胃癌是我国常见恶性肿瘤之一，其发生发展与多基因调控改变相关。Notch信号为高度保守的传导机制系统，是介导细胞之间直接接触的主要信号通路之一。Notch1受体属于Notch受体家族，具有调节细胞分化、发育的功能。Jagged1是Notch受体的配体之一，在造血、肌肉形成、神经和血管发生等过程中起重要作用。环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）是一种诱导型酶，参与肿瘤的细胞增殖、抗细胞凋亡和肿瘤血管生成。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）与消化道疾病关系密切，1994年世界卫生组织国际癌症中心（IARC）已将其列为Ⅰ类致癌因子。本研究观察了Notch1、Jagged1及COX-2蛋白在胃癌、癌旁组织及正常胃黏膜组织中的表达状况，通过分析其与临床病理学特征及Hp感染的关系，进一步探讨胃癌发生发展机制。

1.   材料与方法

1.1   研究对象

选择甘肃省武威肿瘤医院2009年10月-2010年4月间临床资料完整且保存完好的胃癌术后石蜡标本作为研究对象，其中癌组织60例，癌旁组织60例（距癌组织边缘≥6 cm，经HE染色证实均无癌细胞）。60例患者中，男性48例，女性12例，男女比例为4：1；年龄28~73岁，中位年龄55岁。肿瘤直径：≥5 cm 35例， <5 cm 25例。浸润深度：黏膜层（T₁）1例，肌层（T₂）9例，浆膜层（T₃）7例，浆膜外（T₄）43例。病灶部位：胃窦或胃体部36例，胃底或贲门部24例。有淋巴结转移52例，无淋巴结转移8例。按组织分化程度分为：低分化型41例，中分化型14例，高分化型5例。所有患者术前均未接受过放、化疗。20例胃镜活检正常胃黏膜作为对照。符合本院伦理委员会认可。

1.2   方法

1.2.1   Hp感染检测

采用Warthin-starry染色，Hp呈棕黑色微弯曲短杆状，常位于胃黏膜表面或（和）胃小凹及肿瘤性腺腔内，呈散在、密集或成堆分布。无Hp检出者为阴性。

1.2.2   制备组织芯片

在显微镜下选取每个标本的代表性位点，取直径2 mm的组织放入相应大小、间距为1 mm的空白石蜡芯片中。每个芯片左上角均用2个鼠组织定位，4 μm厚连续切片，并敷贴在l%多聚赖氨酸处理的载玻片上，用HE染色作对照观察。

1.2.3   免疫组织化学检测

兔抗人Notch1、Jagged1多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；兔抗人COX-2多克隆抗体购自Bioworld生物公司。即用型免疫组织化学试剂盒（SP-9000）及DAB酶底物显色试剂盒等购自北京中杉金桥公司。免疫组织化学染色按SP试剂盒说明书进行，用已知阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.4   免疫组织化学染色结果评分

免疫组织化学染色阳性结果表现为淡黄色或棕黄色、棕褐色颗粒，Notch1、Jagged1位于细胞质和（或）胞膜，COX-2位于细胞胞质和（或）胞核。按半定量评分方法计算：根据肿瘤细胞的染色范围，阳性细胞数 <5%、5%~ 25%、26%~50%、>50%分别标记为0、1、2、3分；对每张切片阳性细胞的染色强度按无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别标记为0、1、2、3分；根据两项评分之和判断结果，≥3分者为阳性， <3分者为阴性。

1.3   统计学处理

应用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析。计数资料的比较采用χ²检验或Fisher检验；三组间的两两比较采用卡方分割法。等级资料的相关性采用Spearman等级相关分析，P <0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   免疫组织化学检测结果

2.1.1   Notch1、Jagged1及COX-2的表达

Notch1和Jagged1在胃癌（图 1，2）、癌旁、正常胃黏膜中均有表达，定位于细胞质和（或）胞膜，胃癌组中阳性表达率（40.0%，70.0%）低于癌旁组（81.7%，96.7%）和正常组（85.0%，100.0%），三组间有显著性差异（χ²=27.046，P <0.05；χ²=21.311，P <0.05）。COX-2在胃癌（图 3）和癌旁组织中表达，位于细胞质和（或）胞核，在胃癌组中的阳性表达率（60.0%）高于癌旁组（35.0 %）和正常组（0），三组间差异有统计学意义（χ²=23.792，P < 0.05）。胃癌组和癌旁组相比，Notch1、Jagged1和COX-2阳性表达率的差异均有统计学意义（χ²=21.860，P <0.017；χ²=15.360，P <0.017；χ²=7.519，P=0.006）；胃癌组和正常组相比，Notch1、Jagged1和COX-2阳性表达率的差异有统计学意义（χ²=12.158，P <0.017；χ²=6.117，P= 0.013；χ²=21.818，P <0.017）；癌旁组和正常组相比，Notch1和Jagged1阳性表达率的差异均无统计学意义（χ² <0.001，P=1.000；P=1.000），COX-2阳性表达率的差异有统计学意义（χ²=9.492，P=0.002，表 1）。

图  1  Notch1在中分化胃癌组织中的表达（S-P×400）

Figure  1.  Notch1 expression in moderately differentiated gastric carcinoma tissue SP×400

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图  2  中分化胃癌组织中Jagged1的表达（S-P×400）

Figure  2.  Jagged1 expression in moderately differentiated gastric carcinoma tissue SP×400

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图  3  COX-2在高分化胃癌组织中的表达（S-P×400）

Figure  3.  COX-2 expression in well differentiated gastric carcinoma tissue SP×400

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表  1  免疫组织化学检测各组织中Notch1，Jagged1和COX-2蛋白的表达  例（%）

Table  1.  The expression of Notch1, Jagged1 and COX-2 protein in different tissue was examined by immunohistochemitry

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2.1.2   Notch1、Jagged1及COX-2的表达与胃癌临床病理特征的关系

胃癌组织中Notch1和Jagged1的表达与患者性别、年龄、肿瘤直径、病灶部位、肿瘤分化程度、浸润深度及有无淋巴结转移均无相关性（P>0.05）。COX-2的表达水平与胃癌分化程度和浸润深度（χ²= 6.213，P=0.013；χ²=6.125，P=0.013）有关，与性别、年龄、肿瘤直径、病灶部位及有无淋巴结转移无相关性（P>0.05，表 2）。

表  2  胃癌组织中Notch1、Jagged1和COX-2的表达与临床病理特征的关系 例（%）

Table  2.  Correlations of Notch1, Jagged1 and COX-2 protein expression to clinicopathologic features of gastric cancer

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2.1.3   Notch1、Jagged1及COX-2的表达在胃癌中的相关性

Spearman等级相关分析显示Notch1与Jagged1在胃癌中的表达呈正相关（r=0.460，P <0.001）；Notch1与COX-2表达之间呈负相关（r=-0.314，P=0.015）；Jagged1与COX-2表达之间无相关性（r=-0.175，P=0.180）。

2.2   胃癌组织中Notch1、Jagged1及COX-2的表达与Hp感染的关系

Hp在胃癌组阳性感染率（76.6%）低于癌旁组织（91.7%），差异有统计学意义（χ²=6.536，P=0.011）。Notch1、Jagged1及COX-2在Hp感染阳性胃癌组中的阳性表达率与Hp感染阴性胃癌组相比较，差异无统计学意义（χ²=0.062、0.750、0.994，均P>0.05）。胃癌组织中Notch1、Jagged1及COX-2的表达与Hp阳性感染率无相关性（r=0.032、0.155、-0.129，均P>0.05）。

3.   讨论

Notch信号是一种相对保守的细胞间相互作用机制，参与细胞增殖、凋亡和分化等多种生命活动。哺乳动物中有4个Notch受体（Notch1~4），有5个配体（Jagged1、2和Delta-like1、3、4）。Jagged1是Notch受体的主要配体之一。研究发现，Notch信号的异常与多种肿瘤的发生发展密切相关^[1-4]，依据不同的组织或细胞背景表现为促癌或抑癌双重作用。有研究报道Notch1在肿瘤中起促癌作用^[5-6]。但也有研究报道Notch1在肿瘤中起抑癌作用，如在食管鳞状细胞癌中激活的Notch1可诱导癌细胞生长停滞和凋亡^[7]；活化的Notchl信号可抑制人舌鳞状细胞癌体内、外肿瘤细胞的生长，同时伴随细胞G₀~G₁期停滞和凋亡^[8]；过表达Notch1胞内段可使肝癌细胞增殖抑制，同时检测到细胞周期改变和早期的凋亡信号^[9]。Notch1的这种相反作用可能是由于Notch1是在生物进化中高度保守并在多种组织细胞中广泛存在，其信号通路的广泛共享性，导致其功能的复杂多样。关于Notch1信号通路与胃癌的关系目前亦存在争论。

COX-2是花生四烯酸合成前列腺素限速酶的一种亚型，主要在肿瘤和炎症等病理过程被诱导产生。研究表明COX-2通过多种途径影响癌基因的激活和（或）抑癌基因的失活，参与包括胃癌在内的多种肿瘤的发生发展。本研究显示COX-2的表达在正常胃黏膜组织（0）、癌旁（35.0%）及癌组织（60.0%）呈逐渐增高趋势，并且COX-2的表达与胃癌的分化程度和浸润深度有关（P <0.05），提示在胃癌发生的早期阶段COX-2即出现异常，是胃癌发生发展过程中的一个早期分子事件，且COX-2的激活可能参与了胃癌的发生发展。本研究证实了胃癌中存在COX-2的高表达，此结果与国内外研究文献相符。

有研究采用RT-PCR和Western blot方法检测Notch1在人正常胃黏膜细胞株（GES 1）和人胃癌细胞株（AGS、SGC 7901和BGC823）中的表达，结果显示Notch1在各胃癌细胞株的表达均低于GES1（P < 0.05），免疫组织化学法结果显示Notch1的表达在胃癌组（38.9%）低于癌旁组（72.7%），差异有统计学意义（P <0.05）^[10-11]。本研究采用免疫组织化学法结果显示Notch1和Jagged1的表达在胃癌组（40.0%，70.0%）低于癌旁组（81.7%，96.7%）和正常组（85.0%，100.0%），差异有统计学意义（P <0.05），与前述研究结果一致。Jaggedl是Notch受体的主要配体之一，除了能与Notch1结合，还可与Notch2及Notch3结合。本研究显示Notch1与Jagged1在胃癌中的表达呈正相关（P <0.05），提示Notch1和Jagged1在胃癌的发生发展过程中起到协同作用，虽然Notch1与Jagged1的表达量在胃癌组织中呈正相关，但Jagged1配体也可能不是通过Notch1受体起作用；Notch1/Jagged1通路与COX-2在肿瘤的发生发展中起重要作用，但Notch1/ Delta1通路与COX-2在肿瘤中的作用也不可忽视，本研究提示Jagged1与COX-2表达之间无相关性（P>0.05），可能是Notch1/ Delta1与COX-2在胃癌的调控中起主要作用。这些有待进一步行组织、细胞分子水平实验证实。

研究发现，Notch1是一种新的NF-κB的抑制蛋白，Notch1与NF-κB结合后可抑制其活化^[12]。在对宫颈癌的研究中发现，Notch1作为NF-κB上游调控因子，促进HeLa细胞的早期凋亡^[13]。COX-2的启动子序列中含有NF-κB特异结合序列，该序列与NF-κB结合后可以促进COX-2基因的转录^[14]。本研究显示Notch1与Jagged1的表达在胃癌组低于癌旁组及正常组（P <0.05），COX-2的表达在胃癌组高于癌旁组及正常组（P <0.05），并且Notch1与COX-2表达呈负相关（P <0.05），此结果与Yeh等^[15]研究结果不相符，推测可能存在的机制为：胃癌组织中Notch信号通路的下调使NF-κB活化增加，从而导致COX-2高表达，通过此间接途径，COX-2作为Notch1所调控的下游目标基因，引起一系列细胞增殖和凋亡的改变，进而参与胃癌的发生发展。

Hp与消化道疾病关系密切，但Hp的致癌机制至今尚不明确。研究表明胃癌及癌前病变组织中COX-2高表达与Hp感染相关^[16]。本研究显示Hp在胃癌组阳性感染率低于癌旁组（P <0.05）。Notch1、Jagged1及COX-2在胃癌组中Hp感染阳性的阳性表达率与Hp感染阴性相比较差异无统计学意义（P>0.05）。提示Hp感染可能主要作用在胃癌的早期阶段，当进展到胃癌阶段时由于涉及到多种遗传物质的改变，Hp感染对病变进展的作用不再明显，而主要是Notch1、Jagged1及COX-2起作用。对于Hp感染致胃癌的机制是否与Notch1、Jagged1和COX-2相关，有待进一步研究。

目前关于在胃癌中Notch1、Jagged1、COX-2及Hp之间相互关系的研究报道较少，本研究结果提示Notch1与Jagged1低表达可能导致COX-2的高表达，最终导致胃癌的发生发展。综上所述，Notch1、Jagged1、COX-2和Hp均在胃癌的发生发展过程中起重要作用，其作用途径和形式复杂且相互关联，需要进一步研究其作用机制，为胃癌的预防、诊断、治疗和预后判断提供理论依据。