小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及肠道归巢

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.007

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (6): 854-860.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.06.007

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小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及肠道归巢

侯晓琳1，郁卫东2，崔梅花1，何湘君2，梁君1

1北京大学航天临床医学院消化科，北京市 100049；2北京大学人民医院临床分子生物学研究所，北京市 100044

收稿日期:2015-01-13 出版日期:2015-02-05 发布日期:2015-02-05
通讯作者: 崔梅花，主任医师，副教授，硕士生导师，北京大学航天临床医学院消化科，北京市 100049
作者简介:侯晓琳，女，1989年生，山西省运城市人，汉族，北京大学航天临床医学院在读硕士，主要从事干细胞移植、消化系疾病方面的研究。
基金资助:
航天中心医院特色临床医学发展科研项目(YN2013TS03)《间充质干细胞联合内皮祖细胞治疗小鼠溃疡性结肠炎的疗效及机制研究》

Isolation and culture of mouse adipose-derived stem cells and their homing to the intestinal tract

Hou Xiao-lin1, Yu Wei-dong2, Cui Mei-hua1, He Xiang-jun2, Liang Jun1

1Department of Gastroenterology, Peking University Aerospace School of Clinical Medicine, Beijing 100049, China; 2Institute of Clinical Molecular Biology, Peking University People’s Hospital, Beijing 100044, China

Received:2015-01-13 Online:2015-02-05 Published:2015-02-05
Contact: Cui Mei-hua, Chief physician, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Gastroenterology, Peking University Aerospace School of Clinical Medicine, Beijing 100049, China
About author:Hou Xiao-lin, Studying for master’s degree, Department of Gastroenterology, Peking University Aerospace School of Clinical Medicine, Beijing 100049, China
Supported by:
the Clinical Medicine Development Project of Aerospace School of Clinical Medicine, No. YN2013TS03

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂肪来源间充质干细胞因其取材安全、创伤小、易纯化、增殖快等优点而备受关注。
目的：建立一种有效、快速分离培养较高纯度小鼠脂肪间充质干细胞的方法，荧光标记后探索其是否可在体内向肠道归巢。
方法：取小鼠腹股沟及附睾脂肪，用0.1%Ⅰ型胶原酶消化得到单细胞，并与剩余未消化脂肪组织块一起接种，贴壁培养获得脂肪间充质干细胞，通过细胞形态、细胞表型、生长动力学、成骨成脂分化潜能4个方面进行鉴定，并将脂肪间充质干细胞用PKH67标记后经尾静脉注射移植到溃疡性结肠炎模型小鼠体内，观察其向肠道的归巢情况。
结果与结论：脂肪间充质干细胞镜下呈梭形，快速增殖呈漩涡状排列，细胞高表达 CD29、CD44、CD90，不表达CD45。成骨诱导碱性磷酸酶染色显示有黑色颗粒生成，茜素红S染色呈红色结节，成脂诱导油红O染色显示有大量脂滴。细胞生长曲线显示第3-5天为对数增长期，细胞生长活力良好。结肠冰冻切片在荧光显微镜下可见绿色荧光光点，并随时间推移有增加趋势。以上结果表明采用胶原酶消化加组织块贴壁法体外分离培养的脂肪间充质干细胞增殖快、纯度高，可向成骨成脂细胞分化，在体内可向结肠归巢并增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 细胞归巢, 脂肪间充质干细胞, 小鼠, 脂肪组织, 生物学特性, 诱导分化, 分离培养, 溃疡性结肠炎

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived mesenchymal stem cells have gained more and more attention due to their high safety, less invasiveness, easy purification and rapid proliferation.
OBJECTIVE: To isolate and culture adipose-derived mesenchymal stem cells efficiently and rapidly with high purity and then to explore the cell homing to the intestinal tract after fluorescence labeling.
METHODS: Mouse adipose tissue obtained from the groin and epididymis was aseptically isolated and digested with 0.1% collagenase I. Then the digested cells and undigested adipose tissue were cultured together in the dish to harvest adipose-derived mesenchymal stem cells. The cells were identified by morphology, surface markers, growth kinetics, osteogenic and adipogenic differentiation potential, and then labeled by PKH67 before injected into ulcerative colitis mouse models through the tail vein to observe their homing to the intestinal tract.
RESULTS AND CONCLUSION: In vitro, adipose-derived mesenchymal stem cells isolated by this method exhibited spindle-like appearance, grew intensively and arranged in a swirling shape. Adipose-derived mesenchymal stem cells expressed CD29, CD44 and CD90, but not expressed CD45. After osteogenic induction, alkaline phosphatase staining showed black particles and alizarin red S staining showed red mineralized nodules. After adipogenic induction, oil red O staining showed many lipid droplets were dyed red. Cell growth curve showed cells at 3-5 days were in logarithmic growth phase and they were active. Under fluorescence microscopy, frozen sections of the colon were found green fluorescence points that were increased with time. Results suggest that adipose-derived mesenchymal stem cells isolated and cultured in vitro can proliferate rapidly, purify easily and can be induced to osteoblasts and adipocytes; in vivo, PKH67-labeled cells can home to and proliferate in the colon.

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Key words: Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cells, Colitis, Ulcerative

中图分类号:

R394.2

侯晓琳，郁卫东，崔梅花，何湘君，梁君. 小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及肠道归巢[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(6): 854-860.

Hou Xiao-lin, Yu Wei-dong, Cui Mei-hua, He Xiang-jun, Liang Jun. Isolation and culture of mouse adipose-derived stem cells and their homing to the intestinal tract[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(6): 854-860.

图/表（结果） 3

2.1 脂肪间充质干细胞形态脂肪间充质干细胞接种初期贴壁细胞较少，第3天开始逐渐出现数个较大细胞集落且脂肪组织块周围也开始有细胞移行出来，细胞形态以梭形、三角形为主，圆形混杂细胞少见。细胞集落呈漩涡状、辐射状排列并快速增殖、扩大直至集落间相互融合，八九天时细胞铺满皿底(图1)。传代后细胞很快贴壁，生长较原代更快，胞体逐渐增大，均匀分布皿底。

2.2 成骨诱导分化结果成骨诱导后细胞形态逐渐变为多边形，呈聚集生长，诱导7-10 d时碱性磷酸酶染色(钙钴法)可见很多黑色小颗粒，提示细胞碱性磷酸酶活性升高(图2B，C)。此后随着胶原堆积、钙盐沉积，最后可形成不透光矿化结节，茜素红S染色可见细胞大面积着红色，证明细胞已成功向成骨细胞诱导分化(图2D，E)。对照组为正常培养的细胞(图2A)。

2.3 成脂诱导分化结果成脂诱导后可见细胞形态逐渐变得大而不规则，第10天左右油红O染色可见细胞内红色脂滴颗粒出现，证明细胞已成功向成脂细胞诱导分化(图2F，G)。

2.4 脂肪间充质干细胞的生长曲线脂肪间充质干细胞接种后经过一两天的潜伏期，第3天开始进入对数增长期，细胞快速分裂增殖，第5天后细胞生长速度逐渐减缓，进入平台期，细胞数达到高峰，基本不再继续增长(图3)。

2.5 细胞表面标志物表达的鉴定脂肪间充质干细胞经流式细胞仪检测CD29、CD44、CD90(间充质干细胞标志物)，CD45(白细胞标志物)的表达，结果显示脂肪间充质干细胞高表达CD29(99.03%)，CD44(99.57%)，CD90(99.91%)，而CD45的峰与同型对照的峰几乎完全重叠，阳性率为0.28%，说明脂肪间充质干细胞几乎不表达CD45(图4)。

2.6 脂肪间充质干细胞的荧光标记荧光标记的细胞接种1 d后于倒置荧光显微镜下观察，细胞膜着绿色荧光，细胞核不着色(图5A)。锥虫蓝实验检测任意5个视野下拒染细胞占总细胞比例即细胞存活率> 90%，这说明PKH67成功标记了脂肪间充质干细胞。

2.7 小鼠疾病模型建立及脂肪间充质干细胞移植、追踪小鼠给予葡聚糖硫酸钠造模后出现腹泻、血便、体质量下降、结肠明显缩短等类似溃疡性结肠炎表现，并经苏木精-伊红染色病理切片证实溃疡性结肠炎模型建立成功(图6)。倒置荧光显微镜下观察间充质干细胞移植组小鼠肠组织冰冻切片，可见散在分布有绿色荧光光点(图5B1，C1)，以及将组织细胞非特异着色的DAPI蓝色荧光视野(图5B2，C2)，将两视野叠加后，绿色荧光光点可与蓝色光点重叠(图5B3，C3)。对照组冰冻切片仅见微弱的组织自发荧光，无绿色荧光光点。第12天的小鼠肠组织冰冻切片与第8天相比PKH67绿色荧光光点增多。

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引言

间充质干细胞是来自于中胚层的多能干细胞，具有多向分化能力，能进行自我更新复制，可从骨髓^[1]、脂肪^[2]、胎盘^[3]、脐带等多种组织中分离^[4-5]。虽然间充质干细胞起源于中胚层，具有组织特异性，但其不仅能定向分化为所在器官组织中的细胞，还能横向分化为所有3个胚层的细胞，包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、心肌细胞^[6]、神经元样细胞^[7-8]、内皮细胞^[9]、肝细胞等^[10]。

间充质干细胞免疫原性很低，有利于同种异体移植，同时间充质干细胞具有强大的免疫调节功能，它可以抑制细胞毒性T细胞而促进调节性T细胞增殖，抑制多种炎症细胞的增殖、趋化、成熟、抗原呈递等，这提示间充质干细胞对免疫相关性疾病可能有很好疗效^[11-13]。近年来大量研究也已证实其对移植物抗宿主病、系统性红斑狼疮、炎症性肠病等疾病有良好的治疗缓解效果^[14-18]。

为了能获取充足的间充质干细胞，急需建立快速有效的干细胞分离方法。目前常用的细胞来源是骨髓，然而受制于骨髓量少，骨髓间充质干细胞所占比例低^[19]，且多紧贴骨密质，采用常规冲骨髓法会损失部分骨髓间充质干细胞，又因培养过程中常混杂有其他细胞，难于有效、快速纯化。而脂肪间充质干细胞因其取材方便、损伤小，细胞活力好，能快速增殖、纯化等特点而受到越来越多研究人员关注。在功能方面，脂肪来源的间充质干细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的生物学特性^[20-22]，而且其免疫调节功能更强^[23-24]，更适于细胞治疗的基础研究与临床应用，尤其是免疫相关性疾病。

本实验采用胶原酶消化加组织块贴壁法建立了一套较成熟的脂肪间充质干细胞分离培养方法，并对其进行体外生物学功能鉴定和体内向小鼠肠道归巢观察，为后续研究干细胞在溃疡性结肠炎治疗中的作用机制奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学体外观察及动物学体内观察实验。

时间及地点：于2013年9月至2014年9月在北京大学人民医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：健康6-8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠，体质量19-22 g，其中用于细胞培养小鼠4只，用于模型制作小鼠36只，均由华阜康动物有限公司提供，许可证号：SYXK(京)2011-0010，并获得航天中心医院伦理委员会和北京大学人民医院伦理委员会动物伦理委员会审批(编号2013-002)。

小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及肠道归巢实验所用试剂和仪器：
试剂及仪器	来源
低糖DMEM	Hyclone公司
特制胎牛血清、0.25%胰酶、L-谷氨酰胺、青链霉素	Gibco公司
茜素红S，油红O，Ⅰ型胶原酶， PKH67试剂盒，DAPI	Sigma公司
碱性磷酸酶钙钴法染色试剂盒	南京建成生物工程研究所
抗荧光淬灭剂	碧云天生物有限公司
成骨及成脂诱导培养基	深圳百恩维生物科技有限公司
抗小鼠单克隆抗体CD44-FITC、 CD45-FITC、CD29-PE、CD90-PE	BD公司
荧光显微镜	OLYMPUS公司
CM1900冰冻切片机	Leica公司

成骨诱导分化：取第4代脂肪间充质干细胞消化后接种于6孔板中，待细胞生长达到80%左右融合时每孔加入 2 mL成骨诱导分化完全培养基(低糖DMEM，体积分数为10%胎牛血清，10^-7 mol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸，50 μmol/L抗坏血酸)，每隔两三天换液1次，培养至第7-10天将其中3孔细胞按试剂盒说明书进行碱性磷酸酶染色，第14天以后将3孔细胞进行茜素红S染色。对照组的3孔细胞加入等量低糖DMEM完全培养基正常培养。

成脂诱导分化：取第4代脂肪间充质干细胞消化后接种于6孔板中，待细胞生长达到80%左右融合时每孔加入 2 mL成脂诱导分化完全培养基(低糖DMEM，体积分数为10%胎牛血清，10^-6 mol/L地塞米松，0.5 μmol/L 3-异丁基1-甲基黄嘌呤，10 μg/L胰岛素)，每隔两三天换液1次，培养至第10天左右将其中3孔细胞进行油红O染色。对照组的3孔细胞用等量低糖DMEM完全培养基正常培养。

绘制脂肪间充质干细胞的生长曲线：取生长状态良好的第3代脂肪间充质干细胞，胰酶消化后以10⁴/孔的密度接种到24孔板中，每天取3孔细胞消化计数，每孔计数3次，计算均值，连续测定7 d。

细胞表面标志物表达的鉴定：第2代脂肪间充质干细胞生长融合达90%时，胰酶消化细胞，离心并以PBS洗涤 1遍，血细胞计数板计数，每管取10⁶细胞重悬于100 µL PBS中，分别加入流式抗体CD44-FITC，CD45-FITC，CD29-PE，CD90-PE，4 ℃避光孵育1 h，PBS洗去未标记抗体并重悬，应用流式细胞仪进行分析，阴性对照为相应抗体的同型IgG。

脂肪间充质干细胞的荧光标记：消化生长状态良好的第4代脂肪间充质干细胞，PBS洗涤2遍，取约2×10⁷细胞重悬于PBS(少于25 µL)中，并加入1 mL Diluent C。取4 µL PKH67加入已装有1 mL Diluent C的Ep管中，将Ep管中混悬液加入已装有细胞和Diluent C混悬液的离心管中，立即混合均匀3 min后加入等量胎牛血清终止反应，400×g离心10 min，弃上清。细胞以完全培养液洗涤3次，最后用1 mL生理盐水重悬，行锥虫蓝染色，死细胞着蓝色，活细胞拒染，任取5个独立视野计算细胞存活率平均值。同时接种标记后的脂肪间充质干细胞到35 mm培养皿，于第2天荧光显微镜下观察细胞荧光强度。

小鼠溃疡性结肠炎疾病模型建立及脂肪间充质干细胞移植、追踪：C57BL/6J小鼠随机分为3组：正常对照组、间充质干细胞移植组、模型对照组，每组12只。间充质干细胞移植组、模型对照组小鼠自由饮用添加3%葡聚糖硫酸钠(DSS)水5 d，随后饮用正常水7 d以建立溃疡性结肠炎模型，正常对照组小鼠正常饮水。在造模后第2，5天时经小鼠尾静脉注射标记后的0.2 mL(细胞数约2×10⁶)脂肪间充质干细胞，正常对照组、模型对照组小鼠注射等量PBS。造模后第8，12天时分别处死小鼠，立即取材制作肠组织冰冻切片，室温干燥后DAPI复染，滴加抗荧光淬灭剂封固后荧光显微镜下观察。

主要观察指标：①脂肪间充质干细胞形态。②脂肪间充质干细胞成骨及成脂诱导分化情况。③脂肪间充质干细胞生长曲线。④脂肪间充质干细胞表面标志物表达。⑤脂肪间充质干细胞体外荧光标记及肠道冰冻切片荧光标记追踪。

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讨论

小鼠的基因与人类具有高度同源性，是研究多种疾病的理想模型，然而小鼠间充质干细胞的分离与大鼠和其他物种相比要困难得多，并且纯化困难，对血清质量要求高，需较高接种密度，易老化，不易维持较好的状态。目前常采用的间充质干细胞分离方法有全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法和免疫磁珠分选法。全骨髓贴壁法是利用间充质干细胞在低血清培养基中良好的贴壁特性，通过定期换液除去悬浮细胞，从而逐步纯化^[25]。这种方法可以快速有效地分离大鼠、人等来源的间充质干细胞，然而对于小鼠骨髓间充质干细胞，培养过程中容易混有悬浮的造血细胞和成纤维细胞、树突细胞等其他贴壁细胞，通常至少需要传5代以上才能获得纯度较高的间充质干细胞。密度梯度离心法是根据骨髓中各细胞成分密度的不同，分离单个核细胞进行贴壁培养，但分离过程会损失部分骨髓间充质干细胞，且细胞活力及增殖能力差，培养时间长，也易混杂部分贴壁细胞^[26-27]。流式细胞仪分选法和免疫磁珠分选虽然可以获得较高纯度的间充质干细胞，但经济费用高，效率低，且对细胞活力有一定损伤^[28]。

Zuk等^[29]于2001年首次从人的脂肪组织分离出了脂肪间充质干细胞。脂肪间充质干细胞较经典的分离方法是酶消化法，可有效分离培养出较高纯度脂肪间充质干细胞。组织块贴壁法是较传统的分离培养很多种类细胞的方法^[30-31]，近年来一些学者也采用皮肤、脐带组织、脂肪组织块贴壁法分离培养出了间充质干细胞^[32-35]。这两种方法各有优缺点，胶原酶消化时间过长会影响细胞活力，但可短时间内获得高产量细胞，组织块贴壁法所获细胞量小，时间长，但不损伤细胞活力^[36]。本实验将两种方法有机结合起来，在短时间适度消化不损伤细胞活力的同时，把剩余未消化脂肪组织块一起接种，充分利用脂肪组织，在短时间内即可收获大量细胞。

小鼠脂肪组织经胶原酶酶解后会释放脂肪细胞、成纤维细胞和脂肪间充质干细胞，脂肪细胞和成纤维细胞在低糖的DMEM培养基条件下无法生存而脂肪间充质干细胞则可以生长。同时将未消化的组织块一起贴壁培养，组织块内的干细胞在血清中多种细胞因子的刺激下可从组织块中迁移出来，快速增殖。最后，选用适宜间充质干细胞生长的特制胎牛血清释放生长因子刺激脂肪间充质干细胞增殖。实验证明，培养出的脂肪间充质干细胞较骨髓间充质干细胞形态更均一，获得的第2代细胞纯度高，增殖能力强，培养时间短，连续传10代增殖速度未明显减慢。

间充质干细胞目前尚未发现特异性细胞表面标志物，大多数学者都是通过形态学观察、结合多种表面标志物，多向诱导分化潜能来综合鉴定分离培养的间充质干细胞^[37]。对于小鼠间充质干细胞，公认的细胞表型为高表达CD44、CD90、Sca-1、CD29及不表达CD45、CD11b^[38]。作者对所分离培养的脂肪间充质干细胞进行成骨诱导、成脂诱导发现脂肪间充质干细胞具有多向分化潜能，可成功分化为成骨细胞和脂肪细胞。脂肪间充质干细胞经流式细胞仪检测高表达CD29、CD44、CD90，几乎不表达CD45^[39]。该细胞表型符合间充质干细胞表型特征，结合细胞形态为成纤维细胞样，成骨成脂多向分化潜能共同证明了所分离细胞为所需间充质干细胞。

大量文献报道间充质干细胞移植后可非特异性地分布在全身实质器官，如肺、肝、脾、肾等器官，其中肺组织是主要拦截部位。此外，还可特异性地归巢到需要修复的组织中，如心肌梗死的心肌病变部位^[40-41]，急性肝损伤的肝受损部位^[42]，溃疡性结肠炎的结肠炎症部位^[43]，且细胞在靶器官的病变部位聚集明显多于邻近的非病变部位。目前认为，间充质干细胞的归巢机制可能是损伤部位释放细胞因子如基质细胞衍生因子1及其受体CXCR、血管内皮生长因子、集落刺激因子等使间充质干细胞趋化归巢到病变部位，从而发挥修复作用。

间充质干细胞移植入体内后可通过免疫调节功能抑制异常免疫炎症反应，在病变局部还可分化为多种类型细胞，发挥有益作用。Castelo-Branco等^[43]将脂肪间充质干细胞及骨髓间充质干细胞分别移植到实验性结肠炎动物模型后发现结肠炎病变严重程度均明显下降。此外，胶原沉积和上皮细胞凋亡也减少，结肠病变部位肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β含量降低。这充分提示，间充质干细胞可以成为缓解治疗溃疡性结肠炎的潜在理想选择，然而其治疗机制尚未完全阐明，有待进一步深入研究。

DAPI是一种常用的蓝色荧光染料，可与DNA结合从而非特异性地标记细胞核，可在340 nm激发光的作用下发出蓝色荧光。PKH67是一种标记细胞膜的绿色荧光染料，对包括干细胞在内的多种细胞都可达到良好的标记效果^[44]，可在波长为490 nm激发光的作用下发出绿色荧光。虽然在标记的细胞分裂过程中，荧光会均匀分配到子细胞中，荧光强度会因此稍微减弱，但本实验说明PKH67仍在可检测到的范围内，可进行短期追踪。间充质干细胞移植组小鼠肠组织冰冻切片在结肠发现有PKH67标记的绿色荧光细胞，并随时间推移绿色荧光光点有增多趋势，提示PKH67标记的脂肪间充质干细胞能归巢到小鼠肠道并且在肠组织内定植。作者推测，脂肪间充质干细胞可能在小鼠肠道发生了自我增殖以及横向分化为其他类型的细胞，从而在小鼠溃疡性结肠炎的治疗中发挥作用。

综上所述，实验采用脂肪组织消化方法成功分离并培养了小鼠间充质干细胞，具有取材简便、创伤小，细胞增殖速度快，数目多、纯度高等优点。同时分离的细胞能向溃疡性结肠炎模型小鼠的肠道归巢，为进一步研究脂肪间充质干细胞在溃疡性结肠炎治疗中的应用及机制提供了良好的细胞来源和实验基础。

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小鼠脂肪间充质干细胞的分离培养及肠道归巢

Isolation and culture of mouse adipose-derived stem cells and their homing to the intestinal tract

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