| 过表达NICD通过下调基因JunB的表达抑制BMP9 |
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| 作者姓名： | 王南 谭涛 林端阳 罗小辑 |
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| 作者单位： | 1.重庆医科大学第一临床学院,重庆,400016;2.重庆医科大学附属第一医院骨科,重庆,400016 |
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| 摘 要： | 目的：研究Notch信号通路在骨形态发生蛋白9（bonemorphogeneticprotein9,BMP9）诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化过程中的作用及其机制。方法：将细胞分为5组：空白组（Blank,n=3）,BMP9处理组（BMP9,n=3）,空白质粒对照组（BMP9+Control,n=3）,过表达Notch1胞内段质粒（Notch1intracellulardomain,NICD）处理组（BMP9+NICD,n=3）,DAPT处理组（BMP+DAPT,n=3）。通过碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,ALP）染色和钙盐染色分别验证过表达NICD对成骨分化早晚期情况的影响。进一步采用定量逆转录PCR（quantitativereal-timepolymerasechainreaction,qRT-RCR）和Westernblot检测基因NICD、Hey1及成骨相关基因Smad-1/5/8、p-Smad-1/5/8、OPN、Runx2、OCN、JunB的表达。结果：早期ALP活性及染色结果显示,NICD组较Control组能显著抑制C3H10T1/2细胞成骨分化过程中ALP的形成[5d：（33167.66±2018.45）vs.（146451.00±14889.67）,P=0.000;7d：（58981.33±4724.70）vs.（89588.66±5928.32）,P=0.000],γ-分泌酶抑制剂（N-[N-（3,5-difluorophen-acetyl）-L-alanyl]-S-phenylglycinet-butylester,DAPT）完全抑制Notch通路时得到相同的结果[5d：（44812.66±4174.94）vs.（146451.00±14889.67）,P=0.000;7d：（64622.93±4724.70）vs.（89588.66±5928.32）,P=0.000]。茜素红S染色结果显示,NCID抑制钙盐结节的形成,而DAPT阻断Notch通路明显促进钙盐结节形成。qRT-PCR结果表明,NCID组中NICD及靶基因Hey1的表达较Control组明显增加[（3.90±0.02）vs.（0.35±0.01）,P=0.000;（19.79±0.01）vs.（11.80±0.02）,P=0.000],Westernblot得到相同结果[（1.32±0.01）vs.（0.19±0.01）,P=0.000],且NICD明显抑制成骨分化相关基因JunB、Runx2、OCN、OPN等的表达[（0.10±0.01）vs.（0.53±0.01）,P=0.000;（0.18±0.01）vs.（0.30±0.02）,P=0.000;（0.36±0.01）vs.（0.62±0.02）,P=0.000;（0.07±0.01）vs.（0.48±0.01）,P=0.000],而转录因子Smad-1/5/8、p-Smad-1/5/8的表达不受影响[（0.74±0.02）vs.（0.73±0.03）,P=0.000;（0.63±0.01）vs.（0.58±0.04）,P=0.000],DAPT阻断Notch通路后上述相关基因的表达明显增加。结论：本实验结果首次证明,NICD激活Notch通路对BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化的抑制作用可能是通过抑制JunB基因发挥作用,而非调控BMP9/Smad（bonemorphogeneticprotein9/drosophilamothersagainstdecapentaplegic）信号通路。
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| 关 键 词： | 骨形态发生蛋白9 Notch信号通路 间充质干细胞 成骨分化 |
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