| miR-186过表达慢病毒载体的构建及鉴定 |
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| 作者姓名： | 李胜男 王梦旭 胡伟东 陈少凤 陈杏兰 李友 |
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| 作者单位： | 广东省衰老相关心脑疾病重点实验室,广东湛江,524002;广东医科大学附属医院神经病学研究所,广东湛江,524002 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金资助课题（81571157） |
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| 摘 要： | 目的：构建miR-186过表达慢病毒载体并包装慢病毒,探讨miR-186在人胚胎肾细胞（HEK）293T细胞系中的感染效率和表达水平。方法：以Hsa-miR-186前体序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增pre-miR-186基因序列,并将其克隆到携带EGFP/Puromycin的慢病毒载体FV040中,经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切及测序鉴定后获得重组慢病毒载体。利用Lipofectamine 2000将重组慢病毒质粒FV040 Vector和FV040 miR-186分别与辅助质粒通过共转染至HEK293T细胞中,48 h后收集慢病毒,以FV040 Vector慢病毒作为对照组,FV040 miR-186作为实验组,分别感染HEK293T细胞。感染48 h后,观察HEK293T细胞中绿色荧光的分布情况,并采用实时荧光定量PCR法检测miR-186的表达水平。结果：测序分析,miR-186过表达慢病毒与GenBank上公布的miR-186序列完全一致。与对照组（0.8387±0.1456）比较,实验组HEK 293T细胞中miR-186表达水平（12.6400±0.7884）明显升高（t=14.72,P<0.01）,约为对照组的15.07倍。结论：成功构建miR-186过表达慢病毒载体并包装出慢病毒,miR-186慢病毒成功感染HEK293T细胞,miR-186表达水平在HEK293T细胞中明显升高。
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| 关 键 词： | miR-186 慢病毒 HEK293T细胞 过表达慢病毒载体 绿色荧光蛋白 |
| 收稿时间： | 2018-11-23 |
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