重生物学效应,但其对炎症状态诱导的人视网膜血管系统异常是否具有防护作用尚不清楚. 目的 观察二甲双胍对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激下人视网膜血管内皮细胞(RVECs)增生、移行以及分泌单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和白细胞介素-8(IL-8)的影响,探讨二甲双胍对炎症环境中人RVECs生物学行为的保护作用. 方法 对原代RVECs进行培养和传代并分为正常对照组、5 mmol/L二甲双胍组、TNF-α(2.5 ng/ml)组、TNF-α+不同浓度(5、10、20、40 mmol/L)二甲双胍组,分别按照分组方法在培养液中添加相应药物处理24 h.分别于处理前及处理后24 h采用Image-Pro Plus Software 7.0软件计数各组细胞数目;采用MTS法检测各组RVECs的吸光度(A490)值以评价细胞的代谢活力;采用Transwell小室法检测各组迁移细胞数;采用ELISA法检测各组细胞上清液中MCP-1和IL-8质量浓度,并对各组间检测结果进行比较. 结果 正常对照组、5 mmol/L二甲双胍组、TNF-α组、TNF-α+5 mmol/L二甲双胍组、TNF-α+10 mmol/L二甲双胍组、TNF-α +20 mmol/L二甲双胍组和TNF-α+40 mmol/L二甲双胍组细胞数目总体比较差异有统计学意义(F=189.31,P＜0.01);各组细胞代谢活力(A490值)分别为0.32+0.02、0.32±0.03、0.97±0.02、0.90土0.05、0.76±0.15、0.74±0.05和0.41±0.03;各组细胞移行数目分别为(1 214±49)、(1 200±45)、(1 648±43)、(1 309±48)、(1 279±73)、(961±60)和(942±106)/视野;各组细胞上清液中MCP-1质量浓度分别为(0.385±0.050)、(0.362±0.060)、(2.285±0.200)、(1.131±0.180)、(0.622±0.120)、(0.537±0.090)和(0.492±0.130) μg/ml,IL-8质量浓度分别为(0.385±0.080)、(0.390±0.120)、(1.123±0.130)、(0.899±0.180)、(0.680+0.060)、(0.417±0.090)和(0.335±0.100) μg/ml,组间A490值、移行细胞数、MCP-1质量浓度和IL-8质量浓度的总体比较差异均有统计学意义差异(F=73.31、103.89、150.92、268.32,均P＜0.01),TNF-α组细胞数目、4490值、移行细胞数、MCP-1质量浓度和IL-8质量浓度均明显高于正常对照组,TNF-α+ 10 mmol/L二甲双胍组、TNF-α+20 mmol/L二甲双胍组、TNF-α+40 mmol/L二甲双胍组细胞数目、A490值、移行细胞数、MCP-1质量浓度和IL-8质量浓度均明显低于TNF-α组,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 二甲双胍对TNF-α诱导的人RVECs增生、移行及分泌MCP-1、IL-8的能力均有抑制作用,从而可能对炎症环境中的RVECs发挥保护作用.